专利名称：：产生发酵产物的方法
技术领域：
：本发明涉及使用发酵生物从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法。在第一方面，本发明涉及将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法，其包括使用获得自发酵含淀粉材料的过程(例如乙醇产生过程)的发酵生物发酵所述材料。本发明还涉及获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物在将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法中的用途。附图简述图1显示PCS发酵的重量损失作为投料(pitch)水平和时间的函数。图2显示PCS发酵24小时之后消耗的葡萄糖的乙醇当量与实现的乙醇当量的比较。图3显示在PCS发酵的第1天和第2天的甘油产生。图4显示48小时之后的葡萄糖和乙醇转化作为醪龄(mashage)和投料的函数。发明详述—般而言，使能够从可发酵的糖(包括葡萄糖)产生发酵产物的发酵生物在精确条件下以特定生长速率生长。在将所述发酵生物引入或加入发酵培养基时，接种的发酵生物历经许多阶段。最初的阶段称作"迟滞期(lagphase)"，并可以认为是一段适应期。在接下来的称作"指数期"的阶段中，生长速率逐渐提高。在一段时间的最大限度生长之后，速度停止，发酵生物进入"稳定期(stationaryphase)"。在又一段时间过后，发酵生物进入"死亡期"，在"死亡期"中大量活细胞衰亡(decline)。本发明涉及将材料发酵成期望的发酵产物的方法，所述材料源自含木素纤维素材料，优选经预处理的含木素纤维素材料，特别是经水解的经预处理的含木素纤维素材料。更精确而言，本发明涉及将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法，其包括在获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物存在下发酵所述材料。例如，所述发酵生物可以是在下文"发酵生物"部分中披露的发酵生物中的任一。在特别预期的优选实施方案中，所述发酵生物是获得自将含淀粉材料发酵成醇(如乙醇)的方法的酵母。待发酵的材料可以优选是经预处理的和/或经水解的含木素纤维素材料。例如，在乙醇产生的情况，所述材料将含有可发酵的糖，诸如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖，其能够被直接或间接发酵成期望的发酵产物。本发明的优势之一是发酵生物能够重复使用。这降低了发酵生物的成本，并因而降低了产生期望的发酵产物如乙醇的成本。可以以任何合适的方式将所述发酵生物从基于淀粉的发酵过程转移至发酵含木素纤维素材料的过程。在同一生产地点存在基于含淀粉材料和含木素材料的生产的情况下，可以将所述发酵生物简单地从基于含淀粉材料的发酵罐/容器导向基于含木素纤维素材料的发酵罐/容器。在一个实施方案中，可以将来自基于淀粉的发酵的发酵生物以含发酵生物的发酵液/培养基的形式加入基于木素纤维素的发酵液/培养基。这意味着将所述发酵液/培养基从基于淀粉的发酵罐/容器直接导向基于木素纤维素的发酵罐/容器。根据本发明，淀粉和/或木素纤维素发酵可以在至少50升的罐/容器中进行。在本发明的多个实施方案中，所述来自基于淀粉的发酵的含发酵生物的发酵液/培养基可以构成l-90wt.X，优选2-80wt.X，例如5-70wt.%，例如优选l_25wt.X，更优选2-20wt.%，例如5-10wt.%的待发酵的含木素纤维素材料。在一个优选的实施方案中，可以将所述来自基于淀粉的发酵的发酵生物用作唯一的发酵生物来源。在另一实施方案中，来自基于淀粉的发酵的发酵生物可为对从(例如，常规)繁殖罐直接接种的发酵生物(培养物)的补充。来自基于淀粉的发酵的所述含发酵生物的发酵液/培养基可以构成发酵生物接种物总量的O以上至100%，优选30-100wt.%，优选50-100wt.%，更优选80_100wt.%，特别是90-lOOwt.%，所述接种物用于发酵源自含木素纤维素(起始)材料的材料(经预处理和/或经水解的材料)。可选地，所述发酵生物在被转移和用于发酵源自木素纤维素的材料之前，可以使用任何合适的手段(例如，通过离心和/或过滤)，从基于淀粉的发酵液/培养基分开、分离和/或浓縮。例如，分开、分离和/或浓縮可以导致发酵液/培养基的大部分液体部分得到去除。可以将基于淀粉的发酵液/培养基中任何不想要的组分去除。也可以以任何合适的方式处理所述发酵液/培养基。在一个实施方案中，离心使用沉降式离心机进行。过滤可以使用压滤机(filterpress)进行，例如板式或框式压滤机。然而，在一个优选的实施方案中，将含发酵生物的发酵液/培养基按原样(asis)使用，即，完全不进行任何处理，或者例如浓縮。发酵生物可以取自基于淀粉的发酵，并且在基于淀粉的发酵中的所述发酵生物的迟滞期之后将其加入基于木素纤维素的发酵。在多个实施方案中，当将发酵生物转移/引入本发明的基于含木素纤维素材料的发酵过程时，所述发酵生物处于"指数期"、"稳定期"和/或"死亡期"中的任一时期。在一个优选的实施方案中，所述发酵生物在转移至本发明的基于含木素纤维素材料的发酵过程中时处于指数期。在一个优选的实施方案中，所述发酵生物在转移至本发明的基于含木素纤维素材料的发酵过程中时处于稳定期。在一个具体的实施方案中，发酵生物取自基于淀粉的发酵，并且在发酵2-72小时之后，诸如2小时之后，诸如12小时之后，诸如24小时之后或48小时发酵之后，将所述发酵生物加入基于木素纤维素的发酵。例如，实施例1示例了如果期望的是快速发酵，那么使用12小时醪液(mash)比其它醪液繁殖物更有利。在一个实施方案中，将发酵生物加入基于含木素纤维素材料的发酵从而使每mL发酵液/培养基的活酵母计数为105_1012，优选107-l(T，特别是大约5xl07。应理解的是根据本发明，可以在发酵开始之前和/或在发酵过程中，将所述发酵生物或含发酵生物的发酵液/培养基加入经预处理和/或经水解的含木素纤维素材料。在另一实施方案中，依据本发明的第一方面，从基于含淀粉材料的发酵过程获得并且加入(第一)基于含木素纤维素材料的发酵过程的发酵生物可以用于投料(Pitch)另外的基于含木素纤维素材料的发酵过程。预期由所述(第一)基于含木素纤维素材料的发酵过程加入的发酵生物可以构成在另外的(特别是第二)基于含木素纤维素材料的发酵过程中待发酵的含木素纤维素材料的l-90wt.%，优选2-80wt.%，诸如5-70wt.%，诸如优选l-25wt.X，更优选2-20wt.%，诸如5-10wt.%。此处所述发酵生物同样优选取自迟滞期之后，优选取自指数期和/或稳定期。