专利名称：生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及生产L-氨基酸的微生物以及L-氨基酸的生产方法。L-赖氨酸、L-苏 氨酸和L-色氨酸被广泛地作为饲料添加剂等使用。此外，L-苯丙氨酸被作为甜味剂原料 使用。L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸可用于氨基酸输液、滋补品。此外，L-丝氨酸可 以用作食品添加剂、化妆品的原料等。
背景技术：
为了通过使用微生物的发酵法生产L-氨基酸等目的物质，可以采用使用野生型 微生物(野生株)的方法、使用从野生株衍生的营养缺陷型株的方法、使用从野生株作为各 种药物抗性突变株衍生的代谢调节突变株的方法、使用兼具营养缺陷型株和代谢调节突变 株二者的性质的菌株的方法等。近年来，在目的物质的发酵生产中采用了重组DNA技术。例如，人们通过增强L-氨 基酸生物合成体系酶编码基因或涉及L-氨基酸的分泌或抗性的蛋白质的编码基因的表 达、或者增强L-氨基酸生物合成体系的碳源流入来提高微生物的L-氨基酸生产性能。作为如上所述技术，例如，就L-赖氨酸而言，已知可以增强二氢吡啶二羧酸合酶、 天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶等酶的 编码基因的表达(专利文献1)，降低高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(专利文献2)和苹果 酸酶(malic enzyme)(专利文献3)的活性等。就L-苏氨酸而言，作为赋予L-苏氨酸和/或L-高丝氨酸抗性的基因，可以列举 下列rhtA基因(专利文献4)、rhtB基因(专利文献5)、rhtC基因(专利文献6)、yfiK、 yeaS基因(专利文献7)。此外，还包括增强编码天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝 氨酸激酶、苏氨酸合酶、以及天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)的基因的表达(专利 文献8)，降低苏氨酸脱氢酶的活性(专利文献9)等。就L-色氨酸而言，已知有解除磷酸甘油酸脱氢酶、邻氨基苯甲酸合酶的反馈抑制 (专利文献10)，缺损色氨酸酶(专利文献11)等。就L-苯丙氨酸而言，已知有解除分支酸变位酶_预苯酸脱水酶的反馈抑制(专利 文献12)，以及缺损分支酸变位酶_预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物(专利文献13)等。就L-缬氨酸而言，已知有生长需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突变株(专利文献 14)等；对于L-亮氨酸，已知有解除异丙基苹果酸合酶的反馈抑制(专利文献15)等；对于 L-异亮氨酸，已知有强化编码苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶的基因等的表达(专利文献16)寸。就L-丝氨酸而言，已知有携带降低了由丝氨酸导致的反馈抑制的3-磷酸甘油酸 脱氢酶的菌株(专利文献17)，具有L-丝氨酸生产能力且增强了磷酸丝氨酸磷酸酶活性或 磷酸丝氨酸转氨酶活性中的至少一种的细菌，缺失L-丝氨酸分解能力的细菌(专利文献 18)，以及具有偶氮丝氨酸或β - (2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性且具有L-丝氨酸生产能力的 细菌(专利文献19)等。
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专利文献1美国专利第6，040, 160号专利文献2美国专利第5，827，698号专利文献3W02005/010175专利文献4美国专利第6，303，348号专利文献5欧洲专利申请公开第0994190号专利文献6欧洲专利申请公开第1013765号专利文献7欧洲专利申请公开第1016710号专利文献8W02006/123专利文献9美国专利第7，179，623号专利文献10美国专利第6，180，373号专利文献11美国专利第4，371，614号专利文献12美国专利第5，354，672号专利文献13W003/04419专利文献14美国专利第5，888，783号专利文献15美国专利第6，403，342号专利文献16美国专利第5，998，178号专利文献17美国专利第5，618，716号专利文献18美国专利第6，037，154号专利文献19美国专利第6，258，573号
发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题是提供能够高效生产L-氨基酸的菌株，以及提供使用该菌株高效 生产L-氨基酸的方法。解决问题的手段传统的L-氨基酸生产主要是以糖类作为碳源，利用丙酮酸脱氢酶为TCA循环提供 乙酰CoA来实现的。但是，丙酮酸脱氢酶的反应伴有脱碳酸，必然要释放1分子的C02。因此， 本发明人等认为，为了进一步提高生产力，必须要减少这种脱碳酸。于是，本发明人等为解 决上述课题进行了深入研究，结果发现以乙醇、脂肪酸等能提供乙酰CoA的物质为碳源， 通过提高催化碳酸固定反应的酶一丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的酶活性，进 一步通过增强铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性(该酶具有分别从氧化型铁氧还蛋白或氧 化型黄素氧还蛋白生成对丙酮酸合酶的酶活性而言必要的还原型铁氧还蛋白或还原型黄 素氧还蛋白的活性)、或者通过提高铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白产生能力，能够提高L-氨 基酸的生产力，从而完成了本发明。S卩，本发明如下述。(1). 一种微生物，其具有生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸的能力，且经过修饰而增强 了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性。(2).上述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸合酶的活性。
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(3).上述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性。(4).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性是通过 增加编码丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因的表达量和/或增加所述基因的 翻译量而增强的。(5).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性是通过 提高编码丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因的拷贝数或修饰所述基因的表达 调节序列而增强的。(6).上述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因编码下述㈧ ⑶中任一 项所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、(I)和(J) 的多肽(A)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 2中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的多肽；(D)包含在SEQ ID NO 4中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能够与至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的
7氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白质复合体的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的 氨基酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白质复合体的多肽。(7).上述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任 一项的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)和(h)的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和(j)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列的DNA ；(b)与SEQ ID NO :1所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探 针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQ ID NO 3所示的碱基序列的DNA ；(d)与SEQ ID NO 3所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探 针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的 DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的碱基序列的DNA ；(e2)与SEQ ID NO 56所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的 探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA—起编码具有丙酮 酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(f)下述(f 1)或(f2)的 DNA (fl)具有SEQ ID NO 58所示的碱基序列的DNA ；(f2)与SEQ ID NO 58所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的 探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA—起编码具有丙酮 酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的 DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的碱基序列的DNA、(g2)与SEQ ID NO 60所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的 探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA—起编码具有丙酮 酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的 DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的碱基序列的DNA、(h2)与SEQ ID NO 62所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的 探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA—起编码具有丙酮 酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ；⑴下述(il)或(i2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 64所示的碱基序列的DNA ；(h2)与SEQ ID NO :64所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的
8探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起编码具有丙 酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(j)下述(jl)或(j2)的 DNA (jl)具有SEQ ID NO 66所示的碱基序列的DNA ；(j2)与SEQ ID NO 66所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的 探针在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起编码具有丙 酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA。(8).上述的微生物，其中，编码丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因编码下述(A)或 ⑶所示的多肽(A)包含SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 6中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨
基酸序列，并且具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的多肽。(9).上述的微生物，其中，编码丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因包含下述(a)或 (b)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 5所示的碱基序列的DNA ；(b)与SEQ ID NO 5所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探 针在严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的多肽的DNA。(10).上述的微生物，其经过修饰而增强了铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性。(11).上述的微生物，其经过修饰而提高了产生铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的能 力。(12).上述的微生物，其经过修饰而降低了苹果酸酶的活性。(13).上述的微生物，其经过修饰而降低了丙酮酸脱氢酶活性。(14).上述的微生物，其经过修饰从而能够以需氧方式同化乙醇。(15).上述的微生物，其中，所述微生物是属于选自埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌 属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属中的属的细菌。(16).上述的微生物，其中，该微生物的NAD型苹果酸酶和NADP型苹果酸酶二者的 活性均已降低。(17).上述的微生物，其中，所述微生物为棒状杆菌型细菌。(18). 一种生产L-氨基酸的方法，其中，在培养基中培养上述的微生物，使该培养 基中或菌体内生成并蓄积选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、 L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸。(19).上述的方法，其中，所述培养基的特征在于含有乙醇或脂肪酸作为碳源。
