用于核酸指数式扩增的切口和延长扩增反应的制作方法

专利名称：用于核酸指数式扩增的切口和延长扩增反应的制作方法
技术领域：
本发明一般来说涉及短DNA或RNA序列在恒温下的快速指数式扩增。
背景技术：
随着人们对可快速检测有害物种的存在或确定目标区域遗传序列的系统的需要 指数式增大，体外诊断学领域快速扩展。现有分子诊断学主要检测生物标记物并且包括小 分子检测、基于免疫的分析和核酸测试。两个互补或实质上互补的核酸链之间的固有特异 性使得可使用单一 DNA或RNA序列进行快速特异性识别，其简单性使得核酸测试具有诱人 前景。用于疾病管控的对细菌和病毒威胁剂、遗传修饰食品、和单核苷酸多态性的鉴定只是 这些分子诊断工具的进展极为有利的少数领域。为满足这些不断增长的需求，人们已针对 这些特异性和灵敏性需求研发并调整核酸扩增技术。历史上，最常用的扩增技术是聚合酶链反应(PCR)，所述技术因其可靠性和特异性 已在许多情况下成为检测方法的黄金标准。此技术需要使各种温度循环以进行以下步骤 dsDNA变性，短寡核苷酸引物复性，以及通过热稳定聚合酶沿模板来延长引物。尽管工程中 的许多新进展已成功地将这些反应的时间缩短至20-30分钟，但仍然需要极高功率才能满 足这些热循环单元的需求。人们已研发出各种等温扩增技术来避免温度循环的需求。出于此需求，出现了 DNA 和RNA等温扩增两种技术。转录介导扩增(TMA)采用具有RNA酶活性的逆转录酶、RNA聚合酶、和在5’末端 具有启动子序列的引物。逆转录酶自引物合成cDNA，降解RNA靶，并在反向引物结合后合成 第二链。随后RNA聚合酶结合至dsDNA的启动子区域并转录新RNA转录物，所述转录物可 用作进一步逆转录的模板。反应可在20-30分钟内产生十亿倍扩增。此系统不如其它DNA 扩增技术稳定，并且因此不是现场可部署测试，因为在无菌实验室外普遍存在RNA酶。此扩 增技术非常类似于自我持续序列复制(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，但其所用酶 不同。单引物等温扩增(SPIA)也涉及多种聚合酶和RNA酶H。首先，逆转录酶沿RNA靶 延长嵌合引物。RNA酶H降解RNA靶并且使得DNA聚合酶可合成cDNA的第二链。随后RNA 酶H降解一部分嵌合引物以释放一部分cDNA并开放结合位点以供下一嵌合引物结合，并且 扩增过程再次进行所述循环。线性扩增系统可在约3. 5hr内扩增极低水平的RNA靶。Q-β复制酶系统是探针扩增方法。将与所选靶互补或实质上互补的探针区域插入MDV-IRNA中，所述RNA是Q-β复制酶的天然存在的模板。Q-β复制MDV-I质粒以使得合成 产物是Q-β复制酶模板自身，从而导致指数式扩增，只要针对模板的复制酶过量即可。因 为Q-β复制工艺如此灵敏并且不论是否存在靶都可扩增，因此需要多个洗涤步骤来清洗 非特异性结合复制质粒的样品。指数式扩增耗时约30分钟；然而，包括所有洗涤步骤在内 的总时间为约4小时。也已研发出多种等温DNA扩增技术。滚环扩增(RCA)是基于质粒和病毒的自然复 制来研发。引物沿环形模板延长，从而导致合成单链串联重复。捕获、洗涤和连接步骤对在 靶存在下优先环化模板和减少背景扩增是必需的。分枝扩增(RAM)添加级联引物以供额外 几何扩增。此技术涉及非特异性尺寸链的扩增，所述链为双链或单链。解旋酶依赖性扩增(HDA)利用热稳定解旋酶(Tte-UvrD)来解开dsDNA以产生单 链，所述单链随后可用于引物通过聚合酶进行的杂交和延长。热稳定HAD方法不需要非热 稳定HAD所需要的辅助蛋白。所述反应可在单一温度下实施，但结合引物的初始热变性可 生成更多产物。据报告，扩增长70-120个碱基对的产物的反应时间超过1小时。环介导扩增(LAMP)是灵敏特异性等温扩增方法，其采用具有链置换能力的热稳 定聚合酶和四种或以上种引物。所述引物设计为沿靶在正向和反向上连续复性。外引物的 延长置换已延长内引物以释放单链。各引物设计为具有发夹末端，其在置换后立即咬合成 发夹以促进自身引发和进一步聚合酶延长。其它环状引物可减少扩增时间，但会使反应混 合物变复杂。总之，LAMP是较难多重化(也就是说同时扩增不止一个靶序列)的扩增方法， 但据报导其由于具有多个必须与靶复性的引物而具有极高特异性，从而可促进扩增过程。 尽管反应是在等温条件下进行，但双链靶需要初始热变性步骤。扩增在25至50分钟内进 行并且产生不同长度的梯形产物。链置换扩增(SDA)是由沃克(Walker)等人在1992年所研发。此扩增方法使用两 组引物、链置换聚合酶、和限制性内切核酸酶。使用缓冲引物来置换首先延长的引物以产生 供下一引物结合的单链。限制位点存于引物的5’区域。将经硫醇修饰的核苷酸纳入合成 产物中以抑制合成链的裂解。此修饰在链中聚合酶可延长的引物侧产生切口位点。对于双 链靶来说，此方法需要初始热变性步骤。则在低于双链靶区域解链温度的温度下进行反应。 使用此方法通常在30-45分钟内扩增长60至100个碱基的产物。这些和其它扩增方法论述于(例如)以下文献中范尼斯，J(VanNess, J)等 人，PNAS2003,第100卷，第8册，第4504-4509页；陈，E. (Tan, Ε.)等人，分析化学 (Anal. Chem.) 2005，77，7984-7992 ；利兹德，P. (Lizard, P.)等人，自然生物技术(Nature Biotech. )，1998，6，1197-1202 ；纳富，Τ. (Notomi，T.)等人，NAR 2000，28，12，e63 ；和科恩， N. (Kurn, N.)等人，临床化学(Clin. Chem.) 2005，51 10，1973-1981。关于这些一般扩增技 术的其它参考文献包括(例如)美国专利第7112423号；第5455166号；第5712124号；第 5744311 号；第 5916779 号；第 5556751 号；第 5733733 号；第 5834202 号；第 5354668 号； 第5591609号；第5614389号；第5942391号；和美国专利公开案第US20030082590号；第 US20030138800 号；第 US20040058378 号；和第 US20060154286 号。

发明内容
本文提供扩增核酸靶序列的方法，所述方法依赖于切口和延长反应以在短于传统扩增反应(例如链置换扩增反应)的时间范围内扩增较短序列。本发明实施例包括(例 如)仅使用两个用来扩增靶序列的模板、一种或两种切口酶和聚合酶的在等温条件下进行 的反应。在实例性实施例中，聚合酶和切口酶具有耐热性，并且反应温度显著低于杂交靶区 域的解链温度。切口酶仅在双链二倍体中的一个链上切口，从而使得不需要像在习用链置 换扩增情形中那样纳入经修饰核苷酸。本发明方法不需要初始热变性步骤。在实例性实 施例中，由于反应简单，反应极易进行，不需要特殊设备(例如温度循环器)，并且可仅在约 2. 5至约10分钟内自基因组DNA将20-30聚体产物扩增IO8至IOiq倍。此外，在其它实例 性实施例中，所述方法能不实施单独逆转录步骤即扩增RNA。因此，本发明第一实施例中提供扩增双链核酸靶序列的方法，所述方法包含使包 含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述 正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补 的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点 和所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且 与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位 点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述 正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向 模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶； 其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向 和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩 增产物。在本发明某些实施例中，DNA聚合酶是耐热性聚合酶。在本发明其它实例中，聚合 酶和所述切口酶在最高37°C、42°C 2、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、或85°C的温度下稳定。 在某些实施例中，聚合酶在最高60°C下稳定。聚合酶可选自(例如)由以下组成的群组 Bst (大片段)、9° N、温特(VentR) (外)DNA聚合酶、热启动酶(Therminator)、和热启动 酶II。切口酶可在(例如)切口酶结合位点上游切口，或在实例性实施例中，切口酶可 在切口酶结合位点下游切口。在某些实施例中，正向和反向模板包含可通过相同切口酶识 别的切口位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。切口酶可选自(例如)由以下组成 的群组Nt. BspQI、Nb. BbvCi、Nb. BsmI,Nb. BsrDI,Nb. BtsI、NtAlwI、Nt. BbvCI、Nt. BstNBI、 Nt. CviPII, Nb. BpulOI、和 Nt. BpulOI。