在一个实施方案中，本发明涉及如下的方法，在该方法中如上限定的所用发酵生物的至少一部分获得自从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括步骤i)液化含淀粉材料，ii)用——禾中或多禾中糖源生成醇(carbohydrate—sourcegeneratingenzyme)糖化所述经液化的材料，iii)用发酵生物发酵所述经糖化的材料。步骤ii)和iii)可以同时或顺次进行。在步骤i)中，将所述含淀粉材料加热至糊化温度(gelatinizationtemperature)以上的温度。可以通过使所述含淀粉材料受到a-淀粉酶的作用来液化步骤i)中经糊化的含淀粉材料。在一个实施方案中，可以使用a-淀粉酶，优选细菌a-淀粉酶，特别是芽孢杆菌属(Bacillus)a-淀粉酶来液化所述含淀粉材料。在多个优选的实施方案中，所述芽孢杆菌属a-淀粉酶可以源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus咖yloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热月旨肪芽抱杆菌(Bacillusstearothermophilus)或枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)的菌株。可以使用糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶来糖化步骤ii)中经液化的材料。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属(Aspergillus)，包括泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或黑曲霉(Aspergillusniger)，或踝节菌属(Talaromyces)，诸如埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)的菌株，或阿太菌属(Athelia)，诸如罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及如下方法，在该方法中发酵生物的至少一部分获5得自从含淀粉材料产生发酵产物的方法，其包括步骤(a)用一种或多种糖源生成酶在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度糖化含淀粉材料，(b)使用发酵微生物发酵。在一个实施方案中，步骤(a)可以进一步在a-淀粉酶，优选真菌a-淀粉酶，特别是酸性真菌a-淀粉酶存在下进行。在多个优选的实施方案中，a-淀粉酶可以源自曲霉属，包括川地曲霉(Aspergilluskawachii)、黑曲霉禾口米曲霉(Aspergillusoryzae)的菌株，或源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilusgiganteus)或微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)的菌株(W02004/055178，通过提述并入)。糖源生成酶可以优选为葡糖淀粉酶。所述葡糖淀粉酶可以是上文所述的葡糖淀粉酶中的一种或多种，包括大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)、纸质厚包孑L菌(Pachykytosporap即yracea)禾口辧环栓菌(Tr咖etescingulata)，其全部在W02006/069289中公开。*體鹿通常，所考虑的含淀粉材料可以是任何含淀粉材料，其包括但不限于谷类，优选是整谷粒(wholegrain)，其来自玉米、木薯(cassava)、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)和马铃薯；或其任意组合。勉穀千歸鹿(料固在本发明的上下文中考虑任何合适的含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可以是任何含有木素纤维素的材料。在一个优选的实施方案中，所述含木素纤维素材料含有至少50wt.%，优选至少70wt.%，更优选至少90wt.%木素纤维素。应理解的是，所述含木素纤维素材料也可以包含其它组分，诸如纤维素材料，如纤维素或半纤维素，并且也可以包含诸如糖(如可发酵的糖和/或不可发酵的糖)、蛋白质等组分。在本发明的上下文中所考虑的材料将被称作"含木素纤维素材料"或者"生物质"。木素纤维素是糖类聚合物(纤维素和半纤维素)和木质素的异源复合物(heterogeneouscomplex)。木质素是强化木素纤维素的不溶性、高分子量的芳族醇物质。木质素通常含有三种芳族醇(松柏醇(coniferylalcohol)、芥子醇(sin即yl)和对-香豆醇(p-co咖aryl))。另外，草和双子叶植物的木质素还含有大量酚酸，诸如对_香豆酸和阿魏酸，它们与彼此的醇基并与其它醇(如芥子醇和对-香豆醇)的醇基进行酯化。木质素进一步与半纤维素和纤维素二者连接，在后两种成分周围形成物理密封，即一种无法穿透的屏障，防止溶液和酶的渗入(Howard等，2003，AfricanJournalofBiotechnology2(12):602-619)。纤维素是简单糖葡萄糖通过P-l，4-连接共价键合的聚合物。纤维素，像淀粉一样，是葡萄糖的均质聚合物。然而，与淀粉不同，纤维素的特定结构倾向于将聚合物链安排成紧密压縮、高度结晶的结构，该结构是水不溶性的并且对解聚是抗性的。半纤维素(依赖于种类)是用阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖(furose)、甘露糖、葡萄糖或葡糖醛酸取代的葡萄糖或木糖的支化聚合物(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686)。含木素纤维素材料通常存在于，例如，植物的茎、叶、外皮(hull)、外壳(husk)和穗轴(cob)中，或树的叶、枝和木材中。含木素纤维素材料也可以是，但不限于，草本材6料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸以及纸浆和造纸工厂残余物(pulpandp即ermillresidue)。在本文中的理解是含木素纤维素材料可为在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁的形式。在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料选自下组玉米纤维、稻草(ricestraw)、松树的木材、木屑/木花(woodchip)、白杨木(poplar)、麦秆(wheatstraw)、柳枝稷(switchgrass)、甘蔗渣(bagasse)、造纸和纸桨加工废物。