专利名称：大规模一次性生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明为用于细胞/组织培养的大规模一次性生物反应器(disposable bioreactor)，具体而言，是用于植物细胞培养的大规模生物反应器。
背景技术：
细胞和组织培养常规用于各种化合物的工业规模生产，这些化合物包括例如激 素、酶、蛋白质、抗原、食品添加剂和天然杀虫剂。目前用于工业规模生产细胞和/或组织培养的技术基于可反复使用的玻璃或不 锈钢生物反应器系统，装配和维护这样的系统花费巨大。在批与批之间需要对所述生物反 应器系统进行清洗和消毒，而在更换产物时需要更加彻底的清洗，因为需要费钱耗时来验 证清洗后的清洁度和残留清洗剂的存在情况。另外，这些类型的工业化生物反应器系统采用复杂昂贵的混合技术，例如，穿过昂贵复杂的无菌密封产生动力的叶轮；某些昂贵的生物反应器包含气升式多部件构造，这些 部件构造设计用于通过使气体鼓泡到生物反应器中提供培养基的混合及气体饱和。然而， 气压、气泡大小和在培养基中产生不合需要的剪切力使得有必要实施复杂的通气技术。另 夕卜，所述生物反应器按照当时需要的最高体积容量设计。因此，当从中试植物生物反应器放 大到大规模生物反应器时，或当出现需要提高超过现有生物反应器的生产容量时，问题就 产生了。目前操作大容量生物反应器的备选方法是将许多玻璃或不锈钢生物反应器较小模 块组合起来，其总体积容量与需要相匹配，同时提供某种程度的增加或降低总容量的弹性。 然而，对若干较小生物反应器的使用增加了成本和维护时间，因此，使用若干较小生物反应 器比使用单个的较大的生物反应器花费更大，劳动强度更大。由于这些限制，在现有技术的生物反应器中培养植物细胞导致其可提取产物(包 括次级代谢物和重组蛋白两种)相对昂贵，它们在商业上无法与由备选生产系统生产的同
等产物竞争。目前，在植物细胞生物反应器中生产的唯一基于培养的重组蛋白药物为用于兽医 上治疗新城疫病毒(Newcastle virus)的市售抗病毒疫苗。然而，除了这种疫苗之外，目 前仅有极少数次级代谢物通过在生物反应器中的细胞培养来生产，例如植物代谢物紫杉醇 (paclitaxel)(泰素(Taxol))和紫草素(Shikonin)。在工业规模上，生物反应器系统传统上采用永久性或半永久性生长室。尽管一次 性生长室在本领域众所周知，但所述生长室通常用于小规模生产体积，例如家庭酿造和试 验性的实验室工作。小规模生物反应器通常采用可在实验室装置中使用的一次性袋。也已经提出了适用于较大体积的一次性生物反应器。在现有技术系统中，以多种 方式解决对培养基搅拌和通气的需要，这种需要对于放大反应器体积更加重要。Applikon Biotechnology (荷兰)和StedimInc.(法国)提供用50升柔性培养袋的单次使用的生物 反应器系统Appliflex ，所述袋经过设计而置于摇动该袋的运动平台上，以便为培养基提 供通气和搅拌。Wave Biotech, LLD (Somerset，新泽西州)提供相似的一次性生物反应器设备，其提供体积高达IOOOL的培养袋，该袋也由运动平台来通气和搅拌。Hyclone Inc. (Logan，犹他州)与Baxter Biosciences联合提供设计用于至多250L的动物细胞培养物 的一次性培养袋(单次使用的生物反应器(Single Use Bioreactor) “SUB”)，该袋设计是 为了对不锈钢生物反应器容器进行改进。由非一次性的叶轮驱动器提供通气和搅拌，该驱 动器与整合到所述培养袋的复杂叶轮单位连接。Hodge等的美国专利申请第2005/0272146 号公开了具有叶轮片(impellor blade)或其它机械混合装置的150升一次性生物反应器。 又一类型的一次性生物反应器具有U形袋，需要起重机样的器械通过往复地提升各侧边使 培养基搅拌和通气。还一解决方法基于柔性的培养袋周围的加压箍带(pressured cuff), 该箍带使得能以有规律的时间间隔膨胀和收缩，提供挤压型的混合运动。
在上述所有系统中，支撑及通气/搅拌系统都使复杂，花费大，容量单一且有限。 因此，尽管所述反应器容器本身可为一次性的并意欲用于单独使用，但使用这些系统需要 昂贵的设备和维护。也已经提出了用空气使培养物搅拌和通气的一次性生物反应器设备，然而，将基 于气泡的通气和混合改用于大的体积是有问题的。很多较小体积的生物反应器用单个进气 口和鼓泡器或其它类型的气泡扩散器来提供充分的通气[参见例如由以色列Osmotec提供 的ζ生物反应器(Agritech Israel，第一期，1997秋天，第19页)]。所述系统的一个缺点 是通过引入极小的空气泡(来自扩散器)来完成通气导致损伤细胞，尤其是在对剪切力特 别敏感的植物细胞培养物情况下。用于药物用途的蛋白质传统上一直在哺乳动物或细菌表达系统中生产。然而，由 于使用例如植物分子生物学系统例如农杆菌(Agrobacterium)方法将基因导入植物及植 物细胞用于大量生产蛋白和肽相对简单，植物细胞技术成为越来越受欢迎的备选蛋白表达 系统(Ma, J. K. C.，Drake, P. Μ. W.，和 Christou，P. (2003) Nature reviews 4，794-805)。植物细胞培养不同于细菌或哺乳动物细胞培养，这不仅仅是在代谢需求方面，而 且因为通常较大的植物细胞对在常规工业生物反应器中的剪切力极度脆弱。因此，在一方 面，在植物细胞培养中提供适当的混合以确保植物细胞培养物各方面足量通气非常重要， 但另一方面，必须以适合于脆弱的植物细胞在培养基中生长的方式来做到这点。因此，为了提供较高的产量和产品的质量以及提高费用效益，不断需要改进用于 一次性细胞/组织培养的现有系统和设备。本发明提供大体积一次性但也可重复使用的生 物反应器，其有效用于生产重组蛋白的多种细胞/细胞培养物，其中业已解决一次性反应 器体积放大所固有的问题。发明简述本发明一方面提供用于培养和收获植物组织和/或细胞的一次性设备，所述设 备包含具有至少400升体积并配置有换气口(gas exchang印ort)和收获口(harvesting port)的非刚性容器，所述换气口和收获口使得所述设备能够连续用于至少两个连续培养 /收获周期，其中所述设备经过设计和构建用于保持适于培养所述植物组织和/或细胞的 氧饱和度和剪切力。本发明另一方面提供用于培养和收获体积大于400升的植物组织和/或植物细 胞的方法，该方法包括(a)提供具有至少400升体积的一次性非刚性的容器，该容器配置 有使得所述设备能够连续用于至少两个连续培养/收获周期的换气口和收获口，其中所述设备经过设计和构建用于保持适于培养所述植物组织和/或细胞的氧饱和度和剪切力；和 (b)经由所述收获口提供接种物；(C)提供无菌培养基和/或无菌添加剂；(d)任选地用外 部光源照明所述容器；和(e)允许所述细胞和/或组织在所述培养基中生长到所需产量。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，通过以下参数的值或值范围的组合 来保持适于培养所述植物组织和/或细胞的所述氧饱和度与所述剪切力a)高度体积比；b)进气压力；c)每横截面积的进气口密度；d)进口通气速率；和e)进口气泡体积。本发明另一方面提供包含用于培养和收获植物组织和/或细胞的一次性设备的 植物细胞培养系统；和适于培养所述植物组织和/或细胞的培养基。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述系统进一步包含在所述培养 基中生长的植物细胞悬浮液或组织培养物。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述植物细胞培养物包含从植物根 获得的植物细胞。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，植物细胞选自被发根农杆菌 (Agrobacterium rihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、生姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细 胞。根据本发明某些实施方案进一步的特征，所述植物细胞为烟草(tobacco)细胞， 更优选烟草(Nicotiana tabaccum)细胞。根据本发明某些实施方案进一步的特征，所述烟草细胞表达人重组乙酰胆碱酯 酶。所述人重组乙酰胆碱酯酶可为乙酰胆碱酯酶-R。所述乙酰胆碱酯酶-R可具有如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。根据本发明某些实施方案进一步的特征，所述烟草细胞包含编码如SEQ ID NO 9 所示的多肽的核酸序列。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述参数值或值范围选自至少一种以下值或值范围 a)约0. 06-约1厘米/升的高度体积比；b)约1巴-5巴的进气压力；c)约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度；d)约0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率；和e)约20立方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述氧饱和度为至少15%体积/ 所述容器中所含的液体体积。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述组合为约0. 06-约1厘米/升 的高度体积比和约1巴_5巴的进气压力。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述组合为约0. 06-约1厘米/升 的高度体积比和约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度。
根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述组合为约0. 06-约1厘米/ 升的高度体积比和约0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述组合为约0. 06-约1厘米/升的高度体积比和约20立方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述组合进一步包含约20立方 毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积这一参数。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述组合进一步包含约1巴-5巴 的进气压力这一参数。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述组合进一步包含约20个进口 / 平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度这一参数。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述组合进一步包含约 0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率这一参数。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述组合包含约0.06-约1厘米/ 升的高度体积比、约1巴_5巴的进气压力、约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米 的进气口 /横截面积密度和约20立方毫升(cubic milliliter)-约1800立方毫升的进口 气泡体积。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述组合为约0. 06-约1厘米/ 升的高度体积比、约1巴_5巴的进气压力、约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米 的进气口 /横截面积密度、约0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率；和 约20立方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述高度体积比为约0. Icm/升-约 0. 5cm/ 升。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述高度体积比为约0.44cm/升。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述进气压为约1. 5巴-约4巴。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述进气压为约1. 5巴-约2. 5巴。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述进气口 /横截面积密度为约 40个/平方米-约60个/平方米。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述进气口 /横截面积密度为55 个/平方米。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述气体冒泡速率为约20升/分 钟-约50升/分钟，更优选30升/分钟。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述进口气泡体积为约300立方毫米。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述一次性容器为透明和/或半透 明。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述容器由选自以下的材料制 成聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和尼龙共聚物、PVC和EVA。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述容器由超过一层的所述材料的层压材料制成。