在本发明某些方面中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反 向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。DNA分子可为(例如)基因组DNA。DNA分子可选自(例如)由以下组成的群组 质粒、线粒体和病毒DNA。在某些实施例中，以与反向模板相同的浓度提供正向模板。在其 它实例中，所提供正向模板与反向模板的比率在1 100至100 1比率范围内。在本发明其它实例中，所述方法另外包含使用第二聚合酶。扩增可在(例如)恒 温下实施。此温度可为(例如)54°C至60°C。对于进行反应的时间长度，在某些实例中，可 将扩增反应物在恒温下保持1至10分钟。本发明另外包含通过(例如)选自由以下组成的群组的方法来检测扩增产物凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、T0T0-3、嵌入染料检测、 FRET、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧 光偏振、和侧向流动捕获。可使用(例如)固体表面方法来检测扩增产物，例如其中至少一 个捕获探针固定在结合所扩增序列之固体表面上。本发明可用于多重扩增。因此，例如，在本发明某些实施例中，能扩增至少两个靶 序列。“能扩增”意指扩增反应包含可扩增至少两个靶序列的适宜模板和酶。因此，例如，可 预备能检测至少两个靶序列的扩增反应，但可能实际上仅一个靶序列存于所测试样品中， 从而使得即使可能实际上仅一个序列进行了扩增，但两个序列都能扩增。或者，倘若存在两 个靶序列，则扩增反应可导致两个靶序列都扩增。多重扩增反应可导致其所包含适宜模板 和酶所针对的一个、某些、或所有靶序列发生扩增。例如，至少一个模板可包含间隔子、阻断基团或经修饰核苷酸。也提供扩增单链核酸靶序列的方法来作为本发明一实施例，其包含使包含单链靶 序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且 与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切 口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述反向模 板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所 述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；使所述经延长反向模板与正向模 板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域，所述识别 区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的 稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切 口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所 述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而 产生扩增产物。所属领域技术人员应理解，本文所述涉及双链核酸靶序列扩增和扩增产物检测的 实例也适用于单链核酸靶序列的扩增和扩增产物的检测。此外，在本发明各实例中，靶序 列可为(例如)RNA，例如(但不限于)信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA、微小 RNA、微小RNA前体、或siRNA。在(例如)靶序列为RNA的本发明实例性实施例中，聚合酶 具有逆转录活性。在本发明另一实例中，靶序列为DNA，例如基因组DNA，或例如靶序列选自 由以下组成的群组质粒、线粒体、和病毒DNA、或甚至PCR产物。倘若在实例性实施例中本发明方法涉及不止一种聚合酶的使用，则所述聚合酶中 至少一种可具有逆转录酶活性。在本发明其它实施例中，提供一组寡核苷酸模板，其包含核酸扩增用第一模板，所 述第一模板包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所 述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点 上游的稳定区域；和核酸扩增用第二模板，所述第二模板包含位于3’末端且与所述靶序列 反义链5’末端相同的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所 述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；其中所述靶序列在所述反义链的所述 3’末端与所述反义链的所述5’末端之间包含1至5个不结合任一模板的间隔子碱基。在其它实施例中，提供用于实施本发明核酸扩增方法的试剂盒，其包含DNA聚合酶；核酸扩增用第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补 的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点 和所述切口位点上游的稳定区域；核酸扩增用第二模板，其包含位于3’末端且与靶序列有 义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位 点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；一种或两种热稳定切口酶， 其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的切口位点处切口，或第一酶能在所述第一 引物的切口位点处切口并且第二酶能在所述第二引物的酶位点处切口。试剂盒可在一个容器中提供(例如)所述聚合酶、切口酶、和模板。试剂盒可在两 个容器中提供(例如)所述聚合酶、切口酶、和模板。在某些实例中，聚合酶和切口酶都在第 一容器中，并且所述模板位于第二容器中。在某些实例中，聚合酶和切口酶经冻干。试剂盒 可另外包含(例如)实施本发明扩增方法的说明书。试剂盒可另外包含(例如)试管。试 剂盒可另外包含(例如)侧向流动装置或试条。侧向流动装置或试条可另外包含(例如) 捕获探针，其中所述捕获探针结合扩增产物。试剂盒可另外包含(例如)检测部分，例如选 自由以下组成的群组者荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标、聚苯乙烯珠粒和诸如 此类。在其它实例中，试剂盒中至少一个模板可包含间隔子、阻断基团或经修饰核苷酸。在扩增反应中包括三磷酸脱氧核苷(dNTP)。如本文所述，一或多个dNTP可经修饰 或经标记，然而，在本发明方法中不需要使用经修饰NTP。如下所述命名核苷酸。三磷酸核 糖核苷称作NTP或rNTP ；其中N可为A、G、C、U或m5U来表示特定核糖核苷酸。三磷酸脱氧 核苷底物表示为dNTP，其中N可为A、G、C、T或U。在整篇文章中，在不特别提及DNA或RNA 的情况下单体核苷酸亚单元可表示为A、G、C或T。在另一实施例中，提供核酸扩增方法，其包含形成以下物质的混合物包含具有有 义链和反义链的双链靶序列的靶核酸；正向模板，其所包含核酸序列包含位于3’末端且与 靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点 和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；反向模板，其所包 含核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、 所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位 点上游的稳定区域；能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的 第一切口酶；能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口 酶；和耐热性聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所 述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口 位点处切口，从而产生扩增产物。在某些实施例中，正向和反向模板上的切口酶结合位点可 由相同切口酶来识别，并且反应中仅使用一种切口酶。在另一实施例中，提供核酸扩增方法，其包含形成以下物质的混合物包含单链靶 序列的靶核酸；反向模板，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶 序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位 点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；能在所述反向模板的切口 位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；耐热性聚合酶，其中所述聚合酶在 一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；正向模板，其中所述正向模板所包含的核酸 序列包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同或实质上相同的识别区域；以及能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件 下通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产 生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。