其它实例包括玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、硬木(如白杨木和桦木)、软木、谷类的茎秆(诸如麦秆)、芒草属(Miscanthus)、市政固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸、或其混合物。在一个优选的方面，所述材料是玉米秸秆和/或玉米穗轴。在另一优选的方面，所述材料是玉米纤维。预处理在进行水解和/或发酵之前可以有利地对所述含木素纤维素材料进行预处理。在本发明的一个优选实施方案中，在发酵之前和/或在发酵过程中，将所述经预处理的材料水解，优选以酶水解。预处理通常导致纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。预处理的目的是改进酶水解的速率和/或增加发酵产物产率。可以使用本领域熟知的常规方法对本发明的待发酵的含木素纤维素材料进行预处理。在一个优选的实施方案中，预处理可以在含水桨料中进行。在预处理过程中所述材料可以以10-80wt.X，优选20-50wt.%的量存在。大量的预处理方法或它们的组合是本领域熟知的并且可以根据本发明使用。化学、机械和/或生物预处理可以在水解和/或发酵之前以化学、机械和/或生物方法对所述含木素纤维素材料进行预处理。机械处理(通常称作"物理"处理)可以单独使用或与后续或同步水解(特别是酶水解)组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。优选地，在水解和/或发酵之前进行化学、机械和/或生物预处理。或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，诸如与一种或多种纤维素分解酶的加入同时进行，例如，所述一种或多种纤维素分解酶与下述其它酶活性组合，从而释放可发酵的糖，诸如葡萄糖和/或麦芽糖。在本发明的一个实施方案中，对所述经预处理的含木素纤维素材料进行解毒和/或洗涤。这可以改进可发酵性，例如，经稀酸水解的含木素纤维素材料(如玉米秸秆和/或玉米穗轴)的可发酵性。在一个实施方案中，解毒是通过汽提(steamstri卯ing)进行的。化学预处理根据本发明"化学预处理"是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括使用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳的处理。另外，湿氧化(wetoxidation)和pH受控的水热解(hydrothermolysis)也是所考虑的化学预处理。优选地，所述化学预处理是酸处理，更优选地，是连续的稀酸和/或弱酸(mildacid)处理，如用硫酸，或另一有机酸诸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物的处理。也可以使用其它酸。弱酸处理在本发明的上下文中是指处理pH处于l-5，优选pH1-3。在一个具体的实施方案中，所述酸的浓度为O.1-2.Owt.%的酸，优选硫酸。可以将所述酸与本发明的待发酵材料混合或接触，并且可以将所述混合物在160-22(TC，诸如165-195t:的温度保持数分钟至数秒的时间，例如，1-60分钟，诸如2-30分钟或3-12分钟。可以应用强酸如硫酸的加入来去除半纤维素。这使纤维素的可消化性增强。纤维素溶剂处理也是本发明所考虑的，已显示其将大约90%的纤维素转化成葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时酶水解能够大幅增强。碱、&02、臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用含水醇(aqueousalcohol)中的(A1)2S04、FeCl3、路易斯酸)、甘油、二噁烷(dioxane)、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686)。使用碱例如Na0H、Na2C03和/或氨等的碱性化学预处理也在本发明的范围内。使用氨的预处理方法在例如W02006/110891、W02006/110899、W02006/110900和W02006/110901中描述，将它们通过提述并入本文。湿氧化技术涉及氧化剂的使用，所述氧化剂诸如基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括使用匿SO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行l-60分钟，如5-30分钟，但也可以进行更长或更短的时间，其取决于要预处理的材料。合适预处理方法的其它实例由Schell等，2003，A卯l.BiochemandBiotechn.105-108:69_85，禾口Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686，和美国申请公开No.2002/0164730描述，将它们通过提述全部并入本文。机械预处理如在本发明中所使用的，术语"机械预处理"是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理处理。例如，机械预处理包括多种类型的磨制、照射、汽蒸/蒸汽爆炸和水热分解(hydrothermolysis)。机械预处理包括粉碎(机械减小颗粒大小)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratoryballmilling)。机械预处理可以包括高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压是指范围在300-600psi，优选400-500psi，诸如大约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温是指范围在大约100-30(TC，优选大约140-235°C的温度。在一个优选的实施方案中，机械预处理是一种分批过程的蒸汽枪水解仪系统(abatch-process，steamg皿hydrolyzersystem)，其使用如上限定的高压禾口高温。为此可使用Sunds水解仪(可从SundsDefibratorAB(Sweden)获得)。组合的化学和机械预处理在一个优选的实施方案中，进行化学和机械两种预处理，其包括例如稀酸或弱酸处理以及高温和高压。化学和机械预处理可以根据需要顺次进行或同时进行。