根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述设备进一步包含用于支撑所述 设备的支承结构。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述支承结构包含具有圆锥形底 部的刚性圆筒结构。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述收获口位于所述容器底端的 底部。 根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述收获口接近所述容器底端的底 部，以至于在每个收获周期结束时，所述含细胞和/或组织的培养基的所述剩余物自动保 留在所述容器的所述底端至所述收获口的下水平之间。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述底端基本上为圆锥形。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述底端为大体上的截头圆锥形。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述容器包含约400升-约30000 升、优选约500升-8000升并优选约1000升的内部可填充体积。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，所述方法进一步包括检查污染物 和/或所述容器中生产的细胞/组织的质量，若发现污染物或生产的细胞/组织质量不好， 则将设备及其内容物丢弃；若未发现污染物，则收获一部分所述含细胞和/或组织的培养基。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，当收获所述部分时，留下含细胞和/ 或组织的培养基的剩余部分在所述容器中，其中所述培养基剩余物用作下一个培养/收获 周期的接种物。根据本发明下述优选实施方案再进一步的特征，所述方法进一步包括提供用于 下一个培养/收获周期的无菌培养基和/或无菌添加剂；和重复生长周期直到发现所述污 染物或所生产的细胞/组织质量不好，此时将设备及其内容物丢弃。根据本发明下述优选实施方案又进一步的特征，其中在至少一个培养/收获周期 始终通过所述换气口连续供应无菌空气。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，在至少一个培养/收获周期期间通 过所述多个进气口脉冲式供应无菌空气。根据本发明下述优选实施方案进一步的特征，所述设备没有用于使培养基混合和 通气的机械装置。本发明通过提供有效用于生产重组蛋白的多种细胞/细胞培养物的大体积一次 性但也可重复使用的生物反应器及其使用方法和系统，成功地解决了目前已知构造的缺
点ο附图简述本文通过引入附图仅以例示的方式阐述本发明。现在对附图进行具体详细的提 及，应该强调的是，所显示的细节是作为例示的方式的，并且仅以阐述性讨论本发明优选实 施方案为目的，介绍它们的原因是为了提供被认为是最有用和最易于理解的对本发明原理 和概念方面的说明。在这一点上，不试图以比基本理解本发明所需要的更详细的方式来显 示本发明结构细节，对附图所进行的说明使本领域技术人员清楚地明白本发明的若干形式是怎样在实践中具体实施。在附图中 图1以侧面剖视图阐明本发明设备的例示性实施方案的主要部件；图2以正视图阐明本发明设备的例示性实施方案的主要部件和例示性支承结构；图3为显示在用大规模一次性生物反应器的植物细胞培养中达到的良好氧饱 和度的柱状图。将胡萝卜细胞接种到不同体积的生物反应器中的培养基中锥形瓶(蓝 色柱)；10升反应器(PX-10，红色柱)；100升反应器(PX-100，白色柱)和400升反应器 (PX-400，橙色柱)，并在各系统的最佳条件下培养3-4天(参见下文材料和方法)。每个反 应器都装备有用于在指出的天数测定O2饱和度[用Fibox 3 (PresensPresision Sensing GmbH)测定 O2]的无菌硅芯片[(货号 SFPST3Y0PSUP (Presens Presision Sensing GmbH)]。 注意在大规模(PX-100和PX-400)生物反应器中优越的O2饱和度水平；图4为显示用大规模一次性生物反应器的优选产量的重组G⑶的蛋白印迹照片。 在PAGE上分离如下文所述制备的(参见材料和方法)来自不同体积的生物反应器的4或 7天细胞培养提取物的5 μ 1粗提物样品，印迹到硝酸纤维素转移膜上，并与特异性兔抗GCD 多克隆抗体反应。通过SuperSignal West Pico化学发光底物显现条带。第1道-具有 鼓泡器的10升反应器；第2道-具有8mm钻孔口(bore opening)的10升反应器；第3 道-从第4天开始加入100 %氧气的10升反应器；第4和5道-第4天的400升反应器；第 6道-第7天的400升反应器；第7和8道-第7天的100升反应器；第9和10道-prG⑶ 标准品25ng。注意与10和100升反应器比较，在大规模一次性生物反应器中G⑶显著更高 的产量；图5a_5b为显示离子交换色谱消除消泡剂_C的RP-HPLC分析。将0. 075 % C型 消泡剂乳液(Dow Coming , Corning，NY)加样到15ml阳离子交换柱(Bio Rad USA)，在 262nm处监测流过样品、洗涤样品和盐梯度(0. 2M NaCl ；1. 2M NaCl ；和含12% EtOH的1. 2M NaCl)洗脱样品，以检测消泡剂-C。图5a显示加样到柱中的溶液中消泡剂-C的检测。图 5b显示流过色谱柱的消泡剂-C的检测。注意到消泡剂-C没有在色谱柱上被保留；图6为显示在大规模一次性生物反应器中生产的G⑶的身份(identity)的 SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE上分离来自400升反应器(第1道，10 μ g)、80升反应器(第 2和3道，分别为10 μ g和20 μ g)的G⑶样品和商业上制备的葡糖脑苷脂酶Cerezyme (IOng 和20ng)(第4和5道，分别为IOyg和20yg)。通过用考马斯蓝染色显现带。第6道为分 子量标记。注意到来自大规模、小规模生物反应器的GCD和市售葡糖脑苷脂酶制备物的电 泳等同性；图7为显示大规模一次性生物反应器中产生的G⑶的身份的蛋白印迹。在 SDS-PAGE上分离来自400升反应器(第1和2道，分别为50ng和IOOng)、80升反应器(第 3和4道，分别为50ng和IOOng)的G⑶样品和商业上制备的葡糖脑苷脂酶Cerezyme (第 5和6道，分别为50ng和IOOng)，印迹到硝酸纤维素转移膜，并与特异性兔抗GCD多克隆抗 体反应。通过SuperSignal West Pico化学发光底物显现条带。注意到来自大规模、小规 模生物反应器的GCD和市售葡糖脑苷脂酶(Cerezyme )制品的电泳和免疫学等同性；图8a_8d显示在大规模一次性生物反应器中生产的葡糖脑苷脂酶的肽作图(胰蛋 白酶消化)。用蛋白酶消化从小规模一次性生物反应器(80升)和大规模一次性生物反应器(400 升)收获的葡糖脑苷脂酶样品，在 RP-HPLC Jupiter 4u Proteo 90A 柱(Phenomenex， 00G-4396-E0)上分离，以产生氨基酸“指纹图谱”，在214nm和280nm处监测各片段。图8a 和8b为在10升生物反应器中产生的葡糖脑苷脂酶的概况(profile) (8a在214nm处检测； 8b在280nm处检测)。图8c和8d为在400升生物反应器中产生的葡糖脑苷脂酶的概况 (图8c在214nm处检测，图8d在280nm处检测)。注意到大规模和小规模一次性生物反应 器中的产物的等同性；
图9a_9b为显示在大规模一次性生物反应器中生产的葡糖脑苷脂酶的RP-HPLC 分析的图。根据下文所详述来纯化收获自大规模一次性生物反应器(400升)的葡糖脑苷 脂酶，在C-4RP-HPLC柱上分析，并在214nm处(图9a)和280nm处(图9b)监测。注意到 prG⑶作为具有64. 12分钟保留时间的单峰出现，与prG⑶标准品(64. 70分钟)相似；图10为显示用大规模一次性生物反应器生产的prG⑶的良好纯度的IEF凝胶照 片。在等电点聚焦凝胶中分离在大规模一次性生物反应器(400升)中生产并在如下文所 述的5个柱纯化过程中纯化的prGCD样品，以及纯化自小规模一次性生物反应器(10升) 的prG⑶样品。第2道-来自大规模，第3个纯化阶段；第3道-来自大规模，第4个纯化 阶段；第4道-来自大规模，第5个纯化阶段；第5道-来自小规模；第1和6道，IEF PI标 准品。注意到来自大规模一次性生物反应器的在所有纯化阶段中的prGCD的等同性和高纯 度水平；图11为显示用大规模一次性生物反应器生产的prG⑶的纯度的蛋白印迹。在 SDS-PAGE上分离来自400升反应器(第1和2道，分别为50ng和IOOng)、80升反应器(第 3和4道，分别为50ng和IOOng)的G⑶样品、商业上制备的葡糖脑苷脂酶Cerezyme (第5和 6道，分别为50ng和IOOng)和胡萝卜宿主蛋白(CHP)(第7和8道，分别为50ng和IOOng), 印迹并与特异性抗CHP多克隆抗体反应。通过SuperSignal West Pico化学发光底物显现 条带。注意到如所有其它prGCD制备物一样，在大规模一次性生物反应器中没有杂质；图12为显示用于为培养基提供通气和混合的多个进气口的本发明例示性一次性 生物反应器的底端和例示性圆锥形刚性支承结构的照片。图13为显示本发明例示性大规模一次性生物反应器的整套装置(bartery)的照 片；图14为显示可重复使用的收获口的本发明例示性生物反应器的照片；图15为显示免疫检测植物表达的人重组AChE的蛋白印迹的照片。用针对人源 AChE的N-末端肽产生的亲和纯化的山羊多克隆抗体(Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)(在AChE-R和AChE-S中一样)，检测按照本发明一个实施方案在大规模一次性生 物反应器中生产的重组人AChE-R(第1-3道)和商业上制备的重组人AChE-S (第4-6道) 的以下量50(第3和7道)、100(第2和6道)和200ng (第1和5道)。第4道为分子量 标准品。在所有样品中明显都有强的抗体结合；图16为按照本发明一个实施方案在大规模一次性生物反应器中生产的植物表达 的人重组AChE-R与市购AChE-S概况比较的Flamingo 非特异性蛋白染色SDS-PAGE凝胶 的照片。如图13分离植物表达的AChE-R(第1-3道)和哺乳动物细胞产生的AChE-S (第 5-7道)，如本文所述用Flamingo 试剂染色凝胶。注意到AChE-R迁移概况符合用抗AChE 抗体免疫测定所检测的AChE-R的迁移概况(上述图13)。另外，图13所示的凝胶上观察到的单个条带表明纯化效率；图17为检测在大规模一次性生物反应器中培养的植物细胞的乙酰胆碱酯酶催化活性的染色Karnovsky测定凝胶。从BY-2细胞中纯化具有催化活性的乙酰胆碱酯酶-R，所 述BY-2细胞收获自根据本发明一个实施方案在400L大规模一次性生物反应器中培养的细 胞的合并批次。在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上在非变性条件下分离纯化自细胞的减少量 的蛋白(第1和4道=200ng;第2和5道=lOOng，第3和6道=50ng)，经洗涤，处理以 显示乙酰胆碱催化活性(Karnovsky染色)。用相应的乙酰胆碱-S的量(第4_6道)作为 对照。在10%不变性聚丙烯酰胺凝胶上在非变性条件下进行AChE-R和AChE-S电泳。凝 胶在4°C下运行，用H2O漂洗3次，并在含硫代乙酰胆碱(0. 5mg/mL ；Sigma)、乙酸钠(65mM， pH6. O ；Sigma)、柠檬酸钠(5mM ；Sigma)、硫酸铜(3mM ；Sigma)和铁氰化钾(0. 5mM ；Riedel De Haen)的缓冲液中搅拌孵育1小时。肉眼检测催化活性。上面的箭头表示AChE-S的四 聚体的迁移。下面的箭头表示AChE单体的迁移。优选实施方案说明本发明为用于培养植物组织或细胞的可重复使用的一次性设备。具体而言，本发 明设备包括具有以下尺寸和气体交换口的非刚性容器所述尺寸和气体交换口经过设计用 于保持适于在400升或更多培养基中培养植物组织或细胞的溶氧浓度和剪切力。所述设备 可用于培养用于从细胞和/或培养基生产来源于植的重组生物学活性物质(例如药物)的 转化植物细胞。本发明还提供使用本发明设备的植物细胞培养系统。参考附图和
可更好地理解本发明原理和运作。在详细解释至少一个本发明实施方案之前，应该理解的是，本发明不限于其在以 下说明中阐述的或通过实施例例述的细节中的应用。本发明能够为其它实施方案或以各种 方式来实行或执行。还应该理解的是，本文采用的措辞和术语用于说明目的，不应该当作限 制。如上所述，使一次性生物反应器放大到大体积需要特殊的解决通气和混合问 题的方法。某些现有技术生物反应器为此目的采用气体。Proulx等的美国专利申请第 2005/0282269号公开了为了提供通气和混合具有多个进气口及内置气体分散器和在进口 处的过滤器的一次性生物反应器，这些部件都置于容器底端。由于过滤器与液体培养基接 触往往会被阻塞并干扰适当的气体供应，所述构造受到限制。没有公开体积容量或尺寸。Cellexus Biosystems，PCC(Cambridge，英国)提供使用气体用于通气和搅拌的另 一个类型的一次性生物反应器。这种生物反应器为柔性袋，其具有沿着设备底端内部固定 或放置的整体鼓泡器，用于导入空气或气体来通气和混合。Cellexus的生物反应器袋按照 独特的不对称几何学来设计，它将大部分袋内流体体积集中在生物反应器上半部分。为了 运作这种设计需要特别设计的支承围栏(Cellmaker Lite )。Gaugler等的美国专利第6，432，698号公开了用于培养线虫类的柔性的一次性培 养袋。该培养袋配备有管形的进气口和扩散器用于培养基的通气和混合。尽管没有付诸实 践，但预想体积达200升。具体的尺寸没有公开。Hodge等的美国专利申请第2005/0272146号公开了具有用于混合的整合叶轮片 的150升一次性生物反应器。已知在生物反应器中由叶轮进行的混合培养基会产生不适于 培养植物细胞的剪切力。