在某些实施 例中，正向和反向模板上的切口酶结合位点可由相同切口酶来识别，并且反应中仅使用一 种切口酶。在本发明其它实施例中提供通过本发明扩增方法获得的扩增核酸的分离方法。在 本发明其它实施例中提供检测和/或分析通过本发明扩增方法获得的扩增核酸的方法，包 括(例如)使用SYBR I、II、SYBR金、Pico绿、T0T0-3、和大多数嵌入染料的方法、分子信标、 FRET、使用具有荧光的固定探针的表面捕获、电化学或比色检测、质谱、毛细管电泳、纳入经 标记核苷酸以容许通过捕获或荧光偏振来检测、侧向流动、和其它涉及捕获探针的方法。使用捕获探针的检测方法包括(例如)使用核酸分子(捕获探针)，其包含与扩 增产物链互补或实质上互补的序列从而使得捕获探针可结合扩增核酸。在某些实施例中， 可使探针连接可检测标记并且可根据探针中与扩增产物特异性杂交的可检测标记来检测 扩增产物。反应可另外包含(例如)针对纳入或附接至捕获探针的分子的抗体。或者，例 如，捕获探针或与捕获探针结合的分子可纳入(例如)酶标记，例如过氧化物酶、碱性磷酸 酶、或β-半乳糖苷酶；荧光标记，例如荧光素或罗丹明(rhodamine)，或例如具有化学发光 或生物发光活性的其它分子。在某些实施例中，在所属领域技术人员已知并选择的条件下 使探针连接至固体载体上，并且可使扩增产物链特异性固定至与所述固体载体连接的捕获 探针上。在后一情况的实施例中，可对固体载体固定的扩增产物实施处理步骤，例如洗涤、 离子交换、自固体载体释放、或其它处理步骤。在某些实施例中，可在扩增产物固定至固体 载体上时对其进行检测。本发明实施例也包含这些检测和分析方法的组合。


图IA-D是绘示本发明反应机制的草图。图ID是图1的图例。图2.来自DNA NEAR 分析的反应产物的20%聚丙烯酰胺凝胶。根据本发明方法在56°C下使反应进行2. 5分钟，然后在94°C下经4分钟热变性。 在20%聚丙烯酰胺凝胶上以160V使6微升反应物运行约2. 5hr。用SYBR II凝胶染色剂 对凝胶实施染色。泳道1 :25聚体分析的无靶对照。泳道2 :27聚体分析的无靶对照。泳道
3用3. 5E+5拷贝枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA进行25聚体分析。泳道
4用1. 1E+6拷贝枯草芽孢杆菌基因组DNA进行27聚体分析。图3.来自使用本发明方法的RNA分析的反应产物的20%聚丙烯酰胺凝胶。在56°C下使反应进行12分钟，然后在94°C下经4分钟热变性。在20%聚丙烯酰 胺凝胶上以160V使6微升反应物运行约2. 5hr。用SYBR II凝胶染色剂对凝胶实施染色。 泳道1和2 用1E+6拷贝埃博拉(Ebola)披甲RNA(安宾(Ambion))进行25聚体分析的反 应。泳道3和4 25聚体分析的无靶对照反应。25聚体反应产物划在白框中。图4.炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)DNA分析产物的质谱。将A) 0拷贝靶或B) 5E+5拷贝基因组DNA添加至反应中。使反应进行10分钟，然 后在94°C下经4分钟热变性。将10微升样品注入LC/ESI-MS中。(-4)电荷态的26聚体 产物和其互补序列划在黑框中。较小相邻峰是主产物的钠加合物。
图5. MS2基因组RNA分析产物的质谱。将A) 0拷贝靶、B) 1E+6拷贝MS2基因组RNA、或C) 1E+6拷贝合成靶DNA添加至反 应中。使反应进行10分钟，然后在94°C下经4分钟热变性。将10微升样品注入LC/ESI-MS 中。(_4)电荷态的27聚体产物和其互补链序列划在黑框中。较小相邻峰是主产物的钠加 合物。图6.使用嵌入式荧光染料对扩增实施实时检测。比较500拷贝鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)基因组DNA (正方形)与无靶对 照(NTC，空心三角形)的实时扩增。在58°C下使反应进行10分钟并用SYBR II通过实时 荧光进行监测(η = 5)。图7.使用荧光共振能量转移(FRET)对扩增进行实时检测。比较10，000拷贝鼠疫耶尔森菌合成DNA (正方形)与无靶对照(NTC，空心三角形) 的实时扩增。在57°C下使反应进行10分钟，η = 3。图8.使用分子信标实时检测土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)DNA 扩增。将0拷贝(空心三角形)或1E+5拷贝(正方形)添加至反应混合物中并在57. 5°C 下反应10分钟。图9.比较假阳性率测试结果的平均AUC值。误差棒表示一倍标准误差。在55°C下于存在和不存在枯草芽孢杆菌基因组DNA的 情况下使枯草芽孢杆菌分析进行lOmin。在94°C下经4min使酶热变性。将10 μ L样品注 入LC/ESI-MS中并分析产物峰的曲线下面积(AUC)。真阳性物含有10，OOO拷贝枯草芽孢杆 菌DNA以及990，OOO拷贝近邻苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DNA。真阴性物 含有10，OOO拷贝大肠杆菌(E. coli)DNA和990，OOO拷贝近邻DNA，并且水阴性物作为对照 不含DNA。图10.重复实施使用分子信标检测的研究，其中由不同的操作者在不同的两天实 施实验。在57. 5°C下(在存在和不存在500拷贝土拉热弗朗西斯菌基因组DNA的情况下) 使反应进行10分钟，并且在94°c下实施4min的热杀灭。添加300nM分子信标并在45、50 和57 °C下进行监测(η = 24)。图11.使用分子信标检测的反应的灵敏性。在57. 5°C下使分析进行10分钟。在94°C下通过4min的热失活步骤终止反应。添 加300nM分子信标并在57. 5°C下监测荧光(η = 3)。监测在用1Ε+6、5Ε+5、5Ε+4、5Ε+2、50、 和O (NTC)输入拷贝的土拉热弗朗西斯菌基因组DNA扩增的反应物存在下开放的信标的荧 光，并将其与信标(MB)单独存在时的荧光作比较。图12.扩增产物在NEAR反应中的终浓度。在55°C下用不同拷贝的枯草芽孢杆菌基因组DNA使NEAR 反应物进行lOmin。在 94°C下经4分钟的热失活步骤来终止反应。将10微升样品注入LC/ESI-MS中，并分析1944 道尔顿处产物峰的AUC且将其与标准曲线相比较。图13.输入RNA靶拷贝数与扩增产物终浓度的关联。在55 °C下用不同拷贝的对应于埃博拉基因组DNA的合成RNA使埃博拉NEAR 分析进行12min。在94°C下经4分钟的热失活步骤来终止反应。将10微升样品注入LC/ESI-MS 中，并且分析1936道尔顿处产物峰的AUC并且与AUC值的标准曲线相比较。(η = 3)图14.证实NEAR反应特异性的质谱产物分析。在多拷贝苏云金芽孢杆菌稀释物存在下于56°C下使炭疽芽孢杆菌NEAR 反应进 行IOmin (η = 3),然后在94°C下经4分钟热变性。将10 μ L样品注入LC/ESI-MS中并分析 产物峰的AUC值。图15.干扰物组对扩增的效应。在55°C下使枯草芽孢杆菌DNA反应进行lOmin，并将其加热至94°C并且保持4分 钟以终止反应。在1E+5拷贝枯草芽孢杆菌基因组DNA( “1E+5”)存在下或无靶DNA存在 下(〃 O")使反应重复进行三次。样品χ是未添加干扰物的对照分析。以50%反应体积 将干扰物A至F添加至枯草芽孢杆菌分析中。使用二因子ANOVA和邦弗朗尼(Bonferroni) t-测试来分析质谱产物峰的AUC。(图例·Λ =无；B =室尘、脱脂乳；C = AZ测试用粉尘、 腐殖酸；D =柴油烟粒；E =脱脂乳；F =霉菌孢子)图16.枯草芽孢杆菌/炭疽芽孢杆菌DNA双重反应的凝胶电泳结果。NEAR 反应包括对枯草芽孢杆菌(Bs)和炭疽芽孢杆菌(Ba)DNA 二者具有特异性 的模板，在不存在靶DNA的情况下(阴性)、在枯草芽孢杆菌单独存在下(27聚体产物为 阳性)、以及在枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌二者存在下(27聚体和25聚体产物分别为阳 性)进行反应。此分析中所用靶拷贝数为500，OOO拷贝。在57°C下使分析进行lOmin。改 变各分析中的模板浓度以控制扩增(对于炭疽芽孢杆菌为IOOnM并且对于枯草芽孢杆菌为 50nM)。在20%聚丙烯酰胺凝胶上以160V使样品运行约2小时。用SYBR II荧光染料对凝 胶实施染色并使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实施量化和分析(η = 8)。图17.通过凝胶电泳显示枯草芽孢杆菌/炭疽芽孢杆菌DNA双重反应的特异性结^ οNEAR 反应包括针对枯草芽孢杆菌(Bs)和炭疽芽孢杆菌(Ba) DNA 二者的模板，在 无靶DNA存在下(阴性)、在枯草芽孢杆菌DNA单独存在下(27聚体产物)、以及在枯草芽 孢杆菌和炭疽芽孢杆菌DNA 二者存在下(各自为27聚体和25聚体产物)进行反应。此分 析中所存在各基因组的靶拷贝数为500，OOO拷贝。所有反应物都含有500，OOO拷贝苏云 金芽孢杆菌作为外源核酸。改变各分析中的模板浓度以控制扩增。在57°C下使分析进行 IOmin,在94°C下经4min热变性，并且将6微升分析物装载至20%凝胶上以160V运行约2 小时。用SYBR II荧光染料对凝胶实施染色并使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实 施量化和分析。图18. MS2/埃博拉RNA双重反应的凝胶电泳结果。NEAR 反应包括针对MS2和埃博拉分析物二者的模板，在无靶RNA存在下(阴性， 泳道2-5)、在MS2单独存在下(27聚体产物，泳道6和7)、以及在MS2和埃博拉RNA 二者存 在下(各自为27聚体和25聚体产物，泳道8和9)进行反应。此分析中所用靶拷贝数为 1E+6拷贝。在57°C下使分析进行lOmin。改变各分析中的模板浓度以控制扩增。在20% 聚丙烯酰胺凝胶上以160V使样品运行约2. 5小时。用SYBRII荧光染料对凝胶实施染色并 使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实施量化和分析。 图19.经溶解孢子的DNA扩增的质谱分析。