因此，在一个优选的实施方案中，对所述含木素纤维素材料进行化学和机械两种预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。在一个优选的实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一优选的实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(或AFEX预处理步骤)进行。生物预处理如本发明中所使用的，术语"生物预处理"是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从木素纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanol-ProductionandUtilization,Wyman，C.E.编，Taylor&Francis,Washington,DC，179—212;Ghosh禾卩Singh，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel，Baker禾口0verend编，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，第15章；Gong，Cao，Du禾口Tsao，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Sch印er，T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;01sson，L.禾口Hahn_Hagerdal，1996，Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312—331;及Vallander禾口Eriksson,1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。水解在本发明的发酵过程之前和/或过程中，可以水解所述含木素纤维素材料，优选经预处理的含木素纤维素材料，从而打破木质素密封并破坏纤维素的晶态结构。在一个优选的实施方案中，水解通过酶进行。根据本发明，要发酵的所述含木素纤维素材料，优选经预处理的含木素纤维素材料已经经过水解或者被水解，所述水解通过一种或多种水解酶(根据酶命名法为EC3类)，优选一种或多种选自下组的糖酶纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶，如a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶。用于水解的酶能够直接或间接将糖类聚合物转化成可发酵的糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖，能够将它们发酵成期望的发酵产物，如乙醇。在一个实施方案中，水解使用纤维素分解酶进行。在一个优选的实施方案中，水解使用纤维素分解酶制备物进行，所述制备物还包含一种或多种具有增强纤维素分解的活性的多肽。在一个优选的实施方案中，所述具有增强纤维素分解的活性的多肽是家族GH61A来源的多肽。合适的和优选的纤维素分解酶制备物和具有增强纤维素分解的活性的多肽的实例在下文"纤维素分解酶"部分和"增强纤维素分解的多肽"部分中描述。半纤维素聚合物能够通过半纤维素分解酶和/或酸水解分解以释放它的五碳糖和六碳糖组分。六碳糖(己糖)，诸如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，能够通过合适的发酵生物(包括酵母)容易地发酵成发酵产物如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、延胡索酸等。酶处理可以在合适的含水环境中在能够由本领域技术人员容易地确定的条件下进行。在一个优选的实施方案中，水解在所述酶的最适条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件等能够由本领域技术人员容易地确定。优选地，水解在30-70°C，优选40-60°C，特别是大约5(TC进行。本发明的方法优选在pH3_8，优选pH4-6，特别是大约pH5进行。优选地，将水解进行8-72小时，优选12-48小时，特别是大约24小时。对源自木素纤维素的材料的发酵按照如上所述本发明的发酵方法进行。在一个优选的实施方案中，所述糖酶具有纤维素分解酶活性。合适的酶在下文"酶"部分中描述。9酶即使在本发明方法的上下文中没有具体提及，也应该理解的是所述酶以有效量使用。纤维素分解酶如本文所使用的术语"纤维素分解酶"应理解为包括纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和P-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。关于这些酶的其它详细内容参见下文的相关部分。为了效率，纤维素的消化可能要求几种类型的酶的共同作用。将纤维素转化成葡萄糖通常需要至少三类酶内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其随机切割纤维素链；纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)，其从纤维素链末端切割纤维二糖基单元(cellobiosylunit);和P-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化成葡萄糖。在参与纤维素的生物降解的这三类酶中，纤维二糖水解酶是降解天然晶态纤维素的关键酶。术语"纤维二糖水解酶I"在本文定义为纤维素1，4-P-纤维二糖苷酶(cellulose1，4-13-cellobiosidase)(也称作外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或1，4_|3-纤维二糖水解酶)活性，如酶分类EC3.2.1.91中所限定，其催化纤维素和纤维四糖中通过从链的非还原端释放纤维二糖来进行的1，4-P-D-糖苷键的水解。术语"纤维二糖水解酶II活性"的定义是相同的，只是纤维二糖水解酶II从链的还原端进行攻击。所述纤维素分解酶可以包含糖结合模块(CBM)，其增强酶与含木素纤维素的纤维的结合并增加酶的催化活性部分的效力。将CBM定义为具有糖结合活性的、有谨慎折叠的、糖活性酶内的连续氨基酸序列。关于CBM的更多信息，参见CAZy因特网服务器(见上文)或Tomme等，1995，于EnzymaticDegradationofInsolublePolysaccharides(Saddler禾卩Pe皿er编)，Cellulose-bindingdomains:classificationandproperties,142-163页，AmericanChemicalSociety,Washington。