[图1]显示源自纤细裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸NADP+氧化还原酶 (PNO)基因的表达的Western印迹照片。泳道1 分子量标记，泳道2 :WC196 Δ cadA Δ IdcC/ pCABD2/pMW-Pthr 的粗酶抽提液，泳道 3 :WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PN0 的粗 酶抽提液发明的具体实施方式
以下，对本发明进行具体说明。<1>本发明的微生物本发明的微生物是具有生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、以及L-丝氨酸中的L-氨基酸的能力，且经过了修饰而 增强了丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化还原酶的活性的微生物。在本发明中，如无特殊说明，"L-氨基酸”是指所述的L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色 氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、和/或L-丝氨酸。“L-氨基酸生产能力”是指当在培养基中培养本发明的微生物时，以可从细胞或培 养基中回收的程度在细胞或培养基中生成、蓄积L-氨基酸的能力。本发明的微生物所生产 的L-氨基酸可以是1种氨基酸，也可以是2种或2种以上的L-氨基酸。作为具备L-氨基 酸生产能力的微生物，可以是本身具备L-氨基酸生产能力的微生物，也可以是通过利用突 变法或重组DNA技术对如下文所述的微生物进行修饰而具备了 L-氨基酸生产能力的微生 物，或者可以是通过导入本发明的基因而被赋予了 L-氨基酸生产能力的微生物。此外，“增强丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性”包括如下两方面含 义在本身具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的微生物中，增强所述两种酶中的 至少一种的活性；以及，对于赋予不具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的微生物， 赋予其所述两种酶中的至少一种酶的活性。<1-1>L-氨基酸生产能力的赋予本发明的微生物可以通过以具有L-氨基酸生产能力的微生物作为亲本株，对其 进行修饰以增强丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶或这两者的活性来获得。本发明 的微生物还可以通过以经过了修饰使得丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性增 强的微生物作为亲本株，并对其赋予或增强L-氨基酸生产能力来获得。以下，示例说明对微生物赋予L-氨基酸生产能力的方法以及能够在本发明中使 用的被赋予了 L-氨基酸生产能力的微生物。但是，微生物只要具有L-氨基酸生产能力，并 不限于此。作为用于本发明的微生物，可以列举例如，属于埃希氏菌属(Escherichia)、 肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏 菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属 (Morganella)等Y -变形细菌的肠杆菌科细菌，属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆 菌属(Corynebacterium) ^WtfMM (Microbacterium)的所谓棒状杆菌型(coryneform) 细菌，属于脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属 (Saccharomyces)等的微生物。Y -变形细菌可以使用依据NCBI (National Center for Biotechnology Information)分类学数据库 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax. cgi · id = 91347)公布的分类法归属的微生物。作为埃希氏菌属细菌，可以列举大肠杆菌(Escherichia coli)等。在采用基因工 程方法选育大肠杆菌时，可以使用大肠杆菌K-12株及其衍生物大肠杆菌MG1655株(ATCC 47076)和W3110株(ATCC 27325)。大肠杆菌K-12株是在1922年由斯坦福大学分离出来 的，它是λ噬菌体的溶原菌，具有F因子，是一种能够通过接合等手段来构建遗传重组体 的、通用性高的菌株。此外，大肠杆菌Κ-12株的基因组序列已经测定，其基因信息也可以自
10由地使用。大肠杆菌K-12株及其衍生株可以从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)零售 获得(住所ATCC，地址P. O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)。特别是，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为Y-变形细 菌(γ -Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J. Gen. Appl. Microbiol. 1997,43 :355_361 ；Int. J. Syst. Bacteriol. 1997,47 :1061_1067)。近年来， 依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(Int.J. Syst. Bacteriol. 1989, 39 337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(参照 Int.J. Syst. Bacteriol. 1993,43 162-173)。肠杆菌属细菌包括例如成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)等。具体地，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书示例 的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举成团肠杆菌ATCC12287株。作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛 菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体地，可以列举下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开0952221 号说 明书)Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开0952221 号说 明书)而且，所述菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中记载为成团肠杆菌，但 现在，如上文所述，依据16S rRNA碱基序列分析它们已被重新分类为Pantoea ananatis。作为欧文氏菌属细菌，可以列举解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜 软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)。具体地，可以列举下述菌株。解淀粉欧文氏菌ATCC15580株胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明 书)植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明 书)本发明所称的棒状杆菌型细菌包括这样的微生物，它们是在《Bergey’ sManual of Determinative Bacteriology》第8版599页(1974)中定义的一组微生物，包括为需氧性、 革兰氏阳性、非耐酸性、无芽孢形成能力的杆菌，曾经归类于短杆菌属(Brevibacterium) 但现在已经统一归类于棒杆菌属(Corynebacterium)的那些细菌(Liebl，W. et al. 1991， Int. J. Syst. Bacteriol. 41 :255_260)，还包括与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属细菌和微杆 菌属细菌。作为适于在L-谷氨酸类氨基酸的生产中应用的棒状杆菌型细菌，可以列举例如 以下所示的菌株。口誉乙酉先乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)0128]醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
0129]g醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
0130]^^llfiif (Corynebacterium callunae)
0131]谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
0132]百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)
0133]栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
0134]嗜热 产氨棒 杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes) Corynebacteriumefficiens)
0135]力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
0136]二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷M基酸棒杆lif (Corynebacterium glutamicum))
0137]H fe ^S ff Ir (Brevibacterium flavum) ( # M Sl # ff ^ Corynebacteriumglutamicum))
0138]Brevibacterium immariophilum
0139]乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨基酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum))
0140]玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
0141]角军H短杆菌(Brevibacterium saccharoIyticum)
0142]生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
0143]产氛短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(产氛棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes))
0144]白fe棒杆菌(Brevibacterium album)
0145]赌状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
0146]^mMMMM (Microbacterium ammoniaphilum)
0147]具体地，可以列举诸如下述的菌株。
0148]嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)
0149]谷氨酸棒杆菌ATCC13032
0150]黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826、ATCC14067
0151]乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13665、ATCC13869
0152]产氨短杆菌(产氨棒杆菌)ATCC6871
0153]用于本发明的细菌可以是具有乙醇同化性的细菌。作为这样的细菌，可以是本来 具有乙醇同化性的细菌，也可以是被赋予了乙醇同化性的重组菌株，还可以是提高了乙醇 同化性的突变菌株。在大肠杆菌中，作为在厌氧条件下生成乙醇的酶，已知有可逆地催化以 下反应的具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的AdhE的存在。乙酰-CoA+NADH+H+ —乙醛 +NAD++CoA乙醛 +NADH+H+ —乙醇 +NAD+大肠杆菌在需氧条件下不能同化乙醇，但已知其通过AdhE的突变，可变得能够以 需氧方式同化乙醇(Clark D. P.，and Cronan, J. Ε. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144 :179-184 ； MembrilΙο-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275 =33869-33875)。作为这样的具有