比较经溶解与未溶解样品的扩增产物质量的平均AUC值。然后将经溶解孢子样品 添加至母混合物(master mix)中并在55°C下反应10分钟，在94°C下经4分钟热变性，并 在质谱上运行以供分析。取产物峰AUC值的平均值并加以比较(η = 3)。图20.展示用于表面检测的捕获和延长方法。比较Α.) 一般结合(未添加聚合酶的阳性反应产物)、B. ) 500, 000靶(添加有聚 合酶的阳性反应产物)，与C.)无靶(添加有聚合酶的阴性反应物)。在55°C下使NEAR 分 析进行10分钟，在94°C下经4分钟热变性，然后将其添加至具有以5’末端与表面结合的 捕获探针的板中。将聚合酶添加至阳性反应物的一孔中。在55°C下将板培养30min，洗涤， 添加SYBR II，洗涤3次，并在帝肯(Tecan)板读取器(495nm激发/530nm发射)上进行读 取。图21.在存在(正方形)和不存在(空心三角形)1E+6拷贝基因组DNA的情况下 对单一模板固定在表面上的NEAR FRET分析实施伪实时荧光检测。在覆盖有中性链亲和素(neutravidin)的平底96孔板中实施反应。在缓慢搅拌 和37°C下将1微摩尔FRET标记反向模板溶液培养lhr。用PBS-吐温(Tween)溶液将各孔 洗涤3次以释放未结合模板。将本发明方法的NEAR 反应混合物添加至各孔中(所取每个 时间点添加一孔)并在58°C下于设定为135RPM的震荡培养器的加热模块上培养。在所取 各时间点处通过将1微升EDTA添加至孔中以终止反应。自底部使用帝肯100板读取器来 读取荧光。图22.沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)分析的检测限。使用衣原体靶的2 倍稀释物实施一系列分析。A)以3次分析的平均值显示检测限的荧光检测的条形图。B) 显示单次分析结果的条形图。图23.单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)与无害利斯特菌 (L. innocua)的区分。展示一系列分析的结果的条形图，实施所述系列分析来确定所述分析 区分两种不同细菌的能力。图24.用病毒RNA实施的分析。展示以不同稀释度病毒RNA靶实施本发明方法的 一系列分析的结果的条形图。图25.展示bar基因靶序列检测分析结果的条形图。图26.展示检测miRNA靶序列的本发明方法的分析结果的条形图。图27. Gc分析L0D。Α)展示检测基因组靶序列的一系列分析的平均值的条形图。 B)单次分析的结果，每次分析包括50个基因组拷贝。图28.枯草芽孢杆菌NEAR 分析。A)确定添加至样品中的参照寡核苷酸的量与 曲线下面积(AUC)之间关联的标准曲线。B)展示测定所生成特定产物量的本发明方法的分 析结果的条形图。C)展示分析结果的表。图29.间隔子长度研究。A)展示确定不同间隔子长度的效应的本发明方法分析结 果的条形图。B)用于获得不同间隔子长度的模板序列。图30.用于图29中所示分析的模板设计。图31.稳定区域的效应。A)使用包括或不包括稳定区域的寡核苷酸模板实施的本 发明方法的分析结果图。B)A)图中一部分的扩展。图32. Mg+2浓度的滴定。A)展示使用不同Mg+2量实施的一系列NEAR分析结果的条形图。B)展示分析中各组份的图表。图33.绘示本发明方法反应机制的草图。图34.靶序列和寡核苷酸模板序列的实例列表。
具体实施例方式本文提供指数式扩增短DNA或RNA序列的方法。本发明靶核酸包括双链和单链核酸分子。核酸可为(例如)DNA或RNA。倘若靶 核酸为RNA分子，则所述分子可为(例如)双链、单链，或RNA分子可包含单链靶序列。倘 若靶核酸为RNA分子，则所述分子可为双链或单链，或可包含单链靶序列。靶核酸包括(例 如)基因组、质粒、线粒体、细胞、和病毒核酸。靶核酸可为(例如)基因组、染色体、质粒 DNA、基因、任一类型的细胞RNA、或合成寡核苷酸。“基因组核酸”意指来自任一基因组的任 一核酸，包括(例如)动物、植物、昆虫、和细菌基因组，包括(例如)存于孢子中的基因组。 双链DNA靶核酸包括(例如)基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、病毒DNA、和合成双链DNA 或本文所述或业内已知的其它类型的DNA。单链DNA靶核酸包括(例如)病毒DNA、cDNA、 和合成单链DNA、或本文所述或业内已知的其它类型的DNA。RNA靶核酸包括(例如)信使 RNA、病毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA和微小RNA前体、以及siRNA或本文所述或业 内已知的其它RNA。微小RNA、miRNA,或小短暂RNA (stRNA)是单链短RNA序列，其长约21_23个核 苷酸并且与基因调节有关。微小RNA被认为可干扰信使RNA的转译，因为其与信使RNA 部分互补。(例如，参见鲁昆，Gl(Ruvkun，G1)，科学(Science), 294 =797-99(2001)；拉 各斯-金塔纳，M. (Lagos-Quintana, Μ.)等人，科学，294 :854_58 (2001)；刘，N. C. (Lau, N. C.)等人，科学，294 858-62(2001)；李，R. C. (Lee, R. C.)和安布罗斯，V. (Ambros, V.)， 科学，294 :862-64 (2001)；鲍尔库姆，D. (Baulcombe, D.)等人，科学，297 2002-03 (2002)； 莱伍，C(Llave, C)，科学，297 =2053-56(2002)；哈特瓦格纳，G. (Hutvagner, G.)和萨莫勒， P. D. (Zamore, P. D.)，科学，297 :2056_60 (2002))。根据近期所报导在基因剔除小鼠中的研 究，微小RNA可能在免疫系统中也具有一定作用。(例如，参见韦德，N. (Wade, N.)，“研究 启示禾口免疫系统调节剂(Studies Reveal andlmmune System Regulator) ”，纽约时 艮(New York Times)，2007年4月27日)。也可使用本发明方法检测的微小RNA前体包括(例如) 初级转录物(初级miRNA)和前体miRNA(经进一步处理后变为miRNA的茎-环结构RNA)。短干扰RNA (或siRNA)为具有至少部分双链并且长约20_25个核苷酸的RNA分子， 人们发现其与RNA干扰有关，例如与病毒复制或基因表达的减量调节有关(例如，参见萨 莫勒等人，2000，细胞(Cell)，101，25-33 ；巴斯(Bass)，2001，自然(Nature)，411，428-429 ； Elbashir等人，2001，自然，411，494-498 ；和克拉萨(Kreutzer)等人，国际PCT公开案第WO 00/44895 ；泽内卡-戈茨(Zernicka-Goetz)等人，国际PCT公开案第WO 01/36646 ；法尔 (Fire)，国际PCT公开案第WO 99/32619号；普雷汀科(Plaetinck)等人，国际PCT公开案第 WO 00/01846号；米洛(Mello)和法尔，国际PCT公开案第WO 01/29058号；迪甘斯-德帕里 (Deschamps-Depaillette)，国际 PCT 公开案第 W099/07409 号；和李(Li)等人，国际 PCT 公 开案第 WO 00/44914 号；奥舍尔(Allshire)，2002，科学，297，1818-1819 ；沃尔皮(Volpe) 等人，2002，科学，297，1833-1837 ；基纽文(Jenuwein)，2002，科学，297，2215—2218 ；和霍尔(Hall)等人，2002，科学，297，2232-2237 ；哈特瓦格纳和萨莫勒，2002，科学，297，2056-60 ； 麦克曼纽斯(McManus)等人，2002，RNA，8，842-850 ；雷哈特(Reinhart)等人，2002，基因 与发育(Gene & Dev.)，16，1616-1626 ；以及雷哈特和巴特尔(Bartel)，2002，科学，297， 1831)。术语“靶序列”的使用可意指序列的有义或反义链，并且也可意指初始靶序列的靶 核酸、扩增拷贝、或扩增产物上存在的序列。扩增产物可为较大分子，其包含靶序列以及至 少一个其它序列或其它核苷酸。