Shaaltiel等美国专利第6，391，683号(其如同在本文中完全提出一样在此引作 参考)公开了一次性培养设备，其包含具有进气口和出气口的非刚性的袋，其设计用于单 次使用或用于多周期培养和收获。该设备通过细调气泡体积和数量来利用空气压力，以使 培养物混合和通气。业已报道用Shaaltiel所述的生物反应器有效培养准确表达多种异 源(哺乳动物和非哺乳动物)的重组蛋白的转化植物细胞(参见美国专利第6，391，683 号、美国专利申请第10/784，295号；国际专利公开PCTW02004/091475、W02005/080544 和TO2006/040761，所有的都如同在本文中完全提出一样在此引作参考)所述。然而， Shaaltiel等在6，691，683中公开了适于较小和中等大小的体积的设计，其限制了在其之 中合成的重组蛋白的产量。
在将本发明付诸于实践时，本发明人设计了由透明或半透膜非刚性的材料构建的 大规模可重复使用的一次性生物反应器。该生物反应器具有以下部分取样口，使得可使用 至少两个连续培养周期；特定的尺寸；和换气口，其以足以使生物反应器中的细胞培养物 混合和通气的方式提供气体，且提供用于使植物细胞在大于400升的体积中有效生长的合 适的溶氧浓度和剪切力。因此，本发明一方面提供用于培养和收获植物组织和/或细胞的一次性设备。本发明设备包括具有至少400升体积的非刚性的容器，其配置有使得设备可连续 用于至少两个连续培养/收获周期的换气口和收获口。尽管本发明设备可用于培养任何类型的细胞或组织，但其被设计为能够以足够大 的规模培养植物细胞和组织。培养基的氧饱和度对于细胞的有效生长和重组蛋白表达至关重要，因此，其对正 确运行生物反应器及其在生产重组细胞产物中的使用很关键。用于植物细胞培养生长的生 物反应器的氧饱和度更加重要，因为植物细胞比起细菌或哺乳动物细胞更加易受氧饱和度 波动的影响(参见Schlatmann等，Biotech. Bioeng.，1995 ；45 :435_39)。此外，植物细胞在 常规生物反应器中对水动力环境敏感，主要可能是由于植物细胞较大、广泛的空泡形成和 聚集方式。因此，在通过将气泡导入容器使培养基通气也提供混合时，必须避免对脆弱植物 细胞有害的剪切力。最近业已证明培养中的植物细胞因响应特有的“亚溶解”应答而对亚 致死量的剪切力敏感，这进而显著限制植物细胞生物反应器的效能(Namdev和Dulop，App. Biochem and Biotech, Part A, Frontiers inBioprocessing,1995)。因此，本发明设备通过采用对决定培养物中的氧饱和度和剪切力至关重要的参数 或参数组合，保持适于在400升或更大体积中培养植物组织和/或细胞的氧饱和度和剪切 力。通过以下值或值范围来保持适于在该设备中培养植物组织和/或细胞的氧饱和 度和剪切力a)高度体积比；b)进气压力；c)进气口 /横截面积密度；d)进口通气速率；和 e)进口气泡体积。高度体积比机械混合法不适用于植物细胞生物反应器，尤其是当处理大体积培 养基时。大规模生物反应器中培养基的通气和混合可通过使气泡穿过培养基的运动来完 成。气泡与培养基接触得越充分，气体交换的可能性就越大，气体在培养基中的混合行为就 越有效。因此，尽管可允许较小体积生物反应器的高度体积比有较大的灵活性，但以大体积 (例如400升或更大)使用的生物反应器设备的高度体积比应该保持在约0. 06-1厘米/升的范围内。可由设备容器的高度(长度)和设备的平均横截面来计算高度体积比。本文所 用设备的体积是高度乘以横截面积。例如，对于具有200厘米高(长)和400L(具有例如平 均约25厘米的半径)体积的生物反应器，高度体积比为200/400或0. 5 ；对于具有300Gm高 和3000L体积的生物反应器，高度体积比为300/3000或0. 1。适用于本发明生物反应器的 高度体积比范围实例为约0. 06-1厘米/升，优选约0. 1-约0. 5，最优选约0. 44厘米/升。此外，应该理解，可用容器的可填充总内体积或用其指定部分来计算高度体积比，所述指定部分的体积为容器的功能上可填充工作内体积，不包括通常在生物反应器流体水 平以上存在的“顶部空间”。进气压力为了提供足够的气体(例如空气或氧气)用于大规模生物反应器的培 养基的混合和通气，在一个或多个进口处的气压需要足以克服生物反应器中液柱的向下压 力，同时避免与形成太多气泡或对植物细胞培养而言大小不适合的气泡有关的剪切力。具 有适于植物细胞培养的高度体积比的大规模本发明生物反应器，比体积更小的生物反应器 需要更大的进气口气压。气压以巴单位来表示，其中1巴为每cm2 100, 000帕斯卡(Pa)或 1，000, 000达因。用于监测的压力计和用于控制一个或多个进气口气压的压力调节器在本 领域众所周知，可到处市购。适于本发明生物反应器的进气压力范围的实例为约1. 5巴-约 4巴范围，更优选约1.5巴-约2. 5巴。进气口 /横截面积密度小体积生物反应器通常限于一个或极少几个进气口，以 给生物反应器容器中培养基的混合和通气提供所需体积的足够的气泡。另一方面，大体积 生物反应器例如本发明设备，需要较大的进气口密度，以克服设备中培养基柱的压力，并达 到所需的进气压力范围，以至于以适用于植物细胞培养的方式提供混合和通气。为了提供 对一个或多个进气口压力的控制并保持气泡大小为最适合用于大体积生物反应器中的培 养基的混合和通气，提供了多个进气口，这些进气口以既定密度安置在设备的一次性非刚 性的容器上。进气口密度以设备容器的每平方米外表面的进气口数量来表示。适用于本发 明生物反应器的进气口密度范围实例为约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米容器 表面。优选地，进气口 /横截面积密度为约40-60个进口 /平方米，更优选55个进口 /平 方米。进口通气速率增加通气(即存在更快速的气体交换)而且具体地为增加氧气通 常都能提高培养中的细胞的生长速率。用于植物细胞培养的较小体积的生物反应器通常在 进气口处以0. 15-0. 3vvm(体积空气/体积培养基/分钟)的通气速率提供空气，且随着体 积增加提高通气速率。然而，在较小的封闭体积(enclosed volume)中和在较大的等效体 积(equivalent volume)内，气泡促进细胞循环的效率是不同的，因此，与具有相同合并体 积的培养基的多个较小体积的通气速率相比，在大体积内需要非成比例的通气速率来促进 空气循环和氧气分布。在将本发明付诸于实践时，本发明人出人意料地发现，不是随着体积增加而成比 例地提高通气速率(vvm)，而是通过在大规模生物反应器中减小通气速率(测量为vvm)范 围，获得改进的效果。适于在大体积生物反应器中培养植物细胞的一个或多个进气口通气 速率范围实例为约0. 05-0. 12vvm，优选约0. 07vvm-约0. lvvm。所述降低通气速率的优点 包括在大体积生物反应器中产量较高和能量效率提高，这在工业规模培养中非常显著。进口气泡体积在大规模反应器中合适的混合器械的重要性不用多说。在某些情况下，尤其是涉及植物细胞的情况下，气泡大小对于生物反应器中细胞的有效培养和生长极为重要。小气泡事实上可损伤植物细胞，不超过20立方毫米的平均气泡体积基本上能克 服这一潜在的问题。因此，连同进气口气压及进气口数目一起，对进气口气泡体积的控制， 对于实现使植物细胞有效生长的培养基的混合和通气很重要。尽管一个或多个进气口递送 的气泡大小可根据设备的使用而变化，但进口气泡体积的合适范围实例为20-超过1800立 方毫米体积，优选约40立方毫米-约1000立方毫米，更优选约100立方毫米-约500立方 毫米，最优选约300立方毫米。在需要较小气泡的情况下，可在进气口使用鼓泡器以减小气 泡大小，但不能低于适于大规模植物细胞生物反应器的大小。因此，本发明一次性生物反应器相对于目前已知设备具有很多优点，包括但不限 于提供大体积培养条件，同时按照本文所述参数保持植物细胞培养物和培养基较好的通 气和非机械混合，从而达到较高产量及较好纯度的所培养的细胞及来源于所述细胞的产 物。图1阐明本发明设备实施方案，在本文中称为设备10。如图1所示，设备10包括用于培养和收获植物组织和/或细胞的容器12。所显示 的容器12部分地充满液体，因此在图1中呈其膨胀(且相对刚性)的状态，然而，应该注意 优选将容器12构建为非刚性的容器(例如由柔性材料构建)。因此，容器12内容物对容器 壁的压力保持容器12的形状。当将其排空或部分填充时，容器12由于其非刚性设计的性 质可能会部分或基本上扁缩。容器12的这一特征有利于在其排空时储存和运输。容器12 具有能容纳约400升-约30000升、更优选约500升-8000升、最优选约600-3000升的内 体积。容器12可具有约0. 06-1厘米/升的典型高度体积比。容器12优选由聚合物构成，聚合物例如有聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和尼龙共聚 物、聚氯乙烯(PVC)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)和乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)。可使用 不同等级、密度和类型的聚合物，例如低密度聚乙烯(LDPE)、极低密度聚乙烯(VLDPE)、超 低密度聚乙烯(ULDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)等等。可通过熔接聚合物片，吹塑熔融 的聚合物，或本领域已知的任何其它标准塑料聚合物制造方法，来构建容器12。在优选的构造中，容器12由若干层一个或多个类型的聚合物的层压材料构成。所 述层压材料可含有2、3、4和多达7、9、15或更多层，这些层可由不同厚度的相似或不同的柔 性材料制成，所述材料和厚度例如按照容器12的流体体积来选择。所述各层可通过复合挤 压制成。可设计层压材料以便为容器内外表面提供特定的光滑或粗糙质地、较大或较小的 拉伸强度、弹性、柔软性、柔韧性、刚度、耐久性、加工性能等等。可选择具有低水平或优选没 有失活动物来源的加工助剂的材料。层压材料中可包含诸如硅石或硅藻土等增滑剂和/或 抗粘连剂，以减少摩擦和/或防止自我粘附。本发明容器12可由设计以给容器提供透明和/或半透膜性质的材料制成，在某些 实施方案中，当光线将损伤细胞或产物时，材料也可为非半透明。本文所用透明定义为清澈 易于传递大部分(但不是所有)光线，而半透明定义为传递某些而不是所有光线。在一个 实施方案中，设备用于培养植物细胞，所述植物细胞不具有光合作用的能力。在另一实施方 案中，其中设备用于培养其它类型的细胞，例如藓类细胞或藻类细胞、具有光合作用能力的 光合细菌可在该设备中培养。优选地，可传递到容器内体积的光的波长适于由生物反应器 中培养的植物细胞的光合作用色素和其它集光色素所利用。光也可为次级代谢物的产生所需，例如酿酒葡萄细胞产生的花色素苷。更优选地，容器12由以下材料设计而成所述材料 使得可由肉眼或仪器(例如分光光度计)观察和/或监测内体积，以至于检测潜在表明培 养状态的培养物和/或培养基的变化(例如颜色、细胞聚集情况、因污染而产生的浊度)。
可以以任何所需外形来制作容器12，优选锥形套筒状外形，其具有经由两侧壁18 连接的顶14和底16 (图1中的圆锥形)，当容器12排空时壁18扁平，而当容器12充满时， 壁18提供基本上是圆筒形的横截面形状。诸如矩形或多边形等其它横截面形状也可适合。应该了解圆筒形最适合细胞培养容器，其始终提供最均勻且不受阻碍的流体流 动，以在混合时具有最低限度的湍流并产生最小的不合乎需要的对植物细胞培养物有害的 剪切力。优选地，底16适当地成形以使沉降最小化。例如，底16可为至少具有一个或多个 向上倾斜壁的大体上的截头圆锥形(如图1所示)。在将本发明付诸于实践时，本发明人发 现该形状用于避免细胞沉降优于圆锥形，细胞沉降可增加衰退和细胞死亡，从而影响培养 物的总存活率。或者，底16可为大体上的圆筒形或备选的凸起状。底16的前述外形使得 气体能够在底16附近供至容器12，以促使容器内容物混合运动，有效使容器中的沉降最小 化。然而，底16在本发明其它实施方案中可为大体上扁平。可通过粘合/熔接两块(形成侧壁18)的合适材料来制成容器12。例如，可将两 片聚合物材料切成近似拉长的矩形，并将一片叠在另一片上。然后以本领域众所周知的方 式将所述片熔融粘结(fusion bonding)在一起，以沿着两个长边的边缘和沿着短端之一的 外周形成接缝，再次平行粘结并朝内移置，以在所述容器的顶14形成接缝。可通过沿着两个倾斜的接缝线熔融粘结所述片剩余的短端，使长边的接缝互相 靠拢，来形成容器的底16。任选地，可通过与长边接缝接近成直角的另一熔接(fusion welding)缝线，在两条倾斜接缝的顶端上方使它们连接。在将两块片熔接在一起之前，可在 对应于用于相应的进口和出口的连接点的位置熔接刚性塑料凸台(boss)(以下进一步阐 述)O也可用柔性聚合材料连续套筒制成容器12，这避免了沿容器长边熔接接缝的需 要，并始终在大部分容器高度上提供连续完整的圆形横截面。使用套筒材料来制作是符合 需要的，因为没有接缝可使得在培养基的通气和混合期间湍流和剪切力最小化。如图1所示，容器12进一步包括收获口 191，用于收获至少一部分含细胞和/或组 织的培养基，藉此使设备10连续用于至少两个连续培养或收获周期，而无需在周期之间进 行清洗、灭菌和/或检测。或者，可经由位于生物反应器底的另外的收获口(1911)来实现 收获，该收获口用于排出所有生物反应器内容物，由此使得能够收获生物反应器的全部培 养物。将含细胞和/或组织的培养基的剩余次要部分作为接种物用于下一个培养和收获周 期，其中可如下所述来提供培养基和/或所需的添加剂。还可将一个或多个收获口 19用于 将最初体积的接种物导入到容器中，以及用于使收获的物质能够流经那里并流出容器外。一个或多个收获口 19包括具有收获进口 22和收获出口 24的收获管20，收获进口 22与容器12的内体积流体相连，收获出口 24位于容器12的外部。或者，所述收获口 19可 由熔接到容器12的单孔构成，该孔在内侧与内体积接触，并有通到容器外侧的出口。收获 管20可由聚合物材料或合金制成，其在本领域众所周知。因为收获经常受到细胞团存在的阻塞，所以优选收获管20制成具有大的内径(例 如在I-IOcm范围内)和/或具有使得可排走阻塞的弹性程度。