在一个优选的实施方案中，所述纤维素分解酶可以是美国申请no.60/941，251中限定的纤维素分解制备物，将所述申请通过提述并入本文。在一个优选的实施方案中，包含具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A)的纤维素分解制备物优选是WO2005/074656(通过提述并入本文)中公开的橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A。所述纤维素分解制备物可以进一步包含P-葡糖苷酶，如源自曲霉属、青霉属(PeniciIlium)或木霉属(Trichoderma)的菌株的P_葡糖苷酶，包括美国申请no.11/781，151或PCT/US2007/074038(Novozymes)中公开的特异腐质霉(Humicolainsolens)CEL45A内切葡聚糖酶核心/米曲霉P-葡糖苷酶融合蛋白。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物也可以包含CBHII，优选土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物还包含纤维素酶制备物，优选源自里氏木霉(Trichodermareesei)的一种纤维素酶制备物。在一个优选的实施方案中，纤维素分解活性可以源自真菌来源，诸如木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；或腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含WO2005/074656中公开的具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A);纤维二糖水解酶，诸如土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)，P-葡糖苷酶(例如，美国申请no.60/832，511中公开的融合蛋白)和纤维素分解酶，例如，源自里氏木霉的纤维素分解酶。在一个实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含WO2005/074656中公开的具有增强纤维素分解的活性的多肽(G朋1A);P-葡糖苷酶(例如，美国申请no.60/832，511中公开的融合蛋白)和纤维素分解酶，例如，源自里氏木霉的纤维素分解酶。在一个实施方案中，所述纤维素分解酶是商业上可得到的产品CELLUCLAST1.5L或CELLUZYME,其可获得自NovozymesA/S，Denmark或ACCELERASE1000(来自GenencorInc.USA)。可以添加纤维素分解酶用于水解经预处理的含木素纤维素材料。所述纤维素分解酶可以按O.l-100FPU每克总固体(TS)的剂量加入，优选O.5-50FPU每克TS，特别是l-20FPU每克TS。在另一实施方案中，使用至少lmg纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，诸如5-10mg纤维素分解酶用于水解。醜髓鹏(EG)内切葡聚糖酶(ECNo.3.2.1.4)催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、混合型P-l，3葡聚糖诸如谷类P-D-葡聚糖或木葡聚糖中的P-l，4键和其它含有纤维素部分的植物材料中1，4-P-D-糖苷键的水解。公认的名称为内-l，4-P-D-葡聚糖4-葡糖水解酶，但是本说明书中使用縮略术语内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶活性可以使用羧甲基纤维素(CMC)水解按照Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59:257-268的方法测定。在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶可以源自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。纤维二糖水解酶(CBH)术语"纤维二糖水解酶"意指1，4-13-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含P-l，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-P-D-葡糖苷键的水解，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。纤维二糖水解酶的实例在上文提及，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBHI和CBHII;和来自土生梭孢霉纤维二糖水解酶(CELL6A)的CBHII。纤维二糖水解酶活性可以根据Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149:152-156;Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBSLetters187:283-288描述的方法来测定。Lever等的方法适合用于评定玉米秸秆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等的方法适合用于测定对荧光二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。13-葡糖苷酶术语"P-葡糖苷酶"意指I3-D-葡萄糖苷葡糖水解酶(P-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原P_D_葡萄糖残基的水解并释放P-D-葡萄糖。就本发明而言，根据由Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法测定P_葡糖苷酶活性，但采用如本文所述的不同的条件。将一个单位的P-葡糖苷酶活性定义为在50°C，pH5从100mM柠檬酸钠、0.01%TWEEN20中作为底物的4mM对硝基苯基-13-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1微摩尔对硝基酚。在一个优选的实施方案中，所述P-葡糖苷酶是真菌来源的，如曲霉属、青霉属或木霉属的菌株。