靶序列的长度以及鸟苷胞嘧啶(GC)浓度(百分比)取决 于进行反应的温度；此温度取决于反应中所用聚合酶和切口酶的稳定性。所属领域技术人 员可实施样品分析来确定适合于反应条件的长度和GC浓度。例如，倘若聚合酶和切口酶在 最高60°C下稳定，则靶序列长度可为(例如)19至50个核苷酸，或长度可为(例如)20至 45、20至40、22至35、或23至32个核苷酸。在这些条件下GC浓度可(例如)小于60%、 小于55%、小于50%、或小于45%。所选靶序列和切口酶应使得靶序列不含反应混合物中 将包括的任一切口酶的切口位点。靶序列可自多种类型的样品来扩增，包括(但不限于)含有来自原核生物或真核 生物的孢子、病毒、细胞、核酸或任何游离核酸的样品。例如，所述分析不需溶解即可检测位 于孢子外的DNA。可自怀疑含有靶序列的任何材料分离样品。例如，对于动物(例如哺乳动 物，例如人类)来说，样品可包含血液、骨髓、粘液、淋巴液、硬组织(例如肝、脾、肾、肺、或卵 巢)、活检样品、痰、唾液、泪液、粪便、或尿液。或者，靶序列可存于怀疑含有生物有机体的空 气、植物、土壤、或其它材料中。靶序列也可存于也含有环境污染物(例如粉尘、花粉和烟粒(例如来自柴油排放) 或临床相关基质(例如尿液、粘液或唾液)的样品中。靶序列也可存于废水、饮用水、空气、 乳汁、或其它食物中。根据这些污染物的浓度，可能需要所属领域技术人员已知的样品纯化 方法来移除成功扩增的抑制剂。纯化可涉及(例如)洗涤剂溶解产物、超声处理、玻璃珠涡 旋或法氏压机(French press)的使用。此纯化也可导致样品靶的浓缩。也可通过(例如) 过滤、酚提取、色谱法、离子交换、凝胶电泳、或密度依赖性离心对样品实施进一步纯化。在 具体实施例中，可直接将样品添加至反应混合物中或在预稀释后将样品添加至反应混合物 中而不事先纯化靶核酸。寡核苷酸是包含两个或以上个(例如三个以上)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的 分子。寡核苷酸的长度可取决于其使用方式。寡核苷酸可以合成方式或通过克隆来获得。术语“互补”在描述两个核酸序列时一般是指两个序列在两个核酸之间形成足够 氢键以稳定通过两个核酸杂交形成的双链核苷酸序列的能力。在两个序列中，一个序列中 的所有核苷酸可都与另一序列中的对应核苷酸互补。在某些实施例中，两个序列中的对应 核苷酸之间可能存在一些失配(即非互补核苷酸)，例如10个核苷酸中存在1处失配、20 个核苷酸中存在1处失配、或30个核苷酸中存在1处失配，所述序列在本文中称作“实质上 互补”。如图1A-1D中所示，各模板核酸经常包括与模板核酸所杂交的靶核酸链(或其互补 链)互补或实质上互补的识别区域。同样如图1A-1D中所示，各模板核酸经常包括位于识 别区域5’端的稳定区域和不与靶核酸序列或其互补链互补或实质上互补的切口剂识别区 域。本文所用“杂交”和“结合”可互换使用并且是指互补核酸序列相互之间的非共价结合或“碱基成对”。特定探针是否与多核苷酸序列保持碱基成对取决于互补度、探针长度、 以及结合条件的严苛性。严苛性越高，互补度必须越高，和/或欲保持稳定结合或碱基成对 的探针越长。本文所用“严苛性”是指对核酸所施加的可导致双链核酸离解为组成单链的条件 组合，例如极端PH、高温和盐浓度。词组“高严苛性”是指杂交条件的严苛性或限制性高至 足以使得仅可进行特异性碱基成对。特异性应高至足以使得可根据标准南方(Southern) 杂交方案(如分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) ,98:503(1975)中所述)使用寡核苷酸探针 或密切相关序列来检测单一序列。模板定义为与靶序列识别区域结合并且也含有位于识别区域上游的切口酶结合 区域和位于切口酶结合区域上游的稳定区域的寡核苷酸。“识别区域”意指模板上与靶序列上的核酸序列互补或实质上互补的核酸序列。 “靶序列上的识别区域”意指靶序列上与模板互补或实质上互补或与模板结合的核苷酸序 列。“稳定区域”意指具有(例如)约50% GC含量的核酸序列，其设计为可稳定用于 (例如)切口和/或延长反应的分子。在描述某些序列在核酸分子、例如在靶序列或模板中的定位时，所属领域技术人 员应理解，术语“3’”和“5’”是指特定序列或区域相对于另一序列或区域的位置。因此，在 一序列或区域位于或为另一序列或区域的3’时，所述位置介于所述序列或区域与所述核酸 链3’羟基之间。在核酸中的位置位于或为另一序列或区域的5’时，此意指所述位置介于 所述序列或区域与所述核酸链的5’磷酸根之间。聚合酶是能催化根据核酸靶序列纳入特定核苷酸来延长引物分子(例如模板寡 核苷酸)3’羟基末端的蛋白质。聚合酶可为(例如)耐热酶从而使得其在升高反应温度下 也具有活性。例如，其也可具有链置换能力。然而，其不需要极高持续性(单次合成30-40 个核苷酸已足够)。所用聚合酶通常不具有5’-3’外切核酸酶活性。若聚合酶也具有逆转 录酶活性(例如Bst(大片段)、9° N、热启动酶、热启动酶II等)，则反应不使用单独的逆 转录酶也可在单一步骤中扩增RNA靶。反应中可包括不止一种聚合酶，在一实例中一种聚 合酶可具有逆转录酶活性并且另一种聚合酶可缺少逆转录酶活性。在实例性实施例中，聚 合酶是BST (大片段)。聚合酶可选自(例如)由表1中所列一或多种聚合酶组成的群组。
权利要求
一种扩增核苷酸序列的方法，其包含合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂交的第一模板核酸、和(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中所述靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；所述靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质上等温的条件下实施。
2.一种扩增核苷酸序列的方法，其包含合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂 交的第一模板核酸、和(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板 核酸扩增子；其中所述靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3’ 末端互补或实质上互补的第一模板识别区域；所述第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的 互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域；所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区 域中的核苷酸总数多1至5个；所述靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质上等温 的条件下实施。
3.一种扩增核苷酸序列的方法，其包含合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂 交的第一模板核酸、和(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板 核酸扩增子；其中所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3’ 末端互补或实质上互补的第一模板识别区域，其中所述识别区域长8至15个核苷酸；所述第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的 互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域，其中所述识别区域长8至15个 核苷酸；所述靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质上等温 的条件下实施。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3’ 末端互补或实质上互补的第一模板识别区域；并且所述第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶核苷酸序列第一链的 互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板 识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