根据容器12体积选择一个或多个收获口19的位置，以使培养基及细胞和/或组 织的剩余部分为容器12体积的预定部分(例如5-35% )。收获口 19可位于容器12底附近位置，这使得可收获大部分容器12内容物，同时 保留一部分含细胞和/或组织的培养基用作接种物。作为备选或此外，收获口 1911可位于容器12的底16的更低部位，于是操作者可 任选地手动确保在收获所需部分的培养基及细胞和/或组织后使合适的含细胞和/或组织 的培养基部分能保持在容器12中。在底16的较低部位具有开口 1911使得能够除去所有 或大部分培养基。应该理解，尽管上文将一个或多个收获口 19和1911的所述位置作为备选方案提 出，但可将二者都结合到单个设备10中，为操作者提供可选择的收获口。一个或多个收获口 19进一步包括流量调节器26。流量调节器26可为例如用于调 节物质经由一个或多个收获口 19流进或流出容器12的流量的阀。也可经由无菌连接器调 节流量，该连接器可由耐用的可灭菌材料例如玻璃、不锈钢、刚性塑料等制成。一个或多个 收获口 19还可包括诸如流体捕集器(fluid trap)等防污染装置(未显示)，以防止收获后 无意地将物质引入到容器12中。容器12可包括附加的取样口，其构造与一个或多个收获口 19相似，可位于收获口 19附近。容器12进一步包括用于引入培养基或其它添加剂的任选附加的添加剂进口 51。 在某些实施方案中，添加剂进口 51位于容器12的顶端，与培养基上面的“顶部空间”相连。 在其它实施方案中，添加剂进口 51位于接近容器12的中部或底端。在其它实施方案中，添 加剂进口 51还可包括诸如流体捕集器等防污染装置(未显示)，以防止在添加培养基过程 中或以后无意地将物质引入到容器12中。设备10进一步包括用于使气体通入和排出容器12的换气口。换气口包括至少一 个进气口 28和至少一个排气口 30，前者用于为了植物细胞培养物的通气和混合使气体(例 如空气、氧气或其它气体)穿过培养基，后者用于排出穿过容器12的内容物(例如培养基 及细胞)的气体。进气口和出气口可装备有本文所详述的过滤器49。在一个实施方案中提 供多个进气口，以更好地分布气压，同时为所需气泡流动提供必需的流入。一个或多个进气口 28可经由一个或多个供气管连接至供气装置(例如泵)。进气口 28可由柔性(例如聚硅氧烷)或刚性材料(例如不锈钢)制成。进气口 28的入气口 34 (入气口 34(1)在位置I对应于进气口 28(1)，入气口 34(11)在位置II对 应于进气口 28 (II))，设计为提供适于使植物培养基通气和混合并防止沉降且不产生不合 乎需要的剪切力的气泡体积，其如上文所述。入气口 34形状可变化(窄的、宽的、锥形的、 圆锥形的、圆形的等等)，以提供所期需的气泡形状和大小。或者，所述端口可呈内开口和外 开口直径不同的一个部件的形式，如关于收获口 19所述。换气口 28和30、一个或多个收获口 19和任选的取样口，都可通过以下方式来形 成在容器12表面制造开口，并在开口周围用另外的刚性或非刚性的材料加固此开口，其 在本领域众所周知。为了提供合适的混合和通气，可以以20-70个进口 /平方米的密度提供许多个进 气口 28。进气口 28可按自容器12的底端16的预定距离环绕容器12的周长来安置。进气 口 28的位置由容器的体积和高度以及由用于特定植物培养应用所需的通气类型来确定。进气口 28可位于距容器底16的15-65厘米处。在本发明一个实施方案中，至少一个进气 口位于收获口 18以下的水平。根据需要可提供另外的进气口 28，例如用于具有极大的高度尺寸的容器或用于较大体积的容器，以提供较大的气体体积而不增加入气口压力或气泡体积。另外的进气口 28 可定位在容器12表面的任何位置，优选定位在容器12的一半高度的底部，以便为培养基提 供充分的混合和通气。所述具有多个进气口的构造在此由在位置I [28 (I)]和II [28 (II)] 的进气口显示，其分别具有入气口 34(1)和34(11)并且以彼此相距一段距离安置，以便为 植物细胞培养物提供有效的混合和通气。进气口可进一步含有防污染的机械装置，例如过 滤器49或捕集器(未显示)，其可防止污染性气体、液体或固体(例如空气传播的微生物) 进入到容器12的内体积和培养基内。容器12包括用于排出和除去聚集在培养基上方的气体的排气口 30。排气口 30位 于容器12的上半部，优选位于上三分之一部分，在基本上高于流体(例如培养基)水平的 位置，以便与培养基上方的“顶部空间”流体相连。排气口 30的外部排气开口 46可向环境 开口，在排气口 30处不能调节排出气体的流动。任选地和备选地，排气口 30可进一步包括 排气调节器48 (例如压力阀或夹)，其调节气体从容器12流出，因此能用于在容器12内形 成正气压，并从而保持容器12充分膨胀并处于所期需的圆筒形。排气口 30可进一步包括 防污染的机械装置，例如过滤器49或捕集器(未显示)，其可防止污染性气体、液体或固体 (例如空气传播的微生物)进入到容器12的内体积和培养基内。因为本发明容器12设计为用于至少400和高达几千升培养基的体积，并因为其具 有柔韧性的特性，所以设备10进一步包括支撑容器12处于适当位置的支承结构。如图2所示，支座50可包括圆锥形结构，其设计为给容器12提供支撑而不给容器 12或其中的内容物施力。支座50可由钢铁、木料、塑料或陶瓷来制成。支座可由形成环形52和杆状54支 座结构单元的格状结构的轻质圆筒形管或椭圆形管制成。或者，支座结构单元可为板，其与 垂直的杆状结构单元连接，并进一步与水平的环形结构单元连接。所述板可为连续板，其基 本上形成壳状的容器支座；或可为狭板(stave-like)，提供在它们之间留有间隔的宽支座 元件的环。支承结构50可为自由直立式，或安装有脚轮(未显示)用于移动，或其可进一 步通过连接至刚性结构例如墙、地板、柱子等等来支撑。容器12为一次性的，因此设计为以最小损失和对环境影响最小的方式使用(一个 或多个培养周期)后丢弃。例如，用塑料(例如用于本发明设备的柔性塑料)制成的设备 相对便宜，因此如果需要的话可在用后丢弃而经济损失是可忽略的。这些生物反应器设备 的丢弃对于使用者而言并不存在经济上的缺点，因为这些项目的低投资费用恰好补偿了使 用、储存和其它实用考虑的便利性。丢弃是有利的，因为其排除了对使用可能污染环境的消 毒剂和其它刺激性化学药品进行彻底洗涤的需要。因此，聚合的一次性生物反应器设备例 如容器12可易于循环使用，从而降低了因它们的使用而带来的污染和环境影响。尽管可对容器12消毒并重新使用，但优选以预先消毒的形式提供，藉此排除对费 钱耗时的灭菌程序的需要。可用湿式和/或干式灭菌法对非刚性容器实施灭菌。优选地， 灭菌为适用于本文所提及的柔性非刚性的塑料材料的干式灭菌法，例如，Y辐射或电子束 辐射、气体(例如环氧乙烷)灭菌等等，其在本领域众所周知。
根据本发明优选实施方案，先前所述的单独的设备和/或整套装置(battery)的 操作由计算机(未显示)控制。任选并优选计算机能够控制本发明整套装置和/或设备运 行的所述参数，参数例如为以下中的一种或多种温度、进入容器的气体或气体组合的量及 定时、允许排出容器的气体的量及定时、加入至少一种物质(例如营养物、培养基等等)的 量及定时、和/或光量。计算机可任选地还能够检测所产生的废料的量。优选将计算机连接到运行本发明所涉及的各种测量仪器，来作为用于自动或半自 动运行本发明的系统的实例。例如，优选将计算机连接到用于控制气体或气体组合流动的 一个或多个量表(未显示)。所述量表优选被连接到可连接合适的供气装置的管道，并控制 空气或其它一种或多种气体流向该管道。还优选将计算机连接到温度计，所述温度计更优选存在于容器12的环境中，但更 优选不在容器12内。计算机还任选并优选能够控制用于控制温度的机械装置，例如加热器 和/或冷却器。任选并优选将计算机连接到用于控制培养基和/或其它营养物从营养物/培养基 容器流向容器12的量表。优选将计算机连接到容器的至少一个口，更优选连接到至少是收获口 19。计算机 任选地可控制自动取样器和/或收获器，用于从任选的取样口移出容器内容物的部分用于 检测和/或收获(未显示)。还可任选地将计算机连接到用于分析这些内容物部分的分析 仪，例如以给计算机的操作提供反馈。如上所述，设备10设计为用于培养植物细胞培养物。适于在本发明设备中的大体 积植物细胞培养物的培养基可为本领域已知的任何植物细胞培养基。特别的但非限制性 的合适培养基的实例为 Murashige 和 Skoog 培养基(Sigma Ltd, St Louis, MO)、Anderson 培养基、Schenk和Hildebrandt培养基等等。很多植物组织培养基可市购(参见例如 Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KY) 0短语“植物细胞培养物”指任何类型的野生型(天然存在的)植物细胞或遗传修饰 的植物细胞(例如能够稳定或瞬时表达外源基因)。优选地，它是指产生活性成分的细胞培 养物，所述活性成分在商业上需要用于制药工业(药物或药物API)、食品工业(例如香料、 芳香剂)、农业(例如杀虫剂)、化妆品等等。优选地，植物细胞培养物包含从植物组织例如根或叶分生组织获得的植物细胞。 更优选地，植物细胞选自发根农杆菌(Agrobacteriumrihzogenes)转化的根细胞、芹菜细 胞、生姜细胞、烟草细胞、苜蓿细胞、西红柿细胞、莴苣细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。可在本发明中生长的另外的细胞培养物包括酵母、藓类、藻类、光合细菌。适用于本发明设备和方法的植物细胞培养物包括但不限于已建立的细胞系和 产生于植物根、叶、茎、花等的细胞系。已建定的细胞系的非限制实例为烟草(Mcotiana tabacum) L. cv Bright Yellow—2 (BY—2)细胞系禾口烟草 Nicotiana tabacum) L. cv. Petit Havana细胞系。应该理解，需要增加进气口压力、增加进气口密度、增加气体的通气速率和体积， 以提供适于本发明大规模生物反应器的混合和通气，这可能出现使植物细胞培养基产生泡 沫的问题，这一问题可能对细胞和培养基内容物有害。本领域已知用于抑制泡沫形成的方 法包括但不限于使用消泡剂，例如聚硅氧烷、有机磷酸盐和醇类，它们起促成小气泡会合为
20较大的危害较小的气泡的作用。通常用于工业和食品加工中的食品级消泡剂包括例如聚二 甲基硅氧烷和二甲基硅油(Simethicone)。消泡剂在本发明大规模一次性生物反应器中的 应用详述于以下实施例部分。本发明还涉及用于在大规模一次性生物反应器中培养和收获植物细胞的方法。所 述设备任选并优选按下文所述设备来配置，最优选按以下实施例1所述的设备来配置。在 该方法中，优选将植物细胞置于本发明设备容器内。任选并更优选地，植物细胞在悬浮液中培养。根据本发明优选实施方案，植物细胞在液态培养基中悬浮培养，根据需要加入至 少一种无菌气体或气体组合(多种气体)。任选并优选地，无菌气体包括无菌气体组合，其 更优选包含无菌空气。无菌气体和/或气体组合优选在每个周期中通过空气进口连续或脉 冲式加入到容器中，该空气进口优选与除菌过滤器(优选为0.2微米的过滤器)连接，其如 上所述。优选将无菌培养基和/或无菌添加剂置于容器内并通过添加剂进口 51转移到生 物反应器中，优选经过如前所述的一个或多个除菌过滤器。任选并优选通过收获器加入植物细胞(作为无菌接种物实例)。任选并优选地，容 器(12)中的植物细胞可例如通过外部光源(在容器外部的照明源)接触光，尤其是如果该 容器为透明和/或半透明的情况下。任选不使用光源，任选容器保持在黑暗条件下。使细胞能够生长到所需的细胞产量和/或由细胞产生的物质(例如蛋白或次级代 谢物)的产量。根据优选实施方案，优选让过量的空气和/或废气通过气体出口，任选地经过过 滤器，任选并更优选连续和/或间歇排出容器。此外，任选并优选地，检测容器中的物质(例如细胞培养基)是否有一种或多种污 染物和/或容器中生产的细胞的质量和/或一种或多种细胞产物的质量。更优选若发现一 种或多种污染物存在于培养物中，或发现产生的细胞和/或一种或多种细胞产物的质量不 好，则丢弃设备及其内容物。在合适的时候，尤其是若未发现一种或多种污染物和/或未发现细胞和/或一种 或多种细胞产物质量不好，则优选收获容器中的至少第一部分物质(例如含细胞和/或一 种或多种细胞产物的培养基)。更优选地，使剩余的第二部分物质(例如含细胞和/或一种 或多种细胞产物的培养基)保留在容器中，其中所述第二部分可任选地作为接种物用于下 一个培养/收获周期。接下来，可通过添加剂进口 51提供无菌培养基和/或无菌添加剂用 于下一个培养/收获周期，添加剂进口 51任选地与过滤器49连接用于防止污染。先前所述周期任选实施多于一次。任选并优选地，所述方法使得能够厌氧培养和 /或收获细胞。对于厌氧的实施方案，通过设备的进气口提供惰性气体来代替氧气或空气。对于 其至少一种设备而言，实施以下过程。经由收获口将无菌接种物导入设备。接下来，经由共 用的添加剂进口管将无菌培养基和/或无菌添加剂加到设备中。任选地，如先前所述来照 明设备。使设备中的细胞在培养基中生长到所需的细胞产量和/或一种或多种细胞产物 的产量。任选并优选地，允许过量空气和/或废气经由排气口，任选地经过过滤器，更优选连续地排出设备。就先前所述方法而言，根据一种或多种污染物和/或质量不好的细胞和/或一种 或多种质量不好的细胞产物的存在情况来监测容器中的物质，在存在的情况下优选丢弃容 器及其内容物。此外，就先前所述方法而言，优选在合适时间收获细胞和/或一种或多种细 胞产物，例如当业已产生了所需量的一种或多种细胞产物时。水纯化系统通常将基本上无内毒素的去离子水供给含有浓缩培养基的罐，然后将 稀释的培养基经由添加剂进口泵到设备10中。将过滤器(通常为0.2微米)安装到进料 管中并且恰好在进口上游，以使每个设备10中的容器内容物污染风险最小化。作为选择或 此外，可使用阀来使该风险最小化。对于每个设备10的第一个培养周期，在预先灭菌的容器中将接种物与培养基或 水预先混合，并通常经由收获口但备选或任选地经由单独的添加剂进口导入到设备10中， 所述接种物通常为在设备10中收获所需的细胞类型的足量样品。然后经由收获口或经由 任选添加剂进口将培养基导入到设备10中。对于随后的周期，如上文所述，仅导入培养基 和/或添加剂。通常，空气压缩机经由以下多个仪器为每个设备10提供基本上无菌的空气 或气体用于除去颗粒的粗过滤器；用于除去湿气的干燥器和湿度仪器(humidity apparatus)；和用于除去污染物的精滤器，通常为0. 2微米。优选地，恰好在进气口上游的 另一过滤器进一步使容器内容物污染风险最小化。