12突变的AdhE突变体，具体地有大肠杆菌AdhE的第568位的谷氨酸残基被谷氨酸和天冬氨 酸以外的氨基酸残基、例如赖氨酸取代而得到的突变体(Glu568Lys、E568K)。而且，所述AdhE突变体还可以包含以下的附加突变。A)第560位的谷氨酸残基被其它氨基酸残基、例如赖氨酸残基所取代；B)第566位的苯丙氨酸残基被其它氨基酸残基、例如缬氨酸残基所取代；C)第22位的谷氨酸残基、第236位的甲硫氨酸残基、第461位的酪氨酸残基、第 554位的异亮氨酸残基以及第786位的丙氨酸残基被其它氨基酸残基、例如分别被甘氨酸 残基、缬氨酸残基、半胱氨酸残基、丝氨酸残基以及缬氨酸残基所取代；或D)上述突变的组合。已知谷氨酸棒杆菌具有多种醇脱氢酶，能够以需氧方式同化乙醇(Pelechova， J. et al. 1980. Folia Microbiol (Praha) 25 :341_346)。用于本发明的细菌还可以是具有油脂或脂肪酸同化性的细菌。这样的细菌可 以是本来就具有油脂或脂肪酸同化性的细菌，也可以是赋予了油脂或脂肪酸同化性的 重组菌株，还可以是提高了油脂或脂肪酸同化性的突变菌株。已知在大肠杆菌中能够 同化链长 12 以上的长链脂肪酸(Clark，D. P. and Cronan, J. Ε. 1996. In Escherichia coli and Salmonella :Cellular andMolecular Biology/Second Edition(Neidhardt, F. C. Ed.) pp. 343-357)。而且，已知能够利用中链、短链脂肪酸的大肠杆菌突变株(Nunn, W. D. et al. 1979. J. Biol. Chem. 254 :9130_9134 ；Salanitro, J. P. and Wegener, W. S. 1971. J.Bacteriol. 108 :885_892)。在本发明中，具有L-氨基酸生产能力的细菌是指具有下述能力细菌当在培养基 中进行培养时，能够生产L-氨基酸、并能够使L-氨基酸在培养基中蓄积到可从培养基回收 的程度。优选能够使目的L-氨基酸以优选0. 5g/L以上、更优选1. 0g/L以上的量在培养基 中蓄积的细菌。L-氨基酸包括L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、 L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。特别是，优选L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色 氨酸。以下，说明对如上所述的细菌赋予L-氨基酸生产能力的方法，或增强如上所述的 细菌的L-氨基酸生产能力的方法。为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等 氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变株、L-氨基酸类似物抗性菌 株或代谢调节突变菌株，创建L-氨基酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见 《7 S 7酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这 里，在L-氨基酸生产菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性 质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达增强的L-氨基酸生物合成系 统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，营养缺陷突变、类似物抗性或代谢 调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强可以组合进行。具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突 变菌株可如下地获得对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即χ-射线或紫外线照 射或用诱变剂例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等处理；其后，从所得的突变菌株中选 择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌株。
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此外，可以通过进行基因重组增强酶活性，来赋予或增强L-氨基酸生产能力。就 酶活性的增强而言，包括例如通过修饰细菌以增强编码与L-氨基酸的生物合成相关的基 因的表达的方法。增强基因的表达的方法可以通过下述方式实现导入通过将包含所述基 因的DNA片段导入合适的质粒(例如至少包含负责质粒在微生物内的复制增殖功能的基因 的质粒载体)而得到的扩增质粒；或者通过接合、基因转移等使所述基因在染色体上多拷 贝化；抑或在这些基因的启动子区域导入突变等(参考国际公开小册子W095/34672号)。当向上文所述的扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达所述基因的启 动子可以是任何能够在属于肠杆菌科的细菌中发挥功能的启动子，可以是所使用的基因自 身的启动子，也可以是经过修饰的启动子。也可以通过适当地选择在L-氨基酸生产菌中强 力发挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表 达量的调节。如上所述的增强酶基因表达的方法，在W000/18935号小册子、欧洲专利申请 公开1010755号说明书等中有记载。下面，对于给细菌赋予L-氨基酸生产能力的方法、以及被赋予了 L-氨基酸生产能 力的细菌进行示例。L-赖氨酸生产菌属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例可以列举出对L-赖氨酸类似物具有 抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制在当 L-赖氨酸共存于培养基中时会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例可以列举出、但 不限于，氧代赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate), S_(2_氨乙基)_L_半胱氨酸 (AEC)，γ -甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通 过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来得到。可用于L-赖氨酸生产的菌 株的具体实例可以列举出大肠杆菌AJ11442(参考FERMBP-1543，NRRL B-12185 ；参见美国 专利第4，346，170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对由天冬氨酸激酶 的反馈抑制已被解除。WC196株可以用作大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌。该菌株是通过对大肠杆菌K_12 来源的W3110株赋予AEC抗性来选育获得的。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，于1994 年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综 合研究所专利生物保藏中心，〒305-8566日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第 6)，保藏号FERMP-14690，并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号 FERM ΒΡ-5252 (美国专利第 5，827，698 号)。作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株，可以列举出L-赖 氨酸生物合成系统酶的1种或者2种以上的活性被增强的菌株。相关的酶包括，但不限 于二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二 氨基庚二酸脱羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利第6，040, 160号)、磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、二氨 基庚二酸差向异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD) (tetrahydrodipicolinic acidsuccinylase)、琥拍酉先二氨基庚二酸脱酉先酶(dapE) (succinyl diamino pimelicacid deacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA) (EP 1253195A)。酶名称后的括号内为基因名称 (下同)。在这些酶中，特别优选为二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、 天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶。此外， 可以增强亲本株中下述基因的表达水平与能量效率相关的基因(cyo) (EP 1170376A)、 编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(PntAB)(美国专利第5，830，716号)、ybjE基因 (W02005/073390)、或所述基因的组合。作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-氨基酸生产菌的亲本株的例子，还可以列举 催化通过从L-氨基酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性 减少或者缺损的菌株。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之 外的化合物的反应的酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第 5，827，698 号)、和苹果酸酶(W02005/010175)。作为优选的L-赖氨酸生产菌，可以列举出大肠杆菌WC196 Amez/ pCABD2(W02005/010175)、WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2 (W02006/078039)等。WC196Amez/ PCABD2株是通过在WC196 Amez株中导入美国专利第6040160所述的质粒pCABD2而获得的 菌株，所述WC196 Δ mez株是通过破坏WC196株的编码苹果酸酶的sfcA和b2463基因而制 作的。WC196Amez株的详细情况在W02005/010175中有记载。sfcA基因和b2463基因的 碱基序列、以及各基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:52 55所示。WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2株是通过在编码赖氨酸脱羧酶的cadA以及IdcC基因 被破坏的WC196株中导入美国专利第6040160所述的质粒pCABD2而获得的菌株。pCABD2 包含编码具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变的大肠杆菌来源二氢吡啶二羧 酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变 的大肠杆菌来源天冬氨酸激酶III的突变型IysC基因、编码源自大肠杆菌的二氢吡啶二羧 酸还原酶的dapB基因、以及编码源自乳发酵短杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。L-苏氨酸生产菌作为具有L-苏氨酸生产能力的微生物优选实例可以列举出增强了 L-苏氨酸生物 合成系统酶的1种或2种以上的活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举出 天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸 激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶 (天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号里为该基因的简写符号(下同)。这些酶中特别优选天 冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移 酶、以及苏氨酸合酶。也可以将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受到抑制的埃 希氏属细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，例如可以列举出苏氨酸脱氢 酶活性缺损的TDH-6菌株(特开2001-346578号、美国专利第7，179，623号)。L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受最终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建 L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生产菌合成系统基因进行修饰以使所述酶不受L-苏氨 酸的反馈抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成 弱化子(attenuator)结构，苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制， 并且表达受到弱化作用的抑制。这种修饰可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现 (参照 Lynn，S. P. et al.，J. F. J. Mol. Biol. 194 :59_69 (1987)；国际公开第 02/26993 号小 册子；国际公开第2005/049808号小册子)。
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苏氨酸操纵子的上游存在天然启动子，但可以用非天然启动子将其取代(参考 W098/04715号小册子)，也可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表 达受到λ噬菌体的阻遏物Oppressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说 明书)。此外，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α -氨 基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来实现。对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的 是其在宿主内的拷贝数有所提高、或者是其连接于强启动子而表达量有所增加。除了通过 使用质粒的扩增来提高拷贝数之外，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组中转移 苏氨酸操纵子来提高拷贝数。理想的是，除了 L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强与糖酵解系统、TCA循环或 呼吸链相关的基因或调控基因表达的基因，或者糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中有效 的基因的实例可以列举出，转氢酶基因(PntAB)(欧洲专利733712号说明)、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶基因(PepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧 洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或者芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国 际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。此外，强化赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或对 宿主赋予L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是合适的。作为可以赋予抗性的基因的实例， 可以列举出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003) )、rhtB基因(欧洲专利申请 公开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)、yfiK、 yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗 性的方法，可以参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册 子中所记载的方法。