6.如权利要求2、3、4或5中任一权利要求所述的方法，其中所述第一模板和第二模板 包含位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点，并且所述扩增反应另外包含一 或多种能在所述正向和所述反向模板的所述切口位点处切口的切口酶，其中任一种切口酶 都能对所述两个模板进行切口，或每个模板都能通过至少一种所述切口酶进行切口，并且 其中所述一或多种切口酶不能在所述靶序列内切口。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板 识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1个。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板 识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多2个。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板 识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多3个。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是双链或单链核酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述靶核酸是双链DNA。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述靶核酸是单链DNA。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组基因组DNA、 质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA和合成双链DNA。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组病毒DNA、 cDNA和合成单链DNA。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组信使RNA、病 毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA、微小RNA前体、和合成RNA。
17.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其中所述DNA聚合酶是耐热性聚 合酶。
18.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其中所述聚合酶选自由以下组成 的群组Bst (大片段)、9° N、温特(VentR) (外)DNA聚合酶、热启动酶(Therminator)、和 热启动酶II。
19.如权利要求1至19中任一权利要求所述的方法，其中所述聚合酶是Bst(大片段)。
20.如权利要求6至12中任一权利要求所述的方法，其中所述第一和第二模板包含可 通过相同切口酶识别的多个切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述切口酶选自由以下组成的群组Nt.BspQI, Nb. BbvCi, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Nt. AlwI, Nt. BbvCI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII、 Nb. BpulOUP Nt. BpulOI。
22.如权利要求1至20中任一权利要求所述的方法，其中所述第一链核酸序列中与所 述靶核苷酸序列第一链互补或实质上互补的部分长8至15个核苷酸，并且其中所述第二链 中与所述靶核苷酸序列互补或实质上互补的部分长8至15个核苷酸。
23.如权利要求1至22中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所述第一模板的浓度与所述第二模板相同。
24.如权利要求1至22中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所述第一或第二模 板中的一者与另一模板的比率在1 100至100 1的比率范围内。
25.如权利要求1至25中任一权利要求所述的方法，其另外包含第二聚合酶。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一或第二聚合酶中至少一者具有逆转录酶 活性。
27.如权利要求1至26中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增是在54°C与60°C之 间实施。
28.如权利要求1至26中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增是在56°C与58°C之 间实施。
29.如权利要求1至28中任一权利要求所述的方法，其中将所述扩增反应物在恒温下 保持1至10分钟。
30.如权利要求1至28中任一权利要求所述的方法，其中将所述扩增反应物在恒温下 保持1至20分钟。
31.如权利要求1至30中任一权利要求所述的方法，其另外包含检测所述扩增产物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述扩增产物是通过选自由以下组成的群组的检 测方法来检测凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、T0T0-3、 嵌入染料检测、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标 记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。
33.如权利要求1至32中任一权利要求所述的方法，其中能扩增至少两个靶序列。
34.如权利要求1至33中任一权利要求所述的方法，其中在固体表面上检测所述扩增 产物。
35.如权利要求1至34中任一权利要求所述的方法，其中将至少一种捕获探针固定在 固体表面上。
36.如权利要求1至35中任一权利要求所述的方法，其中所述模板中的至少一者包含 间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
37.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在约5分 钟内扩增1E+6倍或以上。
38.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在约2.5 分钟内扩增1E+6倍或以上。
39.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在约5分 钟内扩增1E+7倍或以上。
40.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在约5分 钟内扩增1E+8倍或以上。
41.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在约5分 钟内扩增1E+9倍或以上。
42.一种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接 触，其中i)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上 游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链的3’末端互补的部分长8至15个核 苷酸； )所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’ 末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位 点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链的3’末端互补的部分长8至15 个核苷酸；b)提供能在所述正向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第一切口酶；c)提供能在所述反向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第二切口酶；和d)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物。
43.一种扩增单链核酸靶序列的方法，其包含a)使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核酸序列 包含位于3’末端且与所述靶序列的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶 结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶 序列的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；b)提供能在所述反向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一 切口酶；c)提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；d)使所述经延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与 所述经延长反向模板的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切 口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链的3’末 端互补的部分长8至15个核苷酸；e)提供能在所述正向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内或在所述靶 序列的互补链内切口的第二切口酶；其中所述扩增是在基本等温的条件下实施，其中扩增是通过多次如下循环来实施所 述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口 酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中所述DNA聚合酶是耐热性聚合酶。