对于每个设备10，对容器12的所有连接，即对一个或多个进气口、添加剂进口的 连接和优选地还有对一个或多个排气口和收获口的连接，都要在使用前灭菌，并在对外围 设备连接期间保持无菌，对外围设备的连接包括例如通过在层流气流罩(laminar airflow hood)中进行连接来供气和排气。对于每个设备10的温度控制优选由合适的空气调节装置来提供。当需要用于细 胞生长或化合物生产时，任选的照明设备可由适当地安置在设备10周围的合适的荧光灯 来提供。在每个设备10的每个培养周期期间，对应于容器12的各内容物通常在控温和光 照条件下通气并混合约3天-约14天或更长时间。根据每个培养周期的个别需要来确定 培养条件和培养持续时间，这些需要例如为所培养的细胞类型、待收获的重组产物、接种物 的浓度等等。在每个设备10的培养周期结束时，通常用合适的连接器(如上文所述在连接 前和连接期间灭菌)将对应的收获器口连接到预先灭菌的环境。然后进行收获，留下约 2. 5%-约45% (但通常为约10%-约35%)的细胞和/或组织作为接种物用于下一个周期。然后根据需要可任选地干燥或提取所收获的细胞/组织和/或一种或多种细胞产 物。另外任选的调节是在细胞培养过程期间加入纯氧气，更优选在开始培养过程后的 第3或第4天加入。适于在本发明大规模一次性生物反应器中培养的优选细胞类型的实例，为在 以下实施例部分所述的转化的胡萝卜细胞。如实施例部分所述，该细胞为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化的胡萝卜细胞，其表达编码人葡糖脑苷脂酶(hGCD)的 外源基因。在本发明一方面的另一实施方案中，细胞类型为烟草(Nicotiana tabacum) 0 在本发明又一实施方案中，所述烟草(Nicotiana tabacum)细胞为BY_2细胞。用于在适 用于本发明大规模一次性生物反应器的胡萝卜细胞和其它细胞类型中转化和表达外源基 因的方法在本领域众所周知。用一次性生物反应器在胡萝卜细胞和其它细胞培养物中转 化和表达有生物活性的外源蛋白详细公开于美国专利申请第10/784，295号和PCT公开 W02004/096978，它们完全在此弓|作参考。以下实施例部分例证了本发明设备在培养上述胡萝卜细胞和烟草(Nicotiana tabacum)细胞中的应用。如其中所述，在具有大于400升体积的大规模生物反应器设备10 中培养转基因的胡萝卜和烟草细胞，产生较高产量和纯度的重组蛋白。在大规模和较小规 模的一次性生物反应器中培养表达人葡糖脑苷脂酶的胡萝卜细胞和表达乙酰胆碱酯酶-R 的烟草细胞，并且分析和比较了培养条件、产量和产物(参见实施例2和3)。结果显示本 发明大规模一次性生物反应器提供了 在显著低的进口通气速率条件下增加的培养基02饱 和度(即以高达30%持续至少7天培养时间)，以及较高的培养效率，得到较高的重组蛋白 产物产量。通过肽作图(图8)、IEF(图10)、SDS-PAGE和免疫学分析(图7和15-17)和色 谱法(图6和9)分析重组蛋白，结果显示来自收获自大规模一次性生物反应器的细胞的葡 糖脑苷脂酶和乙酰胆碱酯酶的酶制备物，等同于用标准规模技术获得的标准制备物，这强 有力地表明从80L、400L和800L生物反应器收获的细胞所产生的酶制备物的一致性和身份 (identity)。还显示来自大规模一次性生物反应器的酶制备物表现出相当(如果不是更高 的话)的催化活性和比活性(参见表5和图17)。另外，还显示在本发明大规模一次性生物 反应器中产生的重组葡糖脑苷脂酶不含有可检测的胡萝卜宿主细胞蛋白水平，其仍然 比由标准体积生产方法(图11)制备的葡糖脑苷脂酶更纯。因此，本发明大规模一次 性生物反应器可提供准确有效和更优越的条件用于放大在较小甚至小很多的体积中产生 (develop)的表达重组蛋白的植物细胞培养物的规模。
实施例现在提及以下实施例连同以上说明以非限制性方式阐明本发明。通常，本文所用术语和本发明中使用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物 学和重组DNA技术。所述技术在文献中有详尽的解释。参见例如“Molecular Cloning :A laboratory Manual (分子克隆实验室手册)”Sambrook 等，(1989) ；"Current Protocols in MolecularBiology(目前分子生物学方案)”第 I-III 卷，Ausubel，R. M.编辑(1994)； Ausubel 等，“Current Protocols in Molecular Biology (目前分子生物学方案)”，John Wiley 禾口 Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, "APractical Guide-Molecular Cloning(实用指南-分子克隆)”，John ffiley&Sons, New York(1988) ；Watson 等 "Recombinant DNA( M 砠 DNA)Scientific American Books, New York ；Birren 等 (编辑)“GenomeAnalysis :A Laboratory Manual Series (基因组分析实验室手册丛 书)”,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；在美国专利 第 4，666，828 号、第 4，683，202 号、第 4，801，531 号、第 5，192，659 号和第 5，272，057 号 中所示的方法；"Cell Biology :A LaboratoryHandbook(细胞生物学实验室手册)”，第
23I-III 卷，Cellis，J. E.编辑(1994) ；Freshney, ffiley-Liss, N. Y.的 “Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique (动物细胞培养-基本技术手册)”(1994)，第三版; "Current Protocols in Immunology (免疫学当前方案)”第 I-III 卷，Coligan J. E.编 辑(1994) ；Stites 等(编辑)的 “Basic and Clinical Immunology (基础及临床免疫 学)”(第 8 版)，Appleton 和 Lange，Norwalk, CT(1994) ；Mishell 和 Shiigi (编辑)的 "Selected Methods inCellular Immunology (细胞免疫学选择方法)”，W. H. Freeman 和 Co. , New York(1980)；广泛阐述于专利和科学文献中的有用的免疫测定，参见例如美国专 利第 3，791，932 号、第 3，839，153 号、第 3，850，752 号、第 3，850，578 号、第 3，853，987 号、 第 3，867，517 号、第 3，879，262 号、第 3，901，654 号、第 3，935，074 号、第 3，984，533 号、 第 3，996，345 号、第 4，034，074 号、第 4，098，876 号、第 4，879，219 号、第 5，011，771 号 和第 5，281，521 号；"Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)”Gait，M. J.，编辑 (1984) ；"Nucleic Acid Hybridization (核酸杂交)” Hame、B. D.，和 Higgins S.J.编 辑(1985) ；"Transcription and Translation (转录和翻译)”Hame、B. D.，和 Higgins S. J.编辑(1984) ；"Animal Cell Culture (动物细胞培养)” Freshney，R. I.编辑 (1986) ；"Immobilized Cells and Enzymes (固定化细胞和酶)” IRL Press, (1986) ；"A Practical Guide_MolecularCloning(实用指南-分子克隆)”Perbal，B.，(1984)和 "Methods inEnzymology"H 1-317^,Academic Press ；"PCRProtocols :A
Guide (PCR 方案指南-方法和应用)”，Academic Press, SanDiego, CA (1990) ；Marshak 等， "Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual (蛋白纯化和表征策略-实验过程手册)”CSHL Press (1996)；所有的这些文献都如 同全部提出一样在此引作参考。本文各处提供了其它一般参考资料。认为其中的方法在本 领域众所周知，提供它们是为了读者方便。其中含有的所有信息在此引作参考。实施例1在大规模一次性生物反应器中有效培养植物细胞为了检测用大规模一次性生物反应器生产的培养物和细胞产物的生长参数、产量 和特性，在大规模和较小规模的一次性生物反应器中培养表达人葡糖脑苷脂酶的胡萝卜细 胞，并且分析和比较了培养条件、产量和产物。材料和实验方法转化和培养表达GCD的胡萝卜细胞如实施例2所述实施细胞转化和培养。在生物反应器中放大培养物生长将含rh-G⑶基因的约1cm(直径)遗传 修饰的胡萝卜细胞愈伤组织，接种到含4.4gr/l MSD培养基(Duchefa，Haarlem, The Netherlands)、9. 9mg/l 盐酸硫胺素(Duchefa)、0. 5mg 叶酸(Sigma Ltd, St Louis, M0)、 0. 5mg/l 生物素(Duchefa)、0. 8g/l 酪蛋白水解物(Duchefa)、糖 30g/l 和激素 2-4D (Sigma) 的9cm平板中的琼脂培养基上。愈伤组织在25°C生长14天。通过在含0. 2mg/l 2,4- 二氯乙酸的MSD液态培养基中继代培养转化的愈伤组织 来制备细胞悬浮培养物，其在本领域众所周知。然后将细胞悬浮培养物培养在250ml的锥 形瓶中，开始时为25ml工作体积，在25°C振荡速度为60rpm下培养7天后增加体积至50ml。 随后，在同样的条件下在1L锥形瓶中将细胞培养物体积增加到高达300ml。通过加入源自两个1L锥形瓶的培养7天的400ml细胞悬浮液，获得含4L MSD培
24养基的小生物反应器(10L)[参见W098/13469]接种物。在25°C下用lLpm气流培养1周 后，加入MDS培养基至10L，在同样的条件下继续培养。再培养(5天)后，通过让细胞培养 基流过80微米的网来收获并收集大部分细胞。挤出多余的培养基，将堆积的细胞块储存 在-70°C。消泡剂为了避免泡沫形成，使用C型医用消泡剂乳液(聚二甲基硅氧烷-PDMS， Dow Coming, Midland MI)，其含30%二甲基硅油(USP)、甲基纤维素、山梨酸和水。将消泡 剂以lOppm浓度加入到400L生物反应器培养基中。消泡剂分析使用Antifoam C Emulsion(PDMS)作为消胀药和非标准化食品中的 成分。依据并依照USP对二甲基硅油乳液的所有要求来评估PDMS的存在情况。将450ml的 0. 075% PDMS溶液加样到 15ml 阳离子交换色谱柱(Macro_Prep High S Support,BioRad, Hercules,CA)上。从加样样品、流过样品(未结合的材料)和来自0. 2MNaCl、l. 2M NaCl禾口 含12%乙醇的1. 2M NaCl这三个洗脱步骤的样品中取用于PDMS分析的等份样。收集收获的培养物在不同色谱步骤(加样、流过、洗涤和洗脱步骤)期间的等份 样品，并使用RP-HPLC法用在262nm处监测的C4柱分析PDMS的存在情况(Antifoam C Emulsion的峰值吸收)。SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要根据其分子量 来分离蛋白。另外，该技术提供关于蛋白纯度和组成的大量信息。通过按照标准化凝胶分 离方案的用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析，来检查从收获自大规模一次性生物反应器 的细胞产生的prGCD的分子量身份和蛋白杂质带型。简言之，SDS凝胶由成层胶(3% )和 分离胶(12% )组成。运行缓冲液为Tris/SDS、pH 8. 3，加样缓冲液为甘油-Tris-巯基乙 醇、pH 6. 8。反相高效(压)液相色谱(RP-HPLC) :RP_HPLC包括来自蛋白溶液的完整蛋白 和其它组分的分离。各种化合物的准确的保留时间是特征性的，使得可以测定目标蛋白 的身份和纯度。用固定相 C-4 柱(Phenomenex Jupiter 5u C4 proteo 300A 4. 6x250mm Phenomenex,Torance CA)并用 A(0. 1% TFA/H20)和 B(0. 1% TFA/ 乙腈)流动相梯度，来测 定植物重组G⑶(prG⑶)的特征峰和保留时间。蛋白检测是用二极管阵列分光光度计在两 个波长214nm和280nm处检测。多克隆抗体的制备将重组GCD(75 微克，Cerezyme Genzyme, Cambridge, MA)悬 浮在3ml完全弗氏佐剂(Difco，Voigt，Lawrence，Kansas)中，给两只兔中的每一只注射，接 着在2周后进行加强注射。加强注射后约10天从兔采血，以一周间隔再次进行这一过程， 直到抗体滴度开始下降。将除去血凝块的血清分为等份样并储存在-20°C下。蛋白印迹通过用特异性亲和纯化的抗GCD抗体进行蛋白印迹，以鉴定从收获自 大规模一次性生物反应器中的细胞纯化的植物重组GCD (prGCD)分子，并将其与先前制备 的批次和市售的人葡糖脑苷脂酶(Cerezyme , Genzyme，Cambridge，MA)比较。基本 上如本文所述进行蛋白转移。简言之，在4°C下以100伏电压来进行从凝胶到硝酸纤维素 的转移，历时90分钟。转移以后，让膜在封闭缓冲液[含奶粉、0.1% Tween 20(货号 P1379 ；Sigma Ltd, St Louis,M0)的磷酸盐缓冲液]中孵育。然后通过用抗G⑶抗体孵育、 洗涤并与合适的第二抗体(例如山羊抗兔(全分子)HRP(货号A-4914)反应，来免疫检测 蛋白。