作为L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列 举大肠杆菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美国专利第5，175，107号、美国专利第 5，705，371 号)、大肠杆菌 472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美国专利第 5，631，157 号)、大 肠杆菌NRRL-21593 (美国专利第5，939，307号)、大肠杆菌FERM BP-3756 (美国专利第 5，474，918 号)、大肠杆菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美国专利第 5，376，538 号)、大 肠杆菌 MG442 (Gusyatiner etal.，Genetika (俄语)，14，947-956 (1978))、大肠杆菌 VL643 和VL2055(EP1149911A)等属于埃希氏菌属的菌株，但不限于此。TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation) 0该菌株的rhtA基因也有赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性的突变。 B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到 由RSF1010获得的载体中而获得的。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸 脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于 All-UnionScientific Center of Antibiotics (全联盟抗生素禾斗学中心)(Nagatinskaya Street3-A, 117105 Moscow，Russia)，保藏号为 RIA 1867。该菌株也在 1987 年 4 月 7 日 保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)(1 Dorozhny proezd. ,1 Moscowll7545, Russia),保藏号为 B-3996。
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还可以使用大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作为L-苏氨酸生产菌或用于 衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株。B-5318菌株是异亮氨酸原养型的，并且PVIC40质粒中 的苏氨酸操纵子的调控区域被置换为温度敏感的λ噬菌体Cl阻遏物和冊启动子。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，1 Dorozhny proezd.，1 Moscowll7545, Russia)，保藏号为 VKPM B-5318。编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的大肠杆菌thrA基因已经阐明(核苷酸编 号 337 至 2799，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrA 基因位于大肠杆菌 K-12 染色体上thrL基因和thrB基因之间。大肠杆菌的编码高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明 (核苷酸编号 2801 至 3733，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB 基因位于大 肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。大肠杆菌的编码苏氨酸合酶的thrC 基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913. 2，gi =49175990)。 thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所述3个基因 全部作为一个单独的苏氨酸操纵子发挥功能。为增强苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子 中将影响转录的弱化子区域去除(W02005/049808，W02003/097839)。编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA 基因，以及thrB和thrC基因可以作为一个操纵子从熟知的PVIC40质粒中获得，该质粒存 在于苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996菌株中。pVIC40质粒在美国专利5，705，371中有 详述。大肠杆菌的rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的ISmin处，靠近编码谷氨酰 胺转运系统的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与0RFl(ybiF基因，核苷酸编号764至 1651，GenBank 登录号 AAA218541，gi =440181)相同，位于 pexB 与 ompX 基因之间。表 达由ORFl编码的蛋白的单元称为rhtA基因(rht:对高丝氨酸和苏氨酸抗性)。此外， 已经证明rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的_1位置用G — A取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生 物学协会年会摘要)，San Francisco, California, 1997 年 8 月 24-29 日，摘要号 457，EP 1013765A)。大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408，GenBank登录 号NC_000913. l,gi :16131307)，并且可以根据该基因的碱基序列利用引物通过PCR来获得 (参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。其它微生物的asd基因可以通过类 似方式获得。此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸编号983742至984932，GenBank登 录号NC_000913. 1，gi :16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以 通过类似方式获得。L-色氨酸生产菌L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例包括、但不限于 下述属于埃希氏菌属的菌株，如可以使用由突变的trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成 酶缺陷的大肠杆菌 JP4735/pMU3028(DSM10122)和 JP6015/pMU91 (DSM10123)(美国专利
175，756，345)；具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码 不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因的 大肠杆菌SV164(pGH5)(美国专利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美国专利 4，371，614)；产生磷 酸烯醇丙酮酸的能力增强的大肠杆菌AGXl7/pGX50，pACKG4-pps (W09708333，美国专利 6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增加的产生 L-色氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。L-色氨酸生产菌和用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出下述 菌株，该菌株的选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3- r才# * -D- 7，7 7 口 >酸-7-〗J >酸* >夕一 七)(aroG)、3_脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇 丙酮酉先莽草酸 3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase) (aroA)、分 支酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1种或2种以 上的酶的活性被增强。预苯酸脱水酶以及分支酸变位酶作为双功能酶(CM-PD)，由pheA基 因编码。在这些酶中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸 合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、预 苯酸脱水酶、分支酸变位酶_预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者 均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此也可以向这些酶中导入使反馈抑制解除的突 变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164 和通过将质粒PGH5 (W0 94/08031)转入大肠杆菌SV164获得的菌株，所述质粒pGH5包含突 变的serA基因，该突变的serA基因编码反馈抑制被解除了的磷酸甘油酸脱氢酶。L-色氨酸生产菌或者用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出， 导入了包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(特开昭 57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利4，371，614)。此外，可以也通过增强色氨酸操 纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由 α和β亚基组成，这两种亚基分别由trpA和trpB基因编码。另外，还可以通过增强异柠 檬酸裂解酶_苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(W02005/103275)。L-苯丙氨酸生产菌L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列 举出，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻 遏物缺损的大肠杆菌 AJ12739(tyrA: :Tnl0，tyrR) (VKPM B-8197) (W003/044191)，携带了 编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶_预苯酸脱水酶的突变型pheA34基因的大肠杆菌 HW1089(ATCC55371)(美国专利第 5，354，672 号)，大肠杆菌MWEC101_b (KR8903681)、大肠杆 菌 NRRL B-1214UNRRL B_12145、NRRL B-12146 以及 NRRLB-12147 (美国专利第 4，407，952 号)等。此外，也可以使用携带有编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基 因的大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERMBP-12662)以及 命名为 AJ 12604 的大肠杆菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作 为亲本株(EP 488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性增强的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1以及 2003/0157667AUW003/044192)。L-缬氨酸生产菌L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株实例包括、但不限于经修 饰从而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5，998，178)。理想的是将ilvGMEDA操纵 子中对于衰减作用而言必要的区域移除，以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削 弱。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还包括具有氨酰 t-RNA合成酶中的突变的突变株(美国专利5，658，766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970， 该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在 1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny Proezd.)，保藏号为 VKPM B-4411。此外，还可以使用生长需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突变株(W096/06926、美国 专利第5，888，783号)作为亲本株。此外，作为属于埃希氏菌属的L-缬氨酸生产菌，还可以使用H-81(VKPMB_8066)、 NRRL B-12287 和NRRL B-12288 (美国专利 4，391，907)、VKPMB_4411 (美国专利 5，658，766)、 VKPM B-7707(欧洲专利申请1016710A2)等。H-81株于2001年1月30日保藏于俄罗斯国 立工业微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny proezd. , 1 Moscow 117545，Russia)，保藏号 VKPM B-8066，并于2002年2月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏。L-亮氨酸生产菌L-亮氨酸生产菌或者用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、 但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株 57 (VKPM B-7386，美国专利第6，124，121号))或对β _2_噻吩基丙氨酸、3-羟基亮氨 酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭 62-34397号和特开平8-70879号)、通过W096/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆 菌菌株、大肠杆菌Η-9068 (特开平8-70879号)等。可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明的 细菌。这些基因的实例可优选列举IeuABCD操纵子中的基因，所述操纵子中的基因以突变 的IeuA基因为代表，该基因编码对L-亮氨酸反馈抑制具有抗性的异丙基苹果酸合酶(美 国专利6，403，342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的1种以上 的基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基 因)(EP1239041A2)。L-异亮氨酸生产菌L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、 但不限于对6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似 物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变株，以及对DL-乙 硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。 此外，还可以使用以编码苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase)等涉及 L-异亮氨酸生物合成的蛋白质的基因转化的重组 株(特开平2-458号，FR 0356739，和美国专利第5，998，178号)作为亲本株。L-丝氨酸生产菌作为L-丝氨酸生产菌或用于衍生L-丝氨酸的亲本株的例子，可以列举出携带 丝氨酸反馈抑制减弱的3-磷酸甘油酸脱氢酶的大肠杆菌(专利2584409号、美国专利第 5，618，716号)。此外，还可以使用具有L-丝氨酸生产能力且磷酸丝氨酸磷氧化酶活性或 磷酸丝氨酸转氨酶活性中的至少一种增强的棒状杆菌型细菌、L-丝氨酸分解能力缺失的 棒状杆菌型细菌(特开平11-253187号、美国专利第6，037，154号)、以及偶氮丝氨酸或 β -(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性的具有L-丝氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌(特开平 11-266881号、美国专利第6，258，573号)。当通过基因重组来选育上述L-氨基酸生产菌时，所使用的基因不限于具有上述 基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不损害所编码的蛋白质的功能的前提下，也可 以使用这些基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因。即，还可以是编码具有在公 知蛋白质的氨基酸序列中在1个或数个位置上取代、缺失、插入或添加1个或者数个氨基酸 而得到的序列的蛋白质的基因。关于“保守突变”，在后面关于丙酮酸合酶等的内容中有描 述，其也适用于上述基因。<1-2>丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的增强本发明的微生物是对诸如上述的具有L-氨基酸生产能力的微生物进行了修饰使 得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性增强而得到的微生物。对于增强丙酮 酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的修饰而言，优选进行修饰使得与亲本株例如野生 株、非修饰株相比，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶活性增强。而且，正如所述，当 微生物本来不具有丙酮酸合酶活性时，通过修饰而具有了该酶活性的微生物，其丙酮酸合 酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶活性与非修饰株变得更强。可以先对细菌进行修饰使得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的酶活性 提高，然后再赋予L-氨基酸生产能力。而且，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶活性 的增强可以采用如前文所述的增强基因表达的方法来进行。即，可以通过以启动子修饰为 代表的表达调节区域修饰等来增强内源性丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化还原酶基 因的表达，也可以通过在细菌中导入包含丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化还原酶基因 的质粒或通过在细菌染色体上导入所述基因等来增强外源性丙酮酸合酶基因的表达。本发明中的“丙酮酸合酶”是指在电子供体存在下，例如在铁氧还蛋白或者黄 素氧还蛋白存在下，可逆地催化由乙酰基-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反应的酶(EC 1. 2. 7. 1)。丙酮酸合酶也可简称为PS，或者有些情况下还被命名为丙酮酸氧化还原酶、丙酮 酸铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶或丙酮酸氧化还原酶。作为电 子供体，可以使用铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白。还原型铁氧还蛋白+乙酰_CoA+C02 —氧化型铁氧还蛋白+丙酮酸+CoA丙酮酸合酶的活性增强的确认，可以通过从增强前微生物和增强后的微生物制备 粗酶液、并比较它们的丙酮酸合酶活性来实现。丙酮酸合酶的活性可以按照例如Yoon等的 方法(Υοοη, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167 :275_279)来测定。例如，向包含作为 电子受体的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶液的反应液中添加丙酮酸，采用光谱学方法测定因 丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型甲基紫精的量，这样就可以测定丙酮酸合酶的活性。1个酶活性单位(U)表示为每1分钟1 μ mol甲基紫精的还原量。当亲本株具有丙酮酸合 酶活性时，理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1. 5倍以上、更优选2倍以上、更优 选3倍以上。此外，当亲本株不具有丙酮酸合酶活性时，只要通过导入丙酮酸合酶基因生 成丙酮酸合酶即可，但理想的是，优选酶活性被增强到可测定的程度，优选0. 001U/mg (菌 体蛋白)以上、更优选0.005U/mg以上、更优选0.01U/mg以上。丙酮酸合酶对氧敏感，通常 来说其活性表达和测定也往往较为困难(Buckel，W. and Golding，B. Τ. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60 27-49)。因此，在测定酶活性时，优选如实施例中描述的那样，降低反应容器 中的氧浓度来进行酶反应。作为编码丙酮酸合酶的基因，可以利用绿硫菌(Chlorobium t印idum)、嗜热氢杆 菌(Hydrogenobacter thermophilus)等具有还原性TCA循环的细菌的丙酮酸合酶基因。 此外，也可以利用以大肠杆菌(Escherichia coli)代表的属于肠杆菌科细菌群(腸内細菌 群)的细菌来源的丙酮酸合酶基因。而且，作为编码丙酮酸合酶的基因，还可以利用海藻甲 ；求胃(Methanococcusmaripaludis)、；氏甲;求胃(Methanocaldococcus jannaschii)、 高温弯曲甲烧热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等自养型产甲烧古细 菌(autotrophic methanogens)的丙酮酸合酶基因。具体地，作为绿硫菌(Chlorobium t印idum)的丙酮酸合酶基因，可以列举出具 有位于绿硫菌基因组序列(GenBank登录号NC_002932)的碱基序号1534432 1537989 的、SEQ ID NO :1所示的碱基序列的基因。SEQ ID NO :2中示出了该基因编码的氨基 酸序列(GenBank登录号AAC76906)。此外，已知嗜热氢杆菌的丙酮酸合酶由δ亚基 (GenBank 登录号ΒΑΑ95604)、α 亚基(GenBank 登录号 ΒΑΑ95605)、β 亚基(GenBank 登 录号:ΒΑΑ95606)、γ亚基(GenBank登录号:ΒΑΑ95607)这4个亚基的复合体形成(Ikeda， Τ. etal. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340 :76_82)。而且，还可以示例出由位于幽 门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)基因组序列(GenBank登录号NC000915)的碱基序 号1170138 1173296的HP1108、HP1109、HP1110、HPllll这4个基因构成的丙酮酸合 酶基因，由硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)基因组序列(GenBank登录号NC 002754)的碱基序号 1047593 1044711 所示的 SS01208、SS07412、SS01207、SS01206 这 4 个基因编码的丙酮酸合酶基因。而且，丙酮酸合酶基因还可以基于与上述示例的基因的同 源性，从绿硫菌属(Chlorobium)、脱硫菌属(Desulfobacter)、产液菌属(Aquifex)、氢杆菌 属(Hydrogenobacter)、热变形菌属(Thermoproteus)、热棒菌属(Pyrobaculum)细菌等中 克隆。在大肠杆菌中，ydbK基因(bl378)位于K_12株基因组序列(GenBank登录号 U00096)的碱基序号1435284 1438808，具有SEQ ID NO 3所示的碱基序列；从序列同源 性推测，其编码丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、即丙酮酸合酶。SEQ ID NO :4中示出了该 基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号AAC76906)。如实施例所示，证实了该基因产物具 有丙酮酸合酶活性，通过强化该基因的表达，能够提高L-氨基酸生产能力。而且，丙酮酸合 酶基因还可以是与大肠杆菌丙酮酸合酶基因(ydbK)具有高同源性的、属于埃希氏菌属、沙 门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、志贺氏菌属 (Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等肠杆菌科细菌群的丙酮酸合酶基因。海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)的丙酮酸合酶由位于海沼甲
21烧球菌基因组序列(GenBank 登录号NC_005791) (Hendrickson, Ε. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186 -.6956-6969)的碱基序号 1462535 1466397 的 porCDABEF 操纵子编码 (Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179. 444-456)。已知该丙酮酸合酶包含 Y、α、 β和δ这4个亚基，除了所述亚基之外，PorE和PorF对丙酮酸合酶的活性而言也是重要 的(Lin，W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181 :68_73)。γ 亚基由基因组序列 的碱基序号1465867 1466397 (互补链)的porA基因编码，SEQ ID NO :56中示出了其碱 基序列，SEQ ID NO 57中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号NP_988626)。 δ亚基由基因组序列的碱基序号1465595 1465852 (互补链)的porB基因编码，SEQ ID NO :58中示出了其碱基序列，SEQ ID NO :59中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank 登录号ΝΡ_988627)。α亚基由基因组序列的碱基序号1464410 1465573 (互补链)的 porC基因编码，SEQ ID NO :60中示出了其碱基序列，SEQ ID NO :61中示出了该基因编码的 氨基酸序列(GenBank登录号ΝΡ_988625)。β亚基由基因组序列的碱基序号1463497 1464393(互补链)的porD基因编码，SEQ ID NO :62中示出了其碱基序列，SEQ ID NO 63 中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号NP_988624)。PorE由基因组序列碱 基序号1462970 1463473 (互补链)的porE基因编码，SEQ ID NO :64中示出了其碱基序 列，SEQ ID NO :65中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号NP_988623)。PorF 由基因组序列碱基序号1462535 1462951 (互补链)的porF基因编码，SEQ ID NO 66中 示出了其碱基序列，SEQ ID NO :67中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号 NP_988622)。已知自养型的甲烷生成古细菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、 高温弯曲甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等也具有相同基因结 构的丙酮酸合酶基因，可以加以利用。本发明中，“丙酮酸NADP+氧化还原酶”是指在电子供体存在下，例如在NADPH或 者NADH存在下，可逆地催化由乙酰-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反应的酶(EC 1. 2. 1. 15)。 丙酮酸NADP+氧化还原酶有时简称为ΡΝ0，有些情况下还被命名为丙酮酸脱氢酶。然而， 本发明中在提及“丙酮酸脱氢酶活性”时，是指如文后述的催化丙酮酸氧化脱碳酸生成乙 酰-CoA的反应的活性，催化该反应的丙酮酸脱氢酶(PDH)与丙酮酸NADP+氧化还原酶不 是同一种酶。丙酮酸NADP+氧化还原酶可以利用NADPH或者NADH作为电子供体。NADPH+ 乙酰 _CoA+C02 — NADP++ 丙酮酸 +CoA丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性增强这一事实的确认，可以通过从增强前的微生 物和增强后的微生物制备粗酶液、并比较它们的丙酮酸NADP+氧化还原酶活性来实现。丙 酮酸NADP+氧化还原酶的活性可以按照例如Inui等的方法(Inui，H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 =9130-9135)来测定。例如，向包含作为电子受体的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶 液的反应液中添加丙酮酸，采用光谱学方法测定由于丙酮酸的脱碳酸反应而增加的还原型 甲基紫精的量，这样就可以测定丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性。1个酶活性单位(U)表 示为每1分钟1 μ mol甲基紫精的还原量。当亲本株具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性时， 理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1. 5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以 上。此外，当亲本株不具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性时，只要通过导入丙酮酸NADP+ 氧化还原酶基因可生成丙酮酸NADP+氧化还原酶即可，但理想的是，优选酶活性被强化到