45.如权利要求42或43所述的方法，其中所述聚合酶选自由以下组成的群组Bst(大 片段)、9° N、温特R (外)DNA聚合酶、热启动酶、和热启动酶II。
46.如权利要求42或43所述的方法，其中所述聚合酶是Bst(大片段)。
47.如权利要求42或43所述的方法，其中所述切口酶在所述切口酶结合位点下游切□。
48.如权利要求42或43所述的方法，其中所述正向和反向模板包含可通过相同切口酶 识别的切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。
49.如权利要求42或43所述的方法，其中所述切口酶选自由以下组成的群组 Nt. BspQI, Nb. BbvCi, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Nt. AlwI, Nt. BbvCI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, Nb.BpulOI 和 Nt. BpulOI。
50.如权利要求42或43所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
51.如权利要求42或43所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1个。
52.如权利要求42或43所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多2个。
53.如权利要求42所述的方法，其中所述靶DNA分子选自由以下组成的群组基因组 DNA、质粒、线粒体和病毒DNA。
54.如权利要求43所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组病毒DNA、信 使RNA、微小RNA、和微小RNA前体。
55.如权利要求42或43所述的方法，其中所提供的所述正向模板的浓度与所述反向模 板相同。
56.如权利要求42或43所述的方法，其中所提供的所述正向或反向模板中的一者与另 一模板的比率在1 100至100 1的比率范围内。
57.如权利要求43所述的方法，其另外包含第二聚合酶。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述聚合酶中至少一者具有逆转录酶活性。
59.如权利要求42或43所述的方法，其中所述扩增是在54°C与60°C之间实施。
60.如权利要求42或43所述的方法，其中将所述扩增反应物在恒温下保持1至10分钟。
61.如权利要求42或43所述的方法，其另外包含检测所述扩增产物。
62.如权利要求42或43所述的方法，其中所述扩增产物是通过选自由以下组成的群组 的方法来检测凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、T0T0-3、 嵌入染料检测、FRET、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过 捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。
63.如权利要求42或43所述的方法，其中能扩增至少两个靶序列。
64.如权利要求42或43所述的方法，其中在固体表面上检测所述扩增产物。
65.如权利要求42或43所述的方法，其中将至少一种捕获探针固定在固体表面上。
66.如权利要求42或43所述的方法，其中所述模板中的至少一者包含间隔子、阻断基 团、或经修饰核苷酸。
67.一种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接 触，其中i)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；ii)所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’ 末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位 点上游的稳定区域；并且iii)所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反向模板识别区域 中的核苷酸总数多1至5个；b)提供能在所述正向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一 切口酶；c)提供能在所述反向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二 切口酶；和d)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物。
68.一种扩增单链核酸靶序列的方法，其包含a)使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核酸序列 包含位于3’末端且与所述靶序列的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶 结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶 序列的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸；b)提供能在所述反向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一 切口酶；c)提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；d)使所述经延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与 所述经延长反向模板的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切 口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向 模板识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；e)提供能在所述正向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内或在所述靶 序列的互补链内切口的第二切口酶；其中所述扩增是在基本等温的条件下实施，其中扩增是通过多次如下循环来实施所 述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口 酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1个。
70.如权利要求67或68所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多2个。
71.如权利要求67或68所述的方法，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板 识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多3个。
72.—种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中b)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上 游的稳定区域；c)所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’末 端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点 上游的稳定区域；d)提供能在所述正向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一 切口酶；e)提供能在所述反向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二 切口酶；和f)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物。
73.—种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接 触，其中b)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上 游的稳定区域；ii)所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’ 末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位 点上游的稳定区域；c)提供能在所述正向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第一切口酶；d)提供能在所述反向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第二切口酶；和e)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物。