在一个优选的实施方案中，P_葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgl1基因编码的P-葡糖苷酶(参见EP562003的图l)。在另一优选的实施方案中，P-葡糖苷酶源自米曲霉(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(根据WO02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)或黑曲霉(1981，J.Appl.3:157-163)。土,千歸德白勺藩术语"增强纤维素分解的活性"在本文定义为使具有纤维素分解活性的蛋白质对源自木素纤维素的材料的水解增强的生物活性。就本发明而言，通过测量与使用相等总蛋白加样量但不含增强纤维素分解的活性的对照水解(l-50mg的纤维素分解蛋白/gPCS(经预处理的玉米秸秆)中的纤维素)相比，来自在如下条件下纤维素分解蛋白对源自木素纤维素的材料(例如，经预处理的含木素纤维素材料)的水解的还原糖增加或总的纤维二糖和葡萄糖的增加来测定增强纤维素分解的活性l-50mg总蛋白/gPCS中的纤维素，其中总蛋白由80-99.5%w/w纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素和0.5-20%w/w具有增强纤维素分解的活性的蛋白组成，在5(TC进行1-7天。所述具有增强纤维素分解的活性的多肽通过将达到相同水解程度所需要的纤维素分解酶量降低优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍，更优选至少0.3倍，更优选至少0.4倍，更优选至少0.5倍，更优选至少1倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍，更优选至少20倍，甚至更优选至少30倍，最优选至少50倍，并且甚至最优选至少100倍，而使具有纤维素分解活性的蛋白质催化的源自木素纤维素的材料的水解增强。在一个优选的实施方案中，水解和/或发酵在与具有增强活性的多肽组合的纤维素分解酶存在下进行。在一个优选的实施方案中，所述具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO2005/074647公开了来自土生羧孢霉的具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其多核苷酸。WO2005/074656公开了来自橙色嗜热子囊菌的具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其多核苷酸。美国申请公开No.2007/0077630公开了来自里氏木霉的具有增强纤维素分解的活性的分离的多肽及其多核苷酸。半纤维素分解酶根据本发明，可以使经预处理的含木素纤维素材料进一步受到一种或多种半纤维素分解酶，例如一种或多种半纤维素酶的作用。半纤维素能够通过半纤维素酶和/或酸水解而被分解以释放其五碳糖和六碳糖组分。在一个实施方案中，可以将源自木素纤维素的材料用一种或多种半纤维素酶处理。可以使用适合在水解半纤维素(优选将半纤维素水解成木糖)中使用的任何半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、和它们中两种或更多种的混合物。优选地，在本发明中使用的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，所述半纤维素酶是能够在pH7以下，优选pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的外切作用的半纤维素酶。适合在本发明中使用的半纤维素酶的实例包括VISC0ZYME(可从NovozymesA/S，Denmark获得)。在一个实施方案中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可以优选是微生物来源的，如真菌来源(例如，曲霉属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属、多孔菌属、木霉属)或来自细菌(例如，芽孢杆菌属)。在一个优选的实施方案中，所述木聚糖酶源自丝状真菌，优选源自曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株；或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可以优选是内切-1，4-13-木聚糖酶，更优选是GH10或GH11的内切-1，4-13-木聚糖酶。商业化木聚糖酶的实例包括来自NovozymesA/S，Denmark的SHEARZYME和BI0FEEDWHEA。可以将所述半纤维素酶以有效水解半纤维素的量加入，例如，以总固体(TS)的大约0.001-0.5wt.%，更优选TS的大约0.05-0.5wt.%的量加入。可以将木聚糖酶以O.001-1.0g/kgDM(干物质)底物的量，优选以O.005-0.5g/kgDM底物，且最优选0.05-0.10g/kgDM底物的量加入。其它酶其它水解酶也可以存在于水解、发酵、SSF、HHF或SHF过程中。可以考虑的酶包括a-淀粉酶；葡糖淀粉酶或另一糖源生成酶，诸如P-淀粉酶、产麦芽淀粉酶和/或a-葡糖苷酶；蛋白酶；或它们中两种或更多种的混合物。源自木素纤维素的材料的发酵含木素纤维素材料的发酵可以以任何合适的方式进行。根据本发明，发酵可以包括用至少一种能够发酵可发酵的糖(如葡萄糖和/或麦芽糖)的发酵生物投料经预处理和/或经水解的含木素纤维素材料浆料。合适的条件依赖于所述发酵生物、底物和期望的产物。本领域技术人员能够简单地确定什么是合适的发酵条件。SSF、HHF禾PSHF在一个优选的实施方案中，水解和发酵作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。这通常是指在对于所述发酵生物合适的(优选最佳)条件(例如，温度和/或pH)下进行组合的/同时水解和发酵。在另一优选的实施方案中，将水解步骤和发酵步骤作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤是酶促纤维素糖化步骤，其通常在对于所述水解酶合适的(优选最佳)条件下(例如，在较高的温度下)进行。随后的同时水解和发酵步骤通常在对于发酵生物合适的条件下进行(常常在比单独的水解步骤更低的温度下)。最终，所述水解和发酵步骤也可以作为单独的水解和发酵进行，其中在发酵开始之前完成水解。这常常称作"SHF"。对于酵母发酵，如用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的发酵，所述发酵可以持续进行24-96小时，特别是35-60小时。