22可测定的程度，优选0. 001U/mg (菌体蛋白)以上、更优选0. 005U/mg以上、更优选0. 01U/mg 以上。丙酮酸NADP+氧化还原酶对氧敏感，因而其活性表达和测定通常来说也存在许多困 难(Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 :9130_9135 ；Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 :710-720)。在由于失活等原因无法测定活性的情况下，可以像实施例所述那样，通 过Western印迹等方法来确认蛋白质的表达。编码丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因除了作为光合成真核微生物(也被分类为 原生动物)的纤细裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化还原酶基因(Nakazawa， Μ. et al. 2000. FEBS Lett. 479 155-156)、原生生物小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的丙酮酸NADP+氧化还原酶基因(Rotte，C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 710-720)之外，已知在硅藻假微型海链藻(Tharassiosira pseudonana)中也存在同源基 因(Ctrnacta，V.et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53 :225_231)。具体地，作为纤细裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化还原酶基因，可 以示例出具有SEQ ID NO :5所示的碱基序列的基因(GenBank登录号AB021127)。SEQ ID NO 6中示出了该基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号BAB12024)。本发明的微生物还可以是经过了如下的修饰而使得丙酮酸合酶的活性增强的微 生物，所述修饰使得与亲本株例如野生株或非修饰株相比，将电子供体从氧化型再生为还 原型的活性(该活性对于丙酮酸合酶的活性而言是必需的)增强。将氧化型电子供体再生 为还原型的活性包括例如铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性。此外，还可以是经过了如下的修 饰而使得丙酮酸合酶的活性增强的微生物，所述修饰除了增强电子供体的再生活性之外还 增加丙酮酸合酶基因的表达。而且，上述亲本株可以是天然内在地具有编码电子供体的再 生活性的基因的微生物，也可以是并非天然具有电子供体的再生活性，但通过导入编码该 活性的基因而被赋予了该活性，从而L-谷氨酸生产能力变得更高的微生物。“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”是指可逆地催化以下反应的酶(EC1. 18. 1. 2)。还原型铁氧还蛋白+NADP+-—氧化型铁氧还蛋白+NADPH+H+本反应是可逆反应，能够在NADPH和氧化型铁氧还蛋白的存在下生产还原型铁 氧还蛋白。铁氧还蛋白可以替换成黄素氧还蛋白，命名为黄素氧还蛋白-NADP+还原酶 的酶也具有同等功能。已经确认铁氧还蛋白-NADP+还原酶在从微生物到高等生物中普 遍存在(参照 Carrillo, N.和 Ceccarelli, Ε. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270 :1900_1915 ； Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698 :155_165)，其也被命名为铁氧 还蛋白-NADP+氧化还原酶、NADPH-铁氧还蛋白氧化还原酶。铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性已增强这一事实的确认，可以通过从修饰前的微 生物和修饰后的微生物制备粗酶液，并比较它们的铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性来实现。 铁氧还蛋白-NADP+还原酶的活性可以按照例如Blaschkowski等的方法(Blaschkowski， H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123 :563-569)来测定。例如，可以通过以铁氧还蛋白作 为底物、采用光谱学方法测定减少的NADPH的量来测定。1个酶活性单位(U)表示为每1分 钟1 μ moINADPH的氧化量。当亲本株具有铁氧还蛋白-NADP+还原酶活性时，如亲本株的活 性充分高，则没有增强的必要，但理想的是，与亲本株相比较，酶活性上升优选1. 5倍以上、 更优选2倍以上、更优选3倍以上。已经在许多生物物种中发现了编码铁氧还蛋白-NADP+还原酶的基因，这些基因只要在目的L-氨基酸生产株中有活性即可加以使用。在大肠杆菌中，作为黄素氧还蛋 白-NADP+还原酶，已经鉴定出的有 fpr 基因(Bianchi，V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175 1590-1595)。此外，已知在恶臭假单胞菌(Psuedomonas putida)中NADPH-假单胞氧还蛋 白还原酶(Putidaredoxinreductase)基因和假单胞氧还蛋白(Putidaredoxin)基因以操 纵子的形式存在(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106 :831_836)。大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶包括，例如，位于大肠杆菌K-12株基因组 序列(Genbank登录号.U00096)的碱基序号4111749 4112495 (互补链)的、具有SEQ ID NO 7所示的碱基序列的fpr基因。SEQ ID NO :8中示出了 Fpr的氨基酸序列(Genbank登录 号.AAC76906)。此外，在谷氨酸棒杆菌基因组序列(Genbank登录号.BA00036)的碱基序号 2526234 2527211中发现了铁氧还蛋白-NADP+还原酶基因(Genbank登录号.BAB99777)。对丙酮酸合酶的活性而言，存在铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白作为电子供体是必要 的。因此，也可以是经过修饰使得铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力提高，从而丙酮酸 合酶的活性增强的微生物。此外，除了进行修饰以增强丙酮酸合酶的活性或者增强黄素氧还蛋白-NADP+还原 酶和丙酮酸合酶的活性之外，还可以进行修饰来提高铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能 力。本发明中，“铁氧还蛋白”是指含有非卟啉铁原子(Fe)和硫原子，并结合有称作 4Fe-4S、3Fe-4S、或者2Fe-2S簇的铁-硫簇的蛋白质，其作为单电子传递体发挥功能。“黄 素氧还蛋白”是指包含FMMFlavin-mononucleotide，黄素单核苷酸)作为辅基的、发挥单 电子或者双电子传递体功能的蛋白质。关于铁氧还蛋白和黄素氧还蛋白，在McLean等的文 献中有记载(McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33 :796_801)。而且，用于修饰的亲本株可以是天然内在地具有编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白 的基因的菌株，也可以是天然不具有铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白基因、但通过导入铁氧还 蛋白或黄素氧还蛋白基因而被赋予了活性，从而L-谷氨酸生产能力提高的菌株。铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力与亲本株(例如野生株或非修饰株)相比 有所提高的事实，可以通过将铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的mRNA的量与野生型或者非修 饰株比较来加以确认。作为表达量的确认方法，可以列举Nothern杂交、RT-PCR(Sambrook， J. et al.1989. Molecular Cloning ALaboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork)。关于表达量，只要是与野生株或者非修饰株相比较 有所上升即可，理想的是，例如与野生株、非修饰株相比，上升1.5倍以上、更优选2倍以上、 更优选3倍以上。此外，铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的生产能力与亲本株(例如野生株或非修 饰株)相比有所提高的这一事实的确认，可以通过SDS-PAGE、二维电泳或者使用抗体的 Western Ep^jft^illJ (Sambrook, J. et al. 1989. MolecularCloning A Laboratory Manual/ Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)。关于生产量，只要与 野生株或者非修饰株相比较有所提高可以是任何量，理想的是，例如与野生株、非修饰株相 比上升1. 5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。铁氧还蛋白以及黄素氧还蛋白的活性可以通过将其添加至适当的氧化还原反应 体系中来测定。例如，Boyer等公开了下述方法通过铁氧还蛋白-NADP+还原酶还原产生的铁氧还蛋白，对由生成的还原型铁氧还蛋白引起的细胞色素C的还原进行定量(Boyer， Μ. Ε. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94 :128_138)。此外，黄素氧还蛋白的活性可以通过 使用黄素氧还蛋白-NADP+还原酶以相同的方法测定。编码铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的基因分布广泛，任何基因，只要其编码出的铁 氧还蛋白或黄素氧还蛋白能够被丙酮酸合酶和电子供体再生系统所利用，都可以加以使 用。例如，在大肠杆菌中，作为编码具有2Fe_2S簇的铁氧还蛋白的基因，有fdx基因(Ta， D.T.和 Vickery，L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267 11120-11125)，而 yfhL 基因被预想是编 码具有4Fe-4S簇的铁氧还蛋白的基因。此外，作为黄素氧还蛋白基因，已知有fldA基 因(Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173 :1729_1737)和 fldB 基因(Gaudu, P.和 Weiss,B. 2000. J. Bacteriol. 182 1788-1793)。在谷氨酸棒杆菌的基因组序列(Genbank 登 录号.BA00036)中，在碱基序号562643 562963位发现了铁氧还蛋白基因fdx(Genbank 登录号.BAB97942)，而且在碱基序号1148953 1149270位发现了 fer (Genbank登录 号.BAB98495)。此外，在绿硫菌中，存在许多铁氧还蛋白基因，其中，铁氧还蛋白I以及铁氧 还蛋白II被鉴定为作为丙酮酸合酶的电子受体的4Fe-4S型铁氧还蛋白基因(Υοοη,Κ. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276 :44027_44036)。还可以使用嗜热氢杆菌的铁氧还蛋白基因等来 源于具有还原型TCA循环的细菌的铁氧还蛋白基因或黄素氧还蛋白基因。具体地，大肠杆菌的铁氧还蛋白基因包括例如位于大肠杆菌K-12株基因组序列 (Genbank登录号· U00096)的碱基序号2654770 2655105位(互补链)的SEQ ID NO 9 所示的fdx基因、以及位于碱基序号2697685 2697945位的SEQ ID NO 11所示的yfhL 基因。SEQ ID NO 10以及SEQ ID NO 12中示出了 Fdx以及YfhL的氨基酸序列(分别为 Genbank登录号.AAC75578以及AAC75615)。作为大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因，包括例如 位于大肠杆菌K-12株基因组序列(Genbank登录号.U00096)的碱基序号710688 710158 位(互补链)的SEQ ID NO :13所示的fldA基因、以及位于碱基序号3037877 3038398位 的 SEQ ID NO 15 所示的 fldB 基因。SEQ IDNO 14 以及 SEQ ID NO 16 中示出了 fldA 基因 以及fldB基因所编码的氨基酸序列(分别为Genbank登录号.AAC73778以及AAC75933)。作为绿硫菌的铁氧还蛋白基因，包括例如位于绿硫菌基因组序列(Genbank登录 号.NC_002932)的碱基序号1184078 1184266位的SEQ IDNO 17所示的铁氧还蛋白I基 因、以及位于碱基序号1184476 1184664位的SEQ ID NO :19所示的铁氧还蛋白II基因。 SEQ ID NO 18以及SEQ IDNO 20中示出了铁氧还蛋白I以及铁氧还蛋白II所编码的氨基 酸序列(分别为Genbank登录号.AAM72491以及AAM72490)。此外，还可列举嗜热氢杆菌 的铁氧还蛋白基因(Genbank登录号.BAE02673)、硫磺矿硫化叶菌基因组序列中的碱基序 号2345414 2345728位所示的硫磺矿硫化叶菌的铁氧还蛋白基因。