然后用 ECL 显影试剂(RPN 2209，Amersham, Pharmacia Biotech UKLTD)使印迹显色，并使用放射自显影来进行可视化。在不同生物反应器和不同通气方案中prG⑶产生之间的比较让表达prG⑶的 重组细胞在不同体积生物反应器(10L、100L、400L)中生长4-7天。使细胞在三个不同的 10L生物反应器中生长，对其实施不同的通气方案(使用鼓泡器；使用8mm的钻孔口(bore opening)；从第4天开始加入100 %氧气)。在第4天或第7天取粗提物(5 yl)样品，与 25ng的prGCD标准品一起在PAGE上分离，印迹到硝酸纤维素转移膜，并与特异性兔抗GCD 多克隆抗体反应。通过SuperSignal WestPico化学发光底物(Pierce Biotechnology, Rockford, IL.)显现带。溶解氧以Kla单位描述溶氧率dC/dT = Kla, (Cs_C)，其中Cs为mg/1的氧气的 饱和水平，C为mg/1的实际氧气浓度。通气速率通气速率定义为在lAtm压力下进气口处每体积液体体积每分钟的空 气体积(体积/体积/分钟)，通过将进口空气流量除以生物反应器的工作体积来计算得 到。测定最佳通气速率为了测定最佳通气速率，通过放大空气流量以实现较小体 积生物反应器的通气速率，并改变通气速率直到达到最佳预定参数，来实现每次增加体积 (从100L到400和800L的大规模生物反应器)的最优化。测定不同通气速率对物理参数 的影响，所述物理参数包括起泡水平、液体湍流水平、过滤器对空气流出的阻力和生物反应 器的膨胀。生物学参数包括培养细胞的生长曲线，其通过在生长周期(7天)每天记录的细 胞鲜重(gr/L)和7天的蛋白产物产量来描绘。为了获得最佳的通气速率，比较10-15个生 长周期。结果大规模一次性生物反应器培养需要较低的通气速率增加通气就增加培养细胞的生长率，这是细胞培养的常理。用于植物细胞培养的 较小体积生物反应器通常以0. 15-0. 3vvm的通气速率提供空气。出人意料地，当在适于促 进空气循环和氧气分布同时保持最小剪切力的通气速率范围内评估不同体积的生物反应 器的培养效率时，发现大规模生物反应器的最佳通气速率成比例地低于较小体积的反应器 的最佳通气速率。以下表1阐明尽管在较小体积生物反应器(至多100L)中，体积增加需 要增加通气速率以维持效率，但在大规模生物反应器(400L及更大)中，最佳通气速率实际 上随着生物反应器体积增加而降低。所述降低在工业规模培养对于减小剪切力的能力和较 大的能量效率二者都是有利的。表1 不同体积生物反应器的最优化的通气速率 大规模一次性生物反应器提供优越的氧饱和水平有效导入、混合和排出生物反 应器气体的参数的适当组合，对于有效操作本发明大规模一次性生物反应器至关重要。气 泡体积、通气速率、进口气压、气泡中的气压和气泡通过培养基的路径必须平衡，以使通气 和混合最优化，并使破坏性的剪切力和悬浮液内的湍流最小化。为了评估这些参数，测定了 氧饱和水平。图3显示了 与用较小反应器容器(锥形瓶、10升生物反应器和100升生物反应 器)中的培养基的O2饱和度的相比，在400升大规模一次性生物反应器中的培养基的O2饱 和度％，其在接种时(第0天)和培养3、4和7天时的等份样样品中测量。在大规模生物 反应器中空气压力和流速为35L/分钟，在较小的10和100升反应器中为IOL/分钟。接种 后，随着悬浮液中细胞内容物成比例增加而饱和度则降低，这是众所周知的现象。然而，尽 管7天内逐渐降低，但大规模一次性生物反应器明显地为培养基优选的O2饱和度提供了条 件，即在接种后任何既定的时间(直至7天)O2饱和度都超过30%。以下表2阐明800升生物反应器与较小体积的生物反应器相比达到甚至更大的O2 饱和度水平，其表示为Kla(mg/L)。这种优越性在整个通气速率范围内都能保持。表2 在400和800L大规模一次性生物反应器间在不同通气速率(vvm)下比较溶 氧浓度(以mg/L表示的Kla) 大规模一次性生物反应器提供优选的重组蛋白产量为了测定在大规模一次性生 物反应器中培养对培养物中的重组蛋白产生效率的影响，使来自各个反应器的悬浮液中的 提取物通过SDS-PAGE分离，印迹，并通过用抗人葡糖脑苷脂酶(GCD)抗体免疫检测来分析。 400L大规模一次性生物反应器中重组产物的产量(图4，第4-6道)与IOL (图4，第1_3 道)和100L(图4，第7和8道)反应器中重组产物的产量的比较，明显显示在大规模生物 反应器中蛋白水平增加，培养基利用效率更高。确实，在4和7天的培养中，大规模生物反 应器中的G⑶产量(分别为第4、5和6道)比具有增加的进气口钻孔(图4，第2道)和从 第4天开始加入O2 (图4，第3道)的IOL反应器的产量高。这些结果表明本发明大规模一次性生物反应器提供了增加的培养基O2饱和度和 更高的培养效率，这导致较高的重组蛋白产物产量和更高的能量效率。从大规模一次性生物反应器的培养基中有效简单地除去消泡剂在将较高的空气压力用于大规模一次性生物反应器通气时，需要注意培养基的泡沫形成问题(出于多种理 由而应该避免泡沫形成)。当将细胞生长培养基转移到400L生物反应器时，向其加入消泡 剂(IOppm)。使用标准实验室技术例如HPLC和原子吸收检测的最低水平为大约7ppm。为了确证来自大规模一次性生物反应器的收获和纯化重组产物能够消除消泡剂 残留，对大量过剩的PDMS消泡剂进行最初纯化过程步骤，始终监测消泡剂的存在情况。图5a为阳离子交换柱的加样溶液等份样中的PDMS消泡剂(0. 075% )的RP-HPLC 分析。保留时间(峰)为22. 531分钟。图5b显示流过色谱柱的消泡剂(保留时间为22. 554 分钟)，峰的大小和在262nm处的吸收与加样材料相似。来自3个随后的洗脱步骤(0. 2M NaClU. 2M NaCl和含12%乙醇的1. 2M NaCl)中任一个的样品未检测到PDMS。以下表3明 显表明PDMS没在色谱柱上被保留。 这些结果清楚地表明消泡剂剩余易于从培养基除去，并从分离和纯化过程的第一 步开始就保持在可检测水平以下。实施例2用大规模一次性生物反应器在胡萝卜细胞悬浮液中有效表达人葡糖脑苷脂酶本实施例提供了用转化的植物细胞实施的实验的说明，所述细胞按照本发明某些 实施方案培养在本发明大规模一次性生物反应器中。材料和实验方法质粒载体^CE-T-由获自Galili教授的质粒CE构建而成[美国专利第5，367，110 号，11 月 22 日，(1994)]。用SalI消化质粒CE。用DNA聚合酶I大片段使SalI粘性端变为平短。然后用 PstI消化该质粒，并将其与用SmaI和PstI消化的以下DNA片段连接来自碱性内切几丁 质酶基因[拟南芥(Arabidopsisthaliana)]的编码ER靶向信号的DNA片段ATGAAGACTAA TCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC(SEQ ID NO 6)；和编码来 自烟草几丁质酶A的液泡靶向信号的DNA段GATCTTTTAGTCGATACTATG (SEQ ID NO 5)。*pGREENII-从 P. Mullineaux 博士获得[Roger P. Hellens 等，(2000)Plant Mol. Bio. 42 :819-832]。pGREEN II载体的表达受到来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、TMV(烟 草花叶病毒)的ω翻译增强子元件和来自根癌农杆菌的章鱼碱合成酶终止子序列的调控。
人葡糖脑苷脂酶(hGCD)cDNA 从含葡萄糖苷酶β酸[葡糖脑苷脂酶]的ATCC (登 记号 65696)，GC-2. 2 [GCS_2kb ； λ -EZZ- γ3 人(Homosapiens)]获得人葡糖脑苷脂酶。插入长度(kb) 2. 20 ；组织成纤维细胞WI-38细胞。hG⑶表达质粒的构建用如下正向引物和反向引物扩增编码hG⑶(ATTC克隆编号 65696)的 cDNA ιΗ向引物 5，CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (SEQ ID NO :3)和反向引物 5，CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3，(SEQ ID NO 4)。用核酸内切酶 EcoRI 和 BglII (参见弓丨 物中有下划线的识别序列)消化纯化的PCRDNA产物，并连接到具有用同样酶消化的表达盒 CE-T的中间载体。用限制性酶SmaI和XbaI切下表达盒并从中间载体洗脱，将其连接到二 元载体pGREENII，形成最终的表达载体。由NPTII基因提供卡那霉素(kanamycin)抗性，所 述基因通过与提供表达盒的PGREEN载体一起获得的nos启动子驱动。用以下测序引物对所获得的质粒进行测序，以确保正确的信号框内融合5’ 35S 启动子 5，CTCAGAAGACCAGAGGGC 3，(SEQ ID NO 1),和 3，终止子 5，CAAAGCGGCCATCGTGC 3，(SEQ ID NO 2)。胡萝卜愈伤组织和细胞悬浮培养物的建立如先前Torres K. C. (Tissue culture techniques for horticular crops (园艺作物的组织培养技术)，第111、169页)所述建 立胡萝卜愈伤组织和细胞悬浮培养物。胡萝卜细胞的转化和转化细胞的分离用改良过的前述方法[Wurtele，Ε. S.和 Bulka，K.Plant Sci. 61 =253-262(1989)]由农杆菌渗入实现胡萝卜细胞的转化。在整个过 程中用在液态培养基中生长的细胞代替愈伤组织。孵育和生长时间适合转化液体培养中 的细胞。简言之，用pGREEN II载体通过电穿孔转化农杆菌[den Dulk-Ra,Α.和Hooykaa、 P. J. Methods Mol.Biol.55 :63_72 (1995)]，然后用卡那霉素选择。随后用农杆菌转化胡萝
卜细胞，在液态培养基中用巴龙霉素(paromomycine)抗生素选择。筛选转化的胡萝卜细胞用于分离表达高水平GCD的愈伤组织在SDS样品缓冲液 中使细胞勻菜化，在 SDS-PAGE[Laemmli U.，(1970)Nature 227 :680_685]上分离所得到 的蛋白提取物并转移到硝酸纤维素膜(hybond C硝酸纤维素，0.45微米，货号RPN203C; Amersham, Pharmacia Biotech UK LTD)。用多克隆抗hGCD抗体实施用于检测GCD的蛋白 印迹(在下文阐述)。在大规模生物反应器中培养并放大细胞规模如上文实施例1所详述实施细胞培养。蛋白分析如上文实施例1所详述实施蛋白身份和纯度的分析。质谱用基质辅助激光解吸离子化飞行时间/飞行时间(MALDI-T0F)质谱仪 (4700，Applied Biosystems, Foster City CA)和离子讲质谱仪(LCQ classic, Finnigan, San Jose，CA)实施质谱(MS)分析。用RP-HPLC的肽作图或蛋白“指纹图谱”肽作图是用于在进行提供高分辨率分 离的RP-HPLC后分析水解消化蛋白所得到的肽的方法，其因称为“指纹图谱”的不同概况 (profile)而具有可重现性。作为高度特异性的鉴定方法，该分析用于确认在标准制备过 程中产生的酶制备物和来自从400L生物反应器(PX-400-GC-2 ；在技术限制内)收获的细 胞的酶制备物的身份。通过以1 50 /^的胰蛋白酶/501111(朋4)20)3( !18.0)在371孵育 6小时接着在室温过夜孵育，来用胰蛋白酶消化prGCD。对于RP-HPLC分析，将50 μ g经过消化的肽加样到C-18柱(柱Phenomenex Jupiter 4u proteo 90A 4. 6x250mm, Phenomenex, ToranceCA)上，分离月太，如上所述检测。
IEF 等电点聚焦(IEF)是基于蛋白在电场中的电荷来分离蛋白的技术。IEF用 作鉴定工具，以确保按具有正确Pi范围带型所证明的蛋白的同质性。按照标准方案进行 prG⑶和Cerezyme 的等电点聚焦。简言之，为了鉴定prG⑶的等电点(pl)，用指定的阳 极和阴极缓冲液和Pl标准品(Amersham Pharmacia Biotech UK LTD)在预制的pH 3-10 范围的聚丙烯酰胺IEF凝胶(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)上对纯化的酶进行电 泳。向每一 PrG⑶和Cerezyme 样品中加入0.05%牛胆酸(弱阴离子去污剂)以提高在 凝胶中的迁移率。按照厂商指导通过Bio-Safe 考马斯染色(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)显现prG⑶和Cerezyme 蛋白的带型。通过用IEF标定试剂盒高范围pi 5-10. 5的 蛋白标准品(Amersham Pharmacia BiotechUK LTD)来估测各蛋白带的pi。确定了prGCD 与工业生产的Cerezyme 的带型相似性。prG⑶带型也用于批与批之间一致性的检查。酶活性测定β -葡糖脑苷脂酶催化葡糖脑苷脂这种糖脂水解为葡萄糖和神经酰 胺。为了评估重组葡糖脑苷脂酶的催化活性，采用用合成底物的酶测定来评估每一批次。 酶单位定义为在37°C每分钟催化一微摩尔合成底物对-硝基苯基- β -D-吡喃葡萄糖苷 (pNP-Glc)水解的酶的量。结果来自大规模一次性生物反应器的重组葡糖脑苷脂酶的特征为了测定由大规模一 次性生物反应器提供的改良的培养条件的最佳特征，并且为了检测这些条件的可靠性和可 重复性，对在大规模一次性生物反应器中生产的重组产物与在较小规模生物反应器生产的 制备物进行了分子量和物理化学特性的比较。通过质谱测定葡糖脑苷脂酶的分子量进行质谱分析以测定蛋白的分子量而无需 使用蛋白标准品。使用两种质谱法以测定从400L生物反应器收获的细胞生产的酶的分子 量，并将其与在较小规模反应器中生产的葡糖脑苷脂酶比较。所有的酶制备物用同样的方 式分离并纯化。以下表4概述了通过两种仪器LCQ classic和MALDI-T0F获得的若干酶批次的分 子量。从400L生物反应器收获的细胞生产的prG⑶批次由PX400-GC表示。表4 不同批次生产的不同prG⑶的分子量 质谱结果显示对所有制备物中蛋白分子量的估测常规地为大约60800道尔顿，并 且在从400L生物反应器和80L生物反应器中收获的细胞生产的批次之间保持一致。该分 子量符合具有构成56642. 