在一个实施方案中，发酵在20_40°C，优选26-34t:，特别是大约32t:的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH3-6，优选大约pH4_5。本发明的方法可以作为分批方法或作为连续方法实施。本发明的发酵方法可以在超滤系统中进行，在该系统中将渗余物(retentate)保持在存在固体、水和发酵生物的再循环中，并且在该系统中的渗透物是含有发酵产物的液体。同样可以考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行所述方法，并且其中将渗余物保持在存在固体、水、发酵生物的再循环中，且其中渗透物是含有发酵产物的液体。在发酵之后，可以将发酵生物从发酵的浆料分离并再循环至含木素纤维素的浆料。M^:在发酵之后，可以将发酵产物从经发酵的含木素纤维素浆料分离。可以蒸馏浆料以提取发酵产物或发酵产物可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基/发酵液提取。或者可以通过气提回收所述发酵产物。用于回收的方法是本领域熟知的。发酵产物本发明的发酵方法可以用于产生任何发酵产物，包括醇(例如，乙醇、甲醇和丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和C02);抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、|3-胡萝卜素)；和激素。还可以考虑的产物包括可消费的醇工业产品，例如，啤酒和葡萄酒(wine);乳品类工业产品，例如，发酵型乳制品；皮革工业产品和烟草工业产品。在一个优选的实施方案中，所述发酵产物是醇，特别是乙醇和丁醇。根据本发明获得的发酵产物，如乙醇，优选可以用作燃料。然而，在乙醇的情况下，其也可以用作可饮用乙醇。发酵生物术语"发酵生物"是指任何生物，包括细菌和真菌生物，如酵母和丝状真菌，其适合用于产生期望的发酵产物。根据本发明特别合适的发酵生物能够将糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖，直接或间接地发酵，即转化成期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株；假丝酵母属(ge皿sCandida)的菌株，特别是阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)、Candidasonorensis、热带假丝酵母(Candidatropicalis)或产阮假丝酵母(Candidautilis)的菌株。其它可以考虑的酵母包括汉逊酵母属，特别是异常汉逊酵母(Hanse皿laanomala)或多形汉逊酵母(Hanse皿lapolymorpha)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfagilis)或马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxia皿s)的菌株，禾口裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特另U是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的菌株。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonasmobi1is)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特另U是产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)的菌株，禾口热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacterethanolicus)、马瑞氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobactermathranii)或热角牟糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)。预见乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株为热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)、谷氨酸棒杆菌R(CorynebacteriumglutamicumR)禾口热葡糖苷酶地芽包杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如酿酒酵母的菌株。在源自木素纤维素的材料的发酵方面，包括C5糖发酵生物。大多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母属的菌株，如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵细菌也是已知的。也有一些酿酒酵母菌株发酵C6(和C6)糖。实例是能够发酵C5糖的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括在例如Ho等，1998，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,第1852-1859页禾口Karhumaa等，2006，MicrobialCellFactories5:18中关注的菌株。在一个实施方案中，将所述发酵生物加入发酵培养基从而使活发酵生物(如酵母)在每mL发酵培养基中的计数为105-1012，优选107-l(T，特别是大约5x107。商业上可获得的酵母包括，例如，REDSTAR和ETHAN0LRED酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALI(可从Fleischmann'sYeast，USA获得)，SUPERSTART和THERM0SACC新鲜酵母(可从EthanolTechnology,WI，USA获得)，BI0FERMAFT和XR(可从NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA，USA获得)，GERTSTRAND(可从GertStrandAB，Sweden获得)和FERMI0L(可从DSMSpecialties获得)。