而且，还可以是基于 与上述示例的基因的同源性，从绿菌属、脱硫菌属(Desulfobacter)、产液菌属(Aquifex)、 氢杆菌属、热变形菌属(Thermoproteus)、热棒菌属(Pyrobuculum)细菌等克隆的基因， 而且还可以是从肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森菌属等Y-变 形细菌，谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌等棒状杆菌型细菌；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等假单胞菌属细菌；以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等分 枝杆菌属(Mycobacterium)细菌等中克隆的基因。这些编码丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白的基因(以下统称为本发明的基因)还可以使用具有保守突变的基因，如所述基因的同源物或 人工变体等，以不损害编码的蛋白质的活性即功能为限。也就是说，可以是编码具有在公知 的蛋白质的氨基酸序列或野生型蛋白质的氨基酸序列中的1个或者数个位置上发生1个或 者数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的保守变体的基因。这里所 说的1个或者数个，因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的位置、氨基酸的种类而异，优选是 1 20个、更优选1 10个、特别优选1 5个。上述突变优选是保守取代，其是功能上无变化的中性突变。关于保守取代，当取代 位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间的相互取代的突变；当取代位点是疏水氨基 酸时为Leu、Ile和Val之间的相互取代的突变；当取代位点是极性氨基酸时为Gln和Asn 之间的相互取代的突变；当取代位点是碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间的相互取代的 突变；当取代位点是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间的相互取代的突变；当取代位点是具 有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互取代的突变。更具体地，可以列举用Ser或Thr取代Ala ；用Gln、His或Lys取代Arg ；用Glu、 Gin,Lys,His 或 Asp 取代 Asn ；用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp ；用 Ser 或 Ala 取代 Cys ；用 Asn、 Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln ；用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu ；用 Pro 取代 Gly ； 用 Asn、Lys, Gin、Arg 或 Tyr 取代 His ；用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 Ile ；用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu ；用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys ；用 lie、Leu、Val 或 Phe 取代 Met ； 用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取代 Phe ；用 Thr 或 Ala 取代 Ser ；用 Ser 或 Ala 取代 Thr ；用 Phe或Tyr取代Trp ；用His、Phe或Trp取代Tyr ；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，这 样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带本发明的基因的微生物的 个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺 失、插入、添加或倒位。此外，还可以替换成在本发明的基因所导入的各个宿主中易于使用的密码子。同 样地，本发明的基因只要具有功能即可，所编码的蛋白质的N末端侧和/或C末端侧可以被 延长或截短。例如，延长的长度是50个以下、优选20个以下、更优选10个以下、特别优选 5个以下的氨基酸残基。编码如上所述的保守变体的基因，例如可以通过定点突变方法对碱基序列进行修 饰，使得被编码的蛋白的特定位点上的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加，来获得这 样的基因。此外，还可以通过传统公知的突变处理来获得。突变处理包括例如用羟胺等对 本发明的基因进行体外处理的方法，以及对携带该基因的微生物(例如埃希氏菌属细菌) 采用紫外线照射或使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常 规突变处理中使用的突变剂来进行处理的方法。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插 入、增加或倒位等还包括因基于携带本发明的基因的微生物的个体差异、种间差异等情形 而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。至于 这些基因是否编码有功能的丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、铁氧还蛋白或黄素氧 还蛋白，可以通过例如将这些基因导入具有L-氨基酸生产能力的微生物，并测定各基因产 物的活性来予以确认。本发明的基因可以是能够与具有上述碱基序列的DNA或可由与具有所述碱基序 列的DNA制备的探针在严格条件下杂交，并且编码丙酮酸合酶、铁氧还蛋白-NADP+还原酶、
26铁氧还蛋白、或黄素氧还蛋白的DNA。这里，“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。 将该条件明确地数值化是困难的，举一实例具有高同源性的DNA(例如具有70%以上，优 选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上同源性的DNA)目互杂交，而同源性较 之为低的DNA则不互相杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60°C， 1XSSC、0. 1% SDS，优选 0. 1XSSC、0. 1% SDS，更优选 68°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS 相当的盐 浓度、温度下洗涤1次，优选2 3次的条件。而且，在本说明书中，“同源性”(homology) 有时是指“同一性”(identity)。探针也可以具有本发明的基因的一部分序列。这样的探针可以采用本领域技术人 员熟知的方法，以基于各基因的碱基序列制备的寡核苷酸为引物，以包含各基因的DNA片 段为模板进行PCR反应来加以制备。而且，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时， 作为在上述条件下杂交后的洗涤条件，例如可以是50°C、2XSSC、0. 1% SDS。上述关于保守变体的描述同样适用于所述的L-氨基酸生产能力的赋予中描述的 酶和基因。如上文所述的用于增强本发明基因之表达的修饰，可以依照赋予L-氨基酸生产 能力的相关记载中描述的增强目的基因表达的方法来进行。本发明的基因可以利用携带该 基因的微生物的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。例如，绿硫菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQ ID N0:1的碱基序列制 备的引物，例如SEQ ID NO :35、36所示的引物，以绿硫菌的基因组DNA为模板，通过 PCR(polymerase chain reaction) Tj ^ U ( # # White, Τ. J. et al. 1989. Trends Genet. 5 :185—189)。大肠杆菌的丙酮酸合酶基因可以使用基于SEQ ID N0. 3的碱基序列制备的引物， 使用例如SEQ ID NO :38、39所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR来获得。纤细裸藻的丙酮酸=NADP+氧化还原酶基因可以使用基于SEQ ID NO 5制备的引 物，例如如SEQ ID NO :40、41所示的引物，以纤细裸藻的基因组DNA为模板，通过PCR法来获得。大肠杆菌的黄素氧还蛋白-NADP+还原酶基因可以使用基于SEQ IDNO 7的碱基序 列制备的引物，例如SEQ ID NO :42、43所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过 PCR法获得。大肠杆菌的铁氧还蛋白基因fdx可以使用基于SEQ ID NO :9的碱基序列制备的引 物，例如SEQ ID NO :44、45所示的引物，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR法获得。大肠杆菌的黄素氧还蛋白基因fidA和黄素氧还蛋白基因fldB可以分别使用基于 SEQ ID N0:13的碱基序列和基于SEQ ID NO 15的碱基序列制备的引物，以大肠杆菌的基 因组DNA为模板，通过PCR法获得。此外，绿硫菌的铁氧还蛋白I基因和铁氧还蛋白II基因可以分别使用基于SEQ ID NO 17和基于SEQ ID NO 19的碱基序列制备的引物，以绿硫菌的基因组DNA为模板，通过 PCR法获得。对来源其它微生物的本发明的基因，也可以以基于上述各基因的序列信息或该微
27生物的公知基因或蛋白质序列信息制备的寡核苷酸为引物，通过PCR法，或者，以基于所述 序列信息制备的寡核苷酸为探针，通过杂交法，从该微生物的基因组DNA或基因组DNA文库 获得。而且，基因组DNA可以从作为DNA供体的微生物采用例如Saito和Miura的方法(参 M Saito, H.和 MiuraX I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72,619-629 ；生物工学実験書，日 本生物工学会編，97 98页，培風館，1992年)等来制备。本发明基因以及L-氨基酸生物合成系统基因的表达的增强，可以通过采用如上 述的方法，利用转化或同源重组来提高本发明基因的拷贝数，或者修饰本发明基因的表 达调节序列来实现。此外，本发明基因的表达增强，可以通过扩增能够提高本发明基因 的表达的激活子(activator)、和/或缺失或弱化能够降低本发明基因的表达的调节子 (regulator)来实现。以下，对增强基因表达的方法进行说明。第一种方法是提高目的基因的拷贝数的方法。例如，可以通过将目的基因克隆在 适当的载体上，并用所得载体转化宿主细菌，提高该基因的拷贝数。作为用于转化的载体，可以列举能够在使用的微生物中自主复制的质粒。例如， 作为能够在属于肠杆菌科类细菌的微生物中自主复制的质粒，可以列举pUC19、pUC18、 pBR322、RSFlO 10、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29 (pHSG、pSTV 可从 TAKARA Bio 公司获得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可从NIPPON GENE 公司获得) 等。此外，作为棒状杆菌型细菌用的质粒，可以列举PAM330 (特开昭58-67699号公报)、 PHM1519 (特开昭58-77895号公报)>pSFK6 (参照特开2000-262288号公报)、pVK7 (美国专 利申请公开说明书 2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特开昭 58-192900 号公报)、 pCGl (特开昭57-134500号公报)、pCG2 (特开昭58-35197号公报)、pCG4、pCGll (特开昭 57-183799号公报)、pHK4(特开平5-7491号公报)等。此外，从这些载体中取出具有使质 粒得以在棒状杆菌型细菌中自主复制的能力的DNA片段，并将其插入到所述大肠杆菌用载 体中，可以作为能够在大肠杆菌以及棒状杆菌型细菌这两者中自主复制的所谓穿梭载体来 使用。而且，还可以使用噬菌体DNA代替质粒作为载体。作为转化方法，可以列举例如用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的 方法，如已被报道用于大肠杆菌K-12的方法(Mandel，Μ·和Higa，A. J. Mol. Biol. 1970.53 159-162)，或者从处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法，如已被报道用 于枯草芽孢杆菌的方法(Duncan，C. H. et al. 1997. Gene 1:153-167)。或者，还可以应用将 DNA受体菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA 导入DNA受体菌的方法，该方法已知用于枯草杆菌、放线菌类和酵母(Chang，S. and Choen, S. N.，1979. Mol. Gen. Genet. 168 :111_115 ；Bibb, Μ. J. et al. 1978. Nature 274 :398_400 ； Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933)。此外，采用电脉冲法 (特开平2-207791号公报)也能够进行微生物的转化。提高基因的拷贝数还可以通过向微生物的基因组DNA上导入多个拷贝的目的基 因来实现。为了将多个拷贝的目的基因导入到微生物的基因组DNA上，可以利用基因组 DNA上以多拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行(Millerl，J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, ColdSpring Harbor Laboratory) 作为基因组 DNA 上以多拷 贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitive DNA)、存在于转座元件端部的反向重复序