6道尔顿的506个氨基酸和构成其余的4158道尔顿的另外多糖 结构(大约7%)的糖基化多肽。SDS-PAGE和蛋白印迹分析鉴定、测定分子量和纯度通过SDS-PAGE分析用考马斯 亮蓝染色检查了从400L生物反应器收获的细胞生产的葡糖脑苷脂酶的分子量的身份和蛋 白杂质带型。图6显示用考马斯亮蓝染色的标准酶制备物(PLX-GC-016-0505DS)、Cerezyme 和从400L大规模一次性生物反应器收获的细胞生产的葡糖脑苷脂酶(PX-400-GC-2)的 SDS-PAGE。图6进一步证实，来自在大规模生物反应器中培养的细胞的prGCD显示与用其它 方法生产的GCD具有接近的等同的性质。在各批次中的蛋白的迁移率相似，具有所估测的 60.9kD的分子量。另外，来自标准反应器和400L生物反应器的各批次间的蛋白带型相同， 表明从400L生物反应器收获的细胞生产的酶中没有明显的蛋白杂质。使用特异性亲和纯化的抗β -葡糖脑苷脂酶抗体，实施用抗葡糖脑苷脂酶抗体进 行的SDS-PAGE分离蛋白的免疫检测(蛋白印迹)，以鉴定从400L生物反应器收获的细胞 纯化的葡糖脑苷脂酶分子，并将其与先前制备的批次和市售的人葡糖脑苷脂酶 (Cerezyme , Genzyme)进行比较。图7显示用特异性兔抗β-葡糖脑苷脂酶抗体用于检测标准β-葡糖脑苷脂 酶(PLX-GC-016-0505DS)、Cerezyme 和从400L生物反应器收获的细胞生产的蛋白 (PX-400-GC-2)的蛋白印迹分析。由特异性抗体鉴定的蛋白带在标准方法和400L生物反应 器方法的各批次间一致。本分析显示在从400L生物反应器收获的细胞生产的酶蛋白中没 有另外的降解带。因此，根据SDS-PAGE和免疫学分析，没有证据表明在从标准(80L)生物反应器或 从所述400L生物反应器中收获的细胞生产的酶之间的身份和纯度有差别。用反相高效(压)液相色谱(RP-HPLC)的肽作图或蛋白“指纹图谱”为了确证在 标准生产过程(80L)和从400L生物反应器收获的细胞生产的酶制备物(PX-400-GC-2)的 身份，对从80和400L生物反应器收获的细胞生产的prGCD进行了蛋白指纹图谱分析。图8a和8b显示在C_18色谱柱上进行的对市售葡糖脑苷脂酶 (PLX-GC-016-0505DS)的胰蛋白酶酶解的典型图谱。图8a显示在214nm处(肽键)监测 的分离的肽，图8b显示在280nm处(色氨酸和酪氨酸)监测的分离的肽。图8c和8d代表 在214nm(图8c)处和在280nm(图8d)处监测的从400L生物反应器收获的细胞制备的葡糖脑苷脂酶(PX-400-GC-2)的胰蛋白酶图谱。因此，来自大规模一次性生物反应器所收获的细胞的葡糖脑苷脂酶酶制备物的肽 图与用标准规模技术获得的标准制备物的肽图一致，这强有力地表明从80L和400L生物反 应器收获的细胞所生产的酶制备物的一致性和身份。反相高效(压)液相色谱(RP-HPLC)用RP-HPLC进一步表征由在400L大规模生 物反应器中培养的细胞生产的蛋白。图9a和9b代表从400L生物反应器所收获的细胞纯化的葡糖脑苷脂酶 (PX-400-GC-2)在214nm(9a)处和280nm(9b)处的色谱图。在大规模一次性生物反应器生 产的酶蛋白色谱图中，酶作为保留时间为64. 12分钟的一个完整峰出现，与先前制备的葡 糖脑苷脂酶的64. 70分钟的保留时间相似。因此，在标准色谱条件下，由大规模和标准规模一次性生物反应器生产的两种重 组葡糖脑苷脂酶以相似且一致的保留时间被洗脱。一个完整峰的出现与对先前的酶制备物 各批次进行的分析所获得的结果一致。微量杂质峰的峰型和大小与葡糖脑苷脂酶标准品相 似，杂质水平在所需的规范范围内。等电点聚焦(IEF)为了进一步鉴定并确保在本发明大规模生物反应器中 培养的细胞生产的重组蛋白的同质性，测定了从大规模400L生物反应器收获的细胞 (PX-400-GC-2)和从标准80L反应器制备物收获的细胞(PLX-GC-016-0505DS)的葡糖脑苷 脂酶带型的Pl范围。图10显示通过考马斯亮蓝染色显现的pi带型，所述带型分别为以下酶样品的带 型来自标准体积生物反应器制备物的酶样品(PLX-GC-016-0505DS)和来自400L生物反 应器所收获的细胞的在不同纯化阶段(在第3、第4和第5纯化柱后，其分别由C-3、C-4和 C-5表示)的酶样品(PX-400-GC-2)。由标准体积的生物反应器生产的酶和从400L生物反应器收获的细胞生产的酶的 概况在条带数目、各个类似带的带型和亮度等方面都是等同的。因此，在大规模一次性生物 反应器中生产的酶和先前生产的制备物中生产的酶的IEF同等型型式(isoform pattern) 是等同的。酶活性检测为了评估在大规模生物反应器中生产的重组葡糖脑苷脂酶的催化活 性，采用用合成底物对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-Glc)的酶测定。表5概述了 从400L生物反应器收获的细胞生产的葡糖脑苷脂酶(由PX-400-GC表示)和由标准体积 反应器生产的葡糖脑苷脂酶的比活性。表5 重组葡糖脑苷脂酶各批次的比活性 因此，从400L生物反应器收获的细胞生产的酶的比活性在用标准规模生产的酶 的比活性范围内。此外，当将在800升生物反应器中生长的3批表达prG⑶的细胞培养物 的生长参数与在400升生物反应器中生长的培养物的值进行比较时，对于在两种大规模一 次性生物反应器中的培养物来说，传导率、摩尔渗透压浓度和产量(细胞和蛋白)参数都在 相同的范围内，其如下表6所示。表6 在400和800L生物反应器中培养的表达prG⑶的细胞的生产生长参数 来自大规模一次性生物反应器的β -葡糖脑苷脂酶无宿主细胞蛋白为了检测胡 萝卜宿主细胞蛋白(CHP)，开发了能够检测大范围蛋白杂质的敏感的免疫测定。对于该检 测，通过用由非转化的胡萝卜细胞(不荷有葡糖脑苷脂酶构建体的胡萝卜细胞)产生 的蛋白制备物免疫接种，来产生多克隆抗体。进一步分离这些多克隆抗体，以获得与蛋白的 多肽核心而不是与糖部分/残基的特异性结合，从而防止与连接重组β -葡糖脑苷脂酶的 糖发生交叉反应。将胡萝卜宿主蛋白(CHP)制备物用作宿主相关蛋白杂质的参考标准品，并用作抗 原用于免疫测定的多克隆抗体的制备。
图11显示了通过使用特异性抗胡萝卜细胞宿主蛋白抗体进行的SDS-PAGE和蛋白印迹，分析特异性抗宿主蛋白抗体对宿主蛋白样品和各葡糖脑苷脂酶批次的反应性。 分析了来自标准体积生物反应器β-葡糖脑苷脂酶批次(PLX-GC-016-0505 DS)和从400L 生物反应器收获的细胞所生产的β-葡糖脑苷脂酶批次(PX-400-GC-2)，以及来自胡萝卜 宿主蛋白提取物的样品。确定了胡萝卜细胞宿主蛋白样品中的四个主要的蛋白条带(图 11，第7和8道)，然而，在任一种β -葡糖脑苷脂酶样品中都没有检测到相对应的CHP蛋白 带，表明在本发明大规模一次性生物反应器中生产的重组β-葡糖脑苷脂酶不含有可检测 水平的胡萝卜宿主细胞蛋白，其并不比由标准体积生产方法制备的葡糖脑苷脂酶的纯 度差。实施例3用大规模一次性生物反应器在ΒΥ-2细胞悬浮液中有效表达人乙酰胆碱酯酶本实施例提供用转化人乙酰胆碱酯酶的烟草ΒΥ-2细胞实施的实验的说明，所述 细胞按照本发明一个实施方案培养在大规模一次性生物反应器中。材料和实验方法cDNA:从以色列耶路撒冷的希伯来大学的Hermona Soreq教授处获得编码插入 的人乙酰胆碱酯酶“通读(read through) ” 变体(AChE-R)的 cDNA(Yissum Technology Transfer Company of the Hebrew Universityof Jerusalem,编号为 pTM240)。该基因序列 经过植物最优化，包含定位到ER中的天然前导序列(N-末端的33个氨基酸，SEQ ID NO :7， 在成熟蛋白中降解)和融合到重组基因(SEQ ID NO 9)的C-末端的ER保留序列(SEKDEL ； SEQ ID NO :8)。乙酰胆碱酯酶表达质粒的构建将pBluescript SK+质粒(货号212205， Stratagene,La Jolla,CA)用作构建植物表达盒的骨架。将具有用于高水平表达所需的必 需元件的植物表达盒构建到pBluescript SK+质粒中。该表达盒(CE)包含CaMV35S启动 子、ω翻译增强子、根癌农杆菌章鱼碱合成酶基因的转录终止和聚腺苷酸信号(CE盒)。通过用含Sal I和PstI限制性位点的引物进行PCR扩增AChE-R，将AChE-R 亚克隆到含表达盒的Bluescript 表达载体，限制性位点用粗体下划线描述(正向 弓I 物5 ‘ -CGGC GTCGAC ACAAGAGGCCTCCACAAT-3 ‘ (SEQ ID NO 10)；反向弓丨物 5' -CCCC CTGCAG CTAGAGTTCATCCTTCTC-3 ‘ (SEQ IDNO :11)。然后从中间载体取出 含AChE-R编码序列的表达盒，并用NotI和Acc651进一步亚克隆到双元载体pGREENII nos-Kana (Hellens等，2000)，其如本文所述。用PCR和限制性分析选择阳性克隆。表达Ache-R的BY_2细胞的转化、筛选和培养如先前所述，在渗入BY2细胞之前 先对农杆菌进行转化(den Dulk-Ras和Hooykaas，1995)。卡那霉素的抗性用于筛选和选择 转化株，其由NPTII基因提供，所述基因通过与pGREEN载体一起获得的nos启动子驱动。基本上按照上文实施例2关于转化胡萝卜细胞所述，用农杆菌渗透遗传修饰的烟 草细胞(BY2细胞系)并随后培养。用本文所述Elman催化活性测定和蛋白印迹来实现对 表达高水平Ache-R的愈伤组织的筛选。所选定细胞的细胞悬浮培养物以50ml悬浮液在持 续搅拌和控温条件(在轨道振荡器(SOrpm)上25士2°C )下保持在250ml锥形瓶中。生产 过程包括在含作为选择剂的抗生素巴龙霉素和头孢噻肟(Cefotaxime)的培养基中生长阶 段。
在生物反应器中放大培养生长逐渐将培养放大到10L。首先，将200_400mL悬浮 细胞接种物导入到含3. 6-9. 8L培养基的12L生物反应器中。培养(25 士 2°C，1. 5Lpm无菌空 气)7天后，加培养基至10L，在同样的条件下再继续培养7天。用IOL悬浮细胞接种400L 生物反应器，随后逐渐加培养基到至多350L，在同样条件下继续培养。
当转移到400L时，将消泡剂(IOppm)加到细胞生长培养基中。所用消泡剂为如本 文所述的C型医用消泡剂乳液(聚二甲基硅氧烷-PDMS)。蛋白印迹用针对人源AChE的N-末端肽生产的亲和纯化的山羊多克隆抗体 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)进行蛋白印迹。在所有 AChE 形式中 N-末 端都一样，因此，该抗体也可识别AChE-R。用ECL检测试剂盒(Pierce)进行检测。在标准条件下进行SDS-PAGE。在10 % SDS-PAGE上分析AChE-S和AChE-R。用 Criterion 细胞垂直电泳仪(Bio-Rad Laboratories)用预混合的电泳Tris-甘氨酸-SDS 运行缓冲液(Bio-Rad Laboratories)实施电泳。用预混合的40%丙烯酰胺/Bis和10% SDS溶液制备10%丙烯酰胺凝胶。用iBlot Dry Blotting系统(Invitrogen)、用印迹 装置P3准备计划，将蛋白从双丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜。在室温转移8分钟。 在将蛋白转移到膜后，封闭膜，洗涤，用One-step CompleteWestern试剂盒(GenScript Corporation)与第一和第二抗体结合。将第一抗体(N-19 ；Santa Cruz,CA)以1 200稀 释加到One-step (GenScript)工作溶液中。用ECL检测试剂盒(Pierce)进行检测。比较 AChE-R 与市售人重组 AChE-S (Sigma)的免疫反应性。用 Molecular Imager GelDoc XR 系 统(Bio-Rad Laboratories)检测带。Flamingo 荧光凝胶染色Flamingo 荧光凝胶染色(Bio-RadLaboratories) 是高度敏感的非特异性的蛋白染色方法。以几种浓度(50、100和200ng/样品)加样 AChE-R(第9-11批)来与市售人重组AChE-S (Sigma)比较。如本文所述以标准方法在10% SDS-PAGE上分析样品，按照厂商说明用Flamingo 荧光凝胶染色液来染色。Ellman测定将Ellman试剂用于修饰蛋白中的游离的巯基(Ellman，等1961)。其 与巯基快速形成二硫键并释出硫醇盐离子(thiolateion)，硫醇盐离子具有特征颜色，可在 405nm处测量。实施Ellman测定用于测量粗勻浆样品中AChE-R活性和活性酶浓度，以及 测定纯化样品中的活性酶浓度。酶单位定义为在室温和PH = 7. 4下每分钟催化一微摩尔 合成底物碘化硫代乙酰胆碱(乙酸(2-巯基乙基)三甲基碘化铵)水解为碘化(2-巯基乙 基)三甲基铵和乙酸的酶的量。用碘化硫代乙酰胆碱(Sigma，St Louis MO)作为底物测定 AChE-R催化活性。以约60ng/ml (纯化样品)或50-100ng/ml (粗勻浆)的浓度检查样品 的AChE催化活性，将样品溶解于磷酸盐缓冲液(0. 1Μ;ρΗ = 7.4 ；0. 025% BSA)，随后使用由 Ellman等(1961)开发的分光光度法。在该方法中，使AChE、碘化硫代乙酰胆碱(20mM)和 Ellman试剂-DTNB [5-5，-二硫-双(2-硝基苯甲酸酯)；9mM ；Sigma]混合，通过在405nm 处在20分钟内以2分钟间隔测量光密度来用分光光度法监测水解。阴性对照含有除待测 提取物外的所有组分。结果对时间作图，从图的线性部分的斜率计算起始速率。用以下方程计算每种AChE制备物的单位活性 用特异性AChE抑制剂-DEPQ的Ellman试剂DEPQ [7_ (0，O- 二乙基-氧膦基氧 基)-1-甲基喹啉鐺甲基硫酸盐]是AChE的不可逆的有效抑制剂，用于监测AChE的活性。在 磷酸盐缓冲液(0. IM ；pH = 7.4 ；0. 025% BSA)存在下通过加入各种量的DEPQ(0. 2-0. 8nM) 来进行酶溶液的活性部位滴定。如上所述用Ellman测定来测量活性。用抑制百分率对抑 制剂浓度作图。DEPQ与AChE-R以1 1的比例起反应。