用途在一个方面，本发明涉及获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物在将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的过程中的用途。所述发酵按照本发明的方法进行。可以考虑的含木素纤维素材料、发酵生物、发酵产物等在上文描述。材料和方法MM纤维素分解制备物A:纤维素分解组合物，其包含W02005/074656中公开的源自橙色嗜热子囊菌的具有增强纤维素分解的活性的多肽(GH61A);P-葡糖苷酶(美国申请no.11/781，151中公开的特异腐质霉CEL45A内切葡聚糖酶核心/米曲霉P-葡糖苷酶融合蛋白)；和源自里氏木霉的纤维素分解酶制备物。纤维素分解制备物A公开在共同待审的美国申请恥0/941，251(Novozymes)中。￡￡g:NRELPCS(生物质编号43:酸催化的、经蒸汽爆炸的(acid-catalyzed,steamexploded))酵母可从RedStar/Lesaffre，USA获得的REDSTARTM实施例实施例1脏雄龍魏辭中白條盡,干i蹄(PCS)雜进行本实验以测定用玉米醪接种的PCS发酵对乙醇生产力的作用。将未经洗涤的酸催化的、经蒸汽爆炸的PCS用纤维素酶(纤维素分解制备物A)以25wt.%总固体(TS)按1L规模在两个分开的反应器中于5(TC水解120小时。将所述反应器合并，得到大约89g/L的葡萄糖浓度，然后过滤通过0.45微米Whatman滤纸。按照表1中的实验设计利用经过滤的水解物。制备了过夜YPD繁殖物(prop)(lOOmL培养基中的200mgREDSTARTm酵母，在32°C环境室中搅拌14小时)并用于接种500g玉米醪发酵至5%w/w的水平。在第2、12、24和48小时去除玉米醪的部分。然后使用发酵液以2、5、10和20%w/v的水平接种10mLPCS水解物发酵。对于各种处理条件将发酵罐糖化0、24和48小时并在HPLC上测试糖和乙醇。将每种条件重复一次。监测发酵的重量损失。随后用重量损失修正HPLC数据。将10%的24小时醪液看作对照处理。表1.实验设计16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>殖物越成熟产率越高。本申请所描述并要求保护的发明不应受限于本申请公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意在说明本发明的某些方面。本发明的范围意图包括任何等同的实施方案。事实上，除了本申请明示和描述的那些之外，本领域技术人员根据前文的描述显然能想到本发明的各种修改形式。这样的修改形式也意欲落入所附权利要求书的范围。如有冲突，当以包括定义在内的本申请公开内容为准。本申请引用了多篇参考文献，在此通过提述将它们的公开内容完全并入本申请。权利要求将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法，包括使用获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物发酵所述源自含木素纤维素材料的材料。2.权利要求1的方法，其中将获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物加入源自含木素纤维素材料的材料。3.权利要求1或2的方法，其中在发酵之前和/或发酵过程中水解所述含木素纤维素材料。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在发酵之前所述含木素纤维素材料经过预处理或者经过预处理和/或酶水解。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述发酵生物获得自将含淀粉材料发酵成发酵产物的过程。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中加入源自含木素纤维素材料的材料的所述发酵生物包含在发酵培养基/发酵液中，所述发酵培养基/发酵液来自将含淀粉材料发酵成发酵产物的过程。7权利要求6的方法，其中所述含发酵生物的发酵液构成待发酵的含木素纤维素材料的l-90wt.X，优选2-80wt.X，诸如5-70wt.%，诸如优选l_25wt.X，更优选2-20wt.%，诸如5-10wt.%。8.权利要求6或7的方法，其中所述含发酵生物的发酵液构成用于发酵的发酵生物接种物总量的0-100%，优选50-100wt.X，更优选80-100wt.%，特别是90-100wt.%。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中将所述发酵生物在用于发酵所述源自含木素纤维素材料的材料之前从所述含发酵生物的发酵液分离。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中在发酵之前将所述含发酵生物的发酵培养基/发酵液浓縮。11.权利要求i-io中任一项的方法，其中将所述含发酵生物的发酵液按原样使用。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中在发酵之前和/或发酵过程中将所述发酵生物或含发酵生物的发酵液加入待发酵的材料。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中将所述发酵生物自发酵含淀粉材料的过程取出，并在所述发酵生物已经处于迟滞期之后再将其加入待发酵的材料。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中已经将所述含木素纤维素材料以化学和/或机械和/或微生物方法进行了预处理。15.权利要求1-14的方法，其中将获得自基于含淀粉材料的发酵过程并且加入(第一)基于含木素纤维素材料的发酵过程的发酵生物加入另一个基于含木素纤维素材料的发酵过程。16.权利要求1-15的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇或丁醇。17.获得自发酵含淀粉材料的过程的发酵生物在将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法中的用途。18.权利要求17的用途，其中所述发酵如权利要求1-16中任一项所限定的进行。19.权利要求17或18的用途，其中所述发酵产物是乙醇或丁醇。全文摘要本发明涉及将源自含木素纤维素材料的材料发酵成发酵产物的方法，其通过使用自发酵含淀粉材料的过程获得的发酵生物发酵所述源自含木素纤维素材料的材料来进行。文档编号C12C11/00GK101765655SQ200880100536公开日2010年6月30日申请日期2008年5月30日优先权日2007年5月31日发明者弗兰克·D·哈根森,马兹·T·史密斯申请人:诺维信北美公司