74.—种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接 触，其中b)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上 游的稳定区域；c)所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点 上游的稳定区域；d)提供能在所述正向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一 切口酶；e)提供能在所述反向模板的所述切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二 切口酶；和f)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物，其中当使所述扩增反应进行12分钟时，长22至35个核苷酸的 靶序列获得至少1E+7倍的扩增。
75.—种扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温的条件下a)使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接 触，其中b)所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链的3’末端 互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上 游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链的3’末端互补的部分长8至15个核 苷酸；c)所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的3’末 端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点 上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链的3’末端互补的部分长8至15个 核苷酸；d)提供能在所述正向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第一切口酶；e)提供能在所述反向模板的所述切口位点上游、下游或所述切口位点处切口但不能在 所述靶序列内切口的第二切口酶；和f)提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向 模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝 处切口，从而产生扩增产物，其中当使所述扩增反应进行12分钟时，长22至35个核苷酸的 靶序列获得至少1E+7倍的扩增。
76.一种用于扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含a)DNA聚合酶；b)用于核酸扩增的第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链的3’末端互补的 识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳 定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的3’末端互补的部分长8至15个核苷 酸；c)用于核酸扩增的第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的互补链的 3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链的互补链的3’末端互补的 部分长8至15个核苷酸；和d) 一种或两种热稳定切口酶，其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的所述切 口位点处切口，或第一酶能在所述第一引物的所述切口位点处切口并且第二酶能在所述第 二引物的所述酶位点处切口。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识 别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
78.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于一个容器中。
79.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于两个容器中。
80.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述聚合酶和切口酶存于第一容器中，并且所 述模板存于第二容器中。
81.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板经冻干。
82.如权利要求76所述的试剂盒，其另外包含实施所述扩增方法的说明书。
83.如权利要求76所述的试剂盒，其另外包含试管。
84.如权利要求76所述的试剂盒，其另外包含侧向流动装置或试条。
85.如权利要求84所述的试剂盒，其中所述侧向流动装置或试条另外包含捕获探针。
86.如权利要求76所述的试剂盒，其另外包含选自由以下组成的群组的检测部分荧 光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标和聚苯乙烯珠粒。
87.如权利要求76所述的试剂盒，其中所述模板中的至少一者包含间隔子、阻断基团、 或经修饰核苷酸。
88.一种用于扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含a)DNA聚合酶；b)用于核酸扩增的第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链的3’末端互补的 识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳 定区域；c)用于核酸扩增的第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链的互补链的 3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口 位点上游的稳定区域，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第 二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；和d)一种或两种热稳定切口酶，其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的所述切 口位点处切口，或第一酶能在所述第一引物的所述切口位点处切口并且第二酶能在所述第 二引物的所述酶位点处切口。
89.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述第一模板核酸序列中与所述靶序列有义链 的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸，并且所述第二模板核酸序列中与所述靶序列有 义链的互补链的3’末端互补的部分长8至15个核苷酸。
90.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于一个容器中。
91.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板存于两个容器中。
92.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述聚合酶和切口酶存于第一容器中，并且所 述模板存于第二容器中。
93.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述聚合酶、切口酶、和模板经冻干。
94.如权利要求88所述的试剂盒，其另外包含实施所述扩增方法的说明书。
95.如权利要求88所述的试剂盒，其另外包含试管。
96.如权利要求88所述的试剂盒，其另外包含侧向流动装置或试条。
97.如权利要求96所述的试剂盒，其中所述侧向流动装置或试条另外包含捕获探针。
98.如权利要求88所述的试剂盒，其另外包含选自由以下组成的群组的检测部分焚 光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标和聚苯乙烯珠粒。
99.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述模板中的至少一者包含间隔子、阻断基团、 或经修饰核苷酸。
全文摘要
本发明一般来说涉及短DNA或RNA序列在恒温下的快速指数式扩增。
文档编号C12Q1/68GK101952459SQ200880105424
公开日2011年1月19日 申请日期2008年7月14日 优先权日2007年7月14日
发明者安德鲁·P·米勒, 布莱恩·K·梅普尔斯, 杰弗里·曼代利, 理查德·罗思, 里贝卡·C·霍姆伯格, 雅罗德·普罗文斯 申请人:爱奥尼安技术公司