这些值用于测定以μΜ表示的 AChE-R 浓度。 用Karnovsky染色的胆碱酯酶活性=Kamovsky和Roots胆碱酯酶活性染色法 (Karnovsky和Roots，1964)是用于肉眼检测胆碱酯酶(AChE和BChE)活性的特异性方法。 该方法用硫代胆碱酯作为底物，基于通过胆碱酯酶活性释放的硫代胆碱来使铁氰化物还原 为亚铁氰化物。由铜捕获所形成的亚铁氰化物，形成亚铁氰化铜，于是通过肉眼可观察到。天然(非变性PAGE 由于聚丙烯酰胺凝胶提供一致的孔径，非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)用于5-2，OOOkDa大小范围的蛋白。不象SDS-PAGE，非变性凝胶电泳不用带 电的变性剂。因此，被分离的分子在分子量和固有电荷方面都不同。因为蛋白在分离中始 终保持在天然状态，它们就可不仅通过一般的蛋白染色试剂来检测，而且可通过采用酶的 特异性催化性质的试剂来检测。结果重组Ache-R概况估测由本发明方法生产的重组AChE-R蛋白的分子量为64kDa， 如图15(第1-3道)所示。在中性条件下为四聚体的对照AChE-S (第5-7道)在SDS-PAGE 中还原为其单体，因此与AChE-R的迁移相类似，因为AChE-S单体为约70kDa，比AChE-R重 6kDa。因此，在大规模一次性生物反应器中的BY2烟草细胞中表达的AChE-R与在HEK 293 细胞中表达的以其单体形式的重组人AChE-S (Sigma)具有相似的3维结构(其由电泳迁移 率所测定)。Flamingo 非特异性染色还验证了植物表达的重组AChE-R的迁移概况，因为所 检测的带表现出与用抗AChE抗体免疫测定所检测(图16)的一样的迁移带型。另外，如图 16所示的凝胶上所观察的单个染色带表明植物表达的酶蛋白的显著纯化效率。重组AChE-R活性图17显示用Karnovsky染色的植物表达的AChE-R和哺乳动 物细胞表达的AChE-S多肽的催化等同性。将50ng(第3和6道)、100ng(第2和5道)和 200ng(第1和4道)的AChE-R加样到凝胶上。在所有3种几样浓度中活性都很明显，确 证了从收获自大规模本发明生物反应器的BY-2细胞纯化的Ache-R的活性。市售人重组 AChE-S呈其四聚体形式(参见上面箭头)，因此比AChE-R单体(下面的箭头)迁移得慢一 些，并保持其活性。在第4-6道检测的较不明显的条带与AChE-R单体条带(第1-3道)相 同地迁移，表明植物表达的AChE-S单体与市售人重组AChE-S不仅在大小上一样，而且在催 化活性上等同。下表7显示在小体积生物反应器中生产的各批次与在本发明实施方案的大规模 一次性生物反应器中生产的各批次的植物表达的AChE-R活性比较，其通过用DEPQ抑制的Ellman活性测定法来检测。表7清楚地显示在大规模培养设备中AChE蛋白产量(表示为 mg蛋白/Kg细胞)显著增加，而不降低酶活性范围。
I U = In摩尔(Ellman) 产量(mg蛋白/Kg细胞湿重)mg/ml
IOL生物反应器(第6批)429.6ΟδΓ2
IOL生物反应器(第67489. 3048O 批)
400L (第 8 批)535068 Γ62
400L (第 9-11 批)564066 ΤΤθ因此，综合以上结果，进一步支持在本发明某些实施方案大规模一次性生物反应 器中培养转基因植物细胞的显著优点，所述生物反应器可用于准确并高效表达和翻译后加 工重组蛋白，而同时避免很多较小体积和基于动物的表达系统的缺点。参考文献Ma, J. K. C. ，Drake, P. Μ. W.，禾口 Christou，P. (2003) Nature reviews 4，794—805Proulx等的美国专利申请第2005/0282269号Hodge等的美国专利申请第2005/0272146号Gaugler等的美国专利第6，432，698号Schlatmann 等，Biotech. Bioeng.，1995 ；45 :435_39Namdev 禾口 Dulop, App. Biochem and Biotech, Part A, Frontiers inBioprocessing, 199权利要求
用于培养和收获植物组织和/或细胞的一次性设备，所述设备包含具有至少400升体积的非刚性容器，所述容器配置有使所述设备能够连续用于至少两个连续培养/收获周期的换气口和收获口，其中所述设备经过设计和构建用于保持适于培养所述植物组织和/或细胞的氧饱和度和剪切力。
2.权利要求1的一次性设备，其中通过组合以下参数值或值范围来维持适于培养所述 植物组织和/或细胞的所述氧饱和度与所述剪切力a)高度体积比；b)进气压力；c)进气口/横截面积密度；d)进口通气速率；和e)进口气泡体积。
3.权利要求1的设备，其具有选自以下值或值范围中的至少一种的参数值或值范围a)约0.06-约1厘米/升的高度体积比；b)约1巴-5巴的进气压力；c)约20个进口/平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度；d)约0.05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率；和e)约20立方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。
4.权利要求1的一次性设备，其中所述氧饱和度为至少15%体积/所述容器内含有的 液体体积。
5.权利要求2的设备，其中所述组合为约0.06-约1厘米/升的高度体积比和约1巴-5 巴的进气压力。
6.权利要求2的设备，其中所述组合为约0.06-约1厘米/升的高度体积比和约20个 进口 /平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度。
7.权利要求2的设备，其中所述组合为约0.06-约1厘米/升的高度体积比和约 0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率。
8.权利要求2的设备，其中所述组合为约0.06-约1厘米/升的高度体积比和约20立 方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。
9.权利要求5-7中任一项的设备，其中所述组合进一步包含约20立方毫米-约1800 立方毫米的进口气泡体积这一参数。
10.权利要求6-8中任一项的设备，其中所述组合进一步包含约1巴_5巴的进气压力 这一参数。
11.权利要求5、7和8中任一项的设备，其中所述组合进一步包含约20个进口/平方 米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度这一参数。
12.权利要求5、6和8中任一项的设备，其中所述组合进一步包含约0.05-0.12体积气 体/体积培养基/分钟的进口通气速率这一参数。
13.权利要求2的设备，其中所述组合包含约0.06-约1厘米/升的高度体积比、约1 巴-5巴的进气压力、约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密 度和约20立方毫升-约1800立方毫升的进口气泡体积。
14.权利要求2的设备，其中所述组合为约0.06-约1厘米/升的高度体积比、约1巴-5巴的进气压力、约20个进口 /平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度、约 0. 05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率；和约20立方毫米-约1800立 方毫米的进口气泡体积。
15.权利要求2的设备，其中所述高度体积比为约0.lcm/升-约升0. 5cm/升。
16.权利要求2的设备，其中所述高度体积比为约0.44cm/升。
17.权利要求2的设备，其中所述进气压力为约1.5巴-约4巴。
18.权利要求2的设备，其中所述进气压力为约1.5巴-约2. 5巴。
19.权利要求2的设备，其中所述进气口/横截面积密度为约40个/平方米-约60个 /平方米。
20.权利要求2的设备，其中所述进气口/横截面积密度为55个/平方米。
21.权利要求2的设备，其中所述通气速率为约0.07-0.10体积气体/体积培养基/分钟。
22.权利要求2的设备，其中所述通气速率为约0.9体积气体/体积培养基/分钟。
23.权利要求2的设备，其中所述进口气泡体积为约300立方毫米。
24.权利要求1的设备，其中所述一次性容器为透明和/或半透明的。
25.权利要求24的设备，其中所述容器由选自以下的材料制成聚乙烯、聚碳酸酯、聚 乙烯和尼龙共聚物、PVC和EVA。
26.权利要求25的设备，其中所述容器由超过一层的所述材料的层压材料制成。
27.权利要求1的设备，其进一步包含用于支撑所述设备的支承结构。
28.权利要求27的设备，其中所述支承结构包含具有圆锥形底部的刚性圆筒结构。
29.权利要求1的设备，其中所述收获口位于所述容器底端的底部。
30.权利要求1的设备，其中所述收获口位于所述容器底端的底部附近，以至于在每个 收获周期结束时，所述含细胞和/或组织的培养基的所述剩余物自动保留在所述容器的所 述底端至所述收获口的下水平之间。
31.权利要求1的设备，其中所述底端为大体上的圆锥形。
32.权利要求1的设备，其中所述底端为大体上的截头圆锥形。
33.权利要求1的设备，其中所述容器包含约400升-约30000升、优选约500升-8000 升并优选约1000升的内部可填充体积。
34.权利要求1的设备，其中不通过机械通气和混合装置来实现培养基的通气和混合。
35.权利要求34的设备，其中所述机械通气和混合装置为叶轮。
36.用于在大于400升的体积中培养和收获植物组织和/或植物细胞的方法，所述方法 包括(a)提供具有至少400升体积并配置有换气口和收获口的一次性非刚性容器，所述换 气口和收获口使所述设备能够连续使用至少两个连续培养/收获周期，其中所述设备经过 设计和构建用于保持适于培养所述植物组织和/或细胞的氧饱和度和剪切力；和(b)经由所述收获口提供接种物；(c)提供无菌培养基和/或无菌添加剂；(d)任选地用外部光源照明所述容器；和(e)使所述细胞和/或组织能够在所述培养基中生长到所需产量。
37.权利要求36的方法，其中通过组合以下参数值或值范围来维持所述氧饱和度和剪 切力a)高度体积比；b)进气压力；c)进气口/横截面积密度；d)进口通气速率；和e)进口气泡体积。
38.权利要求37的方法，其中所述参数值或值范围选自以下值或值范围中的至少一种a)约0.06-约1厘米/升的高度体积比；b)约1巴-5巴的进气压力；c)约20个进口/平方米-约70个进口 /平方米的进气口 /横截面积密度；d)约0.05-0. 12体积气体/体积培养基/分钟的进口通气速率；和e)约20立方毫米-约1800立方毫米的进口气泡体积。
39.权利要求36的方法，其中所述稳态氧饱和度为至少15%体积/所述容器中含有的 液体体积。
40.权利要求37的方法，其中所述高度体积比为约0.lcm/升-0. 5cm/升。
41.权利要求37的方法，其中所述高度体积比为约0.44cm/升。
42.权利要求37的方法，其中所述进气压力为约1.5巴-约4巴。
43.权利要求37的方法，其中所述进气压力为约1.5巴-约2. 5巴。
44.权利要求37的方法，其中所述进气口/横截面积密度为约40/平方米-约60个/ 平方米。
45.权利要求35的方法，其中所述进气口/横截面积密度为55个/平方米。
46.权利要求37的方法，其中所述通气速率为约0.07-0. 10体积气体/体积培养基/ 分钟。
47.权利要求37的方法，其中所述通气速率为约0.09体积气体/体积培养基/分钟。
48.权利要求37的方法，其中所述进口气泡体积为约300平方毫米。
49.权利要求36的方法，所述方法进一步包括检查污染物和/或在所述容器中生产的细胞/组织的质量若发现污染物或所生产的 细胞/组织质量不好，则丢弃所述设备及其内容物；若未发现污染物，则收获所述含细胞和/或组织的培养基部分。
50.权利要求49的方法，其中虽然收获所述部分，但留下含细胞和/或组织的培养基剩 余物在所述容器中，其中所述培养基剩余物用作下一个培养/收获周期的接种物。
51.权利要求49的方法，所述方法进一步包括提供无菌培养基和/或无菌添加剂用于下一个培养/收获周期；和 重复生长周期直到发现所述污染物或生产的细胞/组织质量不好，此时丢弃所述设备 及其内容物。
52.权利要求36的方法，其中在至少一个培养/收获周期始终通过所述换气口连续供给无菌空气。
53.权利要求36的方法，其中在至少一个培养/收获周期期间通过所述多个进气口以 脉冲方式供给所述无菌空气。
54.植物细胞培养系统，所述系统包含权利要求1的设备和适于培养所述植物组织和/ 或细胞的培养基。
55.权利要求54的植物细胞培养系统，所述系统进一步包含在所述培养基中生长的植 物细胞悬浮液或组织培养物。
56.权利要求55的植物细胞培养系统，其中所述植物细胞表达重组蛋白。
57.权利要求54的植物细胞培养系统，其中所述植物细胞培养物包含由植物根获得的 植物细胞。
58.权利要求55的植物细胞培养系统，其中所述植物细胞选自发根农杆菌转化的根细 胞、芹菜细胞、生姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
59.权利要求55的植物细胞培养系统，其中所述植物细胞为烟草细胞。
60.权利要求59的植物细胞培养系统，其中所述烟草细胞为烟草(Mcotiana tabaccum)
61.权利要求59的植物细胞培养系统，其中所述细胞表达人重组乙酰胆碱酯酶。
62.权利要求61的植物细胞培养系统，其中所述人重组乙酰胆碱酯酶为乙酰胆碱酯 酶-R。
全文摘要
本发明提供用于培养植物组织或细胞的可重复使用的一次性设备，所述设备包括具有以下尺寸和气体交换口的非刚性容器所述尺寸和气体交换口经过设计用于保持适于在400升或更多培养基中培养植物组织和/或细胞的氧饱和度和剪切力。本发明还提供用于使用本说明书的一个实施方案的一次性设备在植物细胞中制备具催化活性的人重组蛋白的方法。
文档编号C12M3/00GK101861382SQ200880023649
公开日2010年10月13日 申请日期2008年5月5日 优先权日2007年5月7日
发明者A·什泰尼茨, Y·什尼奥尔, Y·内奥斯, Y·柯什纳, Y·沙尔蒂尔 申请人:普罗塔里克斯有限公司