28列。或者，还可以如特开平2-109985号公报所公开的那样，将目的基因装载在转座子中，使 其发生转移，从而将多个基因拷贝导入基因组DNA中。另外，还可以通过使用Mu噬菌体的 方法(特开平2-109985号)将目的基因整合到宿主基因组上。目的基因转移到了基因组 上的事实，可以通过以该基因的一部分为探针进行Southren杂交来予以确认。而且，当提高基因拷贝数时，只要能够增强目的基因的产物的活性即可，对于拷贝 数没有特殊限制。在微生物本来就具有目的基因的情况下，优选为2个以上；此外，在微生 物本来不具有本发明的基因时，导入的基因的拷贝数可以是1个，也可以是2个以上。第2种方法是在基因组DNA上或质粒上、将目的基因的启动子等表达调节序列替 换为适当强度的表达调节序列来增强目的基因的表达的方法。例如，thr启动子、Iac启 动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子、tac启动子等是已知的常用启动子。作为棒状 杆菌型细菌中的高表达型启动子，可以列举延伸因子Tu(EF-Tu)基因tuf的启动子，编码 共伴侣蛋白(cochaperonin)GroES-伴侣蛋白(chaperonin)GroEL,硫氧还蛋白还原酶、 磷酸甘油酸变位酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等的基因的启动子(W02006/028063号公报、 EP1697525号公报)。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein和Doi 的论文(Goldstein,M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。此外，可以如国际公开W000/18935所描述的那样，通过在基因的启动子区域导 入数个碱基的碱基取代将其修饰成强度合适的启动子。表达调节序列的取代例如可以像 使用温度敏感型质粒的基因取代那样进行。作为可以在大肠杆菌或Pantoea ananatis中 使用的、具有温度敏感型复制起点的载体，可以列举例如WO 99/03988号国际公开小册子 所述的温度敏感型质粒PMAN997或其衍生质粒等。此外，表达调节序列的取代还可以通 过使用线性DNA的方法来进行，如利用λ噬菌体的Red重组酶(Red recombinase)的称 力 “Red 马区云力·☆，， (Red-driven integration)白勺力夕去(Datsenko, K. A. andffanner, B. L.， 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 6640-6645)、以及将 Red 驱动整合法与 λ 噬菌体来源 的切出系统(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)联合使用的方法(参照 W02005/010175号)等。而且，表达调节序列的修饰可以与如上所述的提高基因的拷贝数的 方法联合使用。而且，已知对核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列中，特别是对 起始密码子紧邻上游的序列中的数个核苷酸的取代，对mRNA的翻译效率有非常大的影响， 可以对所述序列进行修饰来提高翻译量。当丙酮酸合酶由多个亚基构成时，可以分别增强编码各亚基的基因的表达，也可 以以多顺反子的形式同时增强这些基因的表达。此外，当使用载体将基因导入微生物时，编 码各亚基的基因可以同时担载在单一载体分子上，也可以分别担载在不同载体分子上。此 外，当将基因插入基因组时，编码各亚基的基因可以同时插入到基因组上的同一位点，也可 以分别插入到不同位置上。此外，本发明的微生物优选除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性增 强之外，其苹果酸酶活性也已降低。当本发明的微生物是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌 属、克雷伯氏菌属或沙雷氏菌属的细菌时，特别优选降低苹果酸酶的活性。本发明中，苹果酸酶的活性是指可逆地催化苹果酸氧化脱碳酸生成丙酮酸的反应的活性。上述反应由以NADP为电子受体的NADP型苹果酸酶(也记作苹果酸脱氢酶 (malate dehydrogenase) ( ^-Wc^MM^'li. (oxaloacetate-decarboxylating)) (NADP+)) (EC :1. 1. 1. 40 b2463基因(也记作maeB基因)SEQ ID NO 54)、或者以NAD为电子受体的 NAD型苹果酸酶(也记作苹果酸脱氢酶(草酰乙酸脱羧性)(NAD+)) (EC :1· 1. 1. 38 sfcA基 因(也记作maeA基因)SEQ ID NO :52)这2种酶来催化。苹果酸酶活性的确认可以按照 Bologna 等的方法(Bologna, F. P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189 :5937_5946)来测 定。NADP依赖型苹果酸酶NADP+(NADP-依赖性苹果酸酶NADP+) +苹果酸 (malate) — NADPH+C02+ 丙酮酸(pyruvate)NAD依赖型苹果酸酶NAD+ (NAD-依赖性苹果酸酶NAD+) +苹果酸一NADH+C02+丙 酮酸酶活性的降低可以像后述的丙酮酸脱氢酶活性的降低那样进行。在本发明中，更优选使NADP型苹果酸酶与NAD型苹果酸酶这两者的活性均降低， 特别是，当本发明的微生物是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属或沙雷氏 菌属的细菌时，优选降低这两种类型的苹果酸酶的活性。此外，本发明的微生物优选除了增强丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活 性之外，还降低丙酮酸脱氢酶活性。在本发明中，丙酮酸脱氢酶(以下也称“PDH”)活性是指催化丙酮酸氧化脱 碳酸、生成乙酰-CoA(acetyl-CoA)的反应的活性。上述反应由PDH(Elp pyruvate dehydrogenase, EC :1· 2. 4. 1 aceE 基因 SEQ ID NO 46)、二氢硫辛酰基乙酰转移酶(E2p dihydrolipoyltransacetylase,EC 2. 3. 1. 12 aceF 基因 SEQ ID NO 48)、二氢硫辛酰胺脱 氢酶(E3 :dihydrolipoamide dehydrogenase ；EC :1· 8. 1. 4 IpdA 基因 SEQ ID NO 50)这 3 种酶来催化。即，这3种亚单位分别催化以下反应，而将催化这3个反应合起来的反应的 活性称为PDH活性。PDH活性的确认可以采用Visser和Strating的方法(Visser，J. and Strating, Μ. 1982. Methods Enzymo 1. 89 :391_399)来测定。Elp 丙酮酸+[ 二氢硫辛酰赖氨酸残基琥珀酰转移酶]硫辛酰赖氨酸一[二氢硫 辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶]S-乙酰二氢硫辛酰赖氨酸+CO2E2p =CoA+酶N6_ (S-乙酰二氢硫辛酰)赖氨酸一乙酰-CoA+酶N6- ( 二氢硫辛酰) 赖氨酸E3 蛋白N6- ( 二氢硫辛酰)赖氨酸+NAD+ —蛋白N6-(硫辛酰)赖氨酸+NADH+H+酶活性的降低具体地可以通过下述方法实现使染色体上的PDH编码基因，具体 地说是aceE、aceF和IpdA中的1个或2个以上基因的编码区域的一部分或全部缺损，或 者对启动子、shine-dalgarno (SD)序列等表达调节序列进行修饰，等等。此外，对表达调节 序列以外的非翻译区的修饰也可以降低基因的表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的 基因的前后的序列在内的整个基因。此外，所述修饰还可以这样完成通过基因重组向染 色体上的酶编码区域中导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、 或者导入添加或缺失一 二个核苷酸的移码突变(Wang，J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405_9410 ；Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594_602 ；Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272 :8611—8617 ；ffente, S. R. and Schachman, H. K. 1991.J. Biol. Chem. 266 :20833_20839)。在本发明中，优选通过利用同源重组，使染色体上的基因表达调节序列例如启动 子区域、或编码区域、或非编码区域的一部分或全部缺损，或者在所述区域中插入其它序 列，来降低细胞内的酶活性。然而，只要是降低PDH活性的修饰即可，也可以是通过X射线 或紫外线照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理引起的 修饰。就表达调节序列的修饰而言，优选为1个碱基以上，更优选为2个碱基以上，特别 优选为3个碱基以上。此外，在缺失编码区域时，只要产生的酶蛋白质的功能降低或缺失即 可，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编码 区域。通常，缺失的区域越长，越能够切实地使基因失活。此外，优选的是被缺失区域的上 游或下游的读码框不一致。在编码区域中插入其他序列时，可以为基因的任何区域，但插入的序列越长越能 够切实地使编码酶的基因失活。优选的是插入部位前后的序列的读码框不一致。对于其他 序列没有特殊限制，只要是能够降低或缺损酶蛋白质的功能即可，包括例如携带有抗生素 抗性基因或对L-氨基酸生产有用的基因的转座子等。对染色体上的基因如上述地进行修饰，可以通过下述方法实现例如，制备缺失型 基因(其经过了修饰使得基因的部分序列缺失、不产生正常功能的酶蛋白质)，用包含该基 因的DNA转化细菌，通过使缺失型基因与染色体上的基因发生同源重组，从而将染色体上 的基因替换成缺失型基因。缺失型基因所编码的酶蛋白质即使能够产生，其与野生型酶蛋 白质的立体结构也不同，其功能降低或消失。这种基于利用同源重组进行的基因取代的基 因破坏，还可以采用下述方法进行前述的Red驱动整合方法、组合使用Red驱动整合法与 λ噬菌体来源的切出系统的方法等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点 的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不含复制起点的自杀载体的方法(美国 专利第6303383号说明书，或特开平05-007491号)等。上述关于降低PDH活性的描述同样适用于前述的其它酶“活性的降低”、或其它基 因的“破坏”。此外，在厌氧或微需氧的条件下进行培养的场合，本发明的微生物还可以是经过 修饰，使得除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性被增强之外，不在厌氧或微 需氧的条件下产生有机酸或乙醇的微生物。这里，作为有机酸，可以列举出乳酸、甲酸、乙 酸。作为进行修饰使得不生产有机酸或乙醇的方法，包括例如破坏编码乳酸脱氢酶的基因 的方法(Verumi，G. N. et al. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28 :325_332 ；特 开 2005-95169)。此外，当在包含脂肪酸作为碳源的培养基中进行培养时，还可以提高本发明的微 生物的脂肪酸同化能力。提高脂肪酸同化能力的手段包括例如弱化或缺损fadR基因 的表达，增强涉及脂肪酸同化的fadL、fadE、fadD、fadB和/或fadA基因的表达，或增强 编码细胞色素bo型氧化酶复合体(cytochrome bo terminal oxidase complex)的各亚 基的基因群(Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D. Neidhardt (ed.)， Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Societyfor Microbiology Press, Washington, D. C；Chepuri et al. 1990.J. Biol. Chem. 265 11185-11192)即 cyoABCDE 的表达等。"fadR基因”是编码FadR的基因，所述FadR是在肠杆菌科细菌群中发现的调节脂 肪酸代谢并具有DNA结合能力的转录因子(DiRusso，C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7 :311_322)，大肠杆菌的 fadR 基因可以示例出具有位于大肠杆菌的基因组序列(Genbank登录号U00096)碱基序号 1234161 1234880的SEQ ID NO 82所示的碱基序列的基因。SEQ ID NO 83中示出了该 基因编码的氨基酸序列。<2>本发明的L-氨基酸生产方法本发明的方法是以用培养基培养本发明的微生物，在培养基中或菌体内生成并蓄 积L-氨基酸，并从该培养基或菌体收集L-氨基酸为特征的L-氨基酸生产方法。这里，本发明的方法可以采用分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养法(continuous culture)中的任何方法，培养基中的乙醇或脂肪酸可 以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中，或者包含于这两者中。这里，在本发明中，上述流加培养是指下述培养方法将培养基连续地或间歇地添 加至培养容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出培养基。此外，连续培养指下述培养 方法连续地或间歇地将培养基流加至培养容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言， 等于所流加的培养基的量)。“初始培养基”的意思是在流加培养或连续培养中，流加流加 培养基之前的分批培养中所用的培养基(培养开始时的培养基)；“流加培养基”的意思是 在进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。此外，分批培养(batchculture) 是指每批制备一次新的培养基，将菌株接种到其中，并且直至收获都不加入培养基。作为碳源，优选是能够产生乙酰CoA但不伴随发生脱碳酸反应的碳源，具体地可 以列举出乙醇、脂肪酸、或者、通过分解可产生脂肪酸的脂肪酸酯包括油脂等。以下，就使 用乙醇或脂肪酸作为所述碳源的情况进行示例说明。乙醇是以分子式C2H5OH表示的一元醇，可以利用纯乙醇，也可以直接利用含乙醇 的混合物，如乙醇发酵等中产生的培养液中的乙醇等。脂肪酸是以通式CmHnCOOH表示的一元羧酸。只要能够被具有L-氨基酸生产能力 的细菌利用即可，可以是任何链长的脂肪酸，也可以以任意比例含有任何链长的脂肪酸。优 选的脂肪酸是油酸(C17H33COOH)以及棕榈酸(C15H31COOH),特别优选油酸。关于油酸，可以 通过油脂的水解来获得包含油酸的长链脂肪酸混合物。用于本发明的油酸可以以棕榈油等 油脂的水解物的形式获得，可以使用从动物油、植物油、废食用油、其它混合油脂或巧克力 等包含脂肪成分的食品中提取的油酸。此外，脂肪酸可以以游离酸的形式利用，也可以以与 钠、钾等碱金属的盐或者铵盐的形式加以利用。本发明的方法中使用的培养基中所含的乙醇或脂肪酸的量可以是任意的，只要本 发明的方法中使用的细菌能够作为碳源加以同化即可，当作为单独的碳源添加到培养基中 时，优选包含20w/v %以下、优选1 Ow/v %以下、更优选2w/v %以下。此外，培养基中包含的 乙醇或脂肪酸可以是任意的，只要在其含量下能够作为碳源被同化即可，当作为单独的碳 源添加到培养基中时，希望包含0. 001w/v%以上、优选0. 05w/v%以上、更优选0.以 上。此外，在作为流加培养基使用的情况下，当作为单独的碳源添加乙醇或脂肪酸时，
32培养基中优选包含10w/v%以下、优选5w/v%以下、更优选以下，优选包含0. OOlw/ 以上、优选0. 05w/v%以上、更优选0.以上。而且，乙醇的浓度可以采用各种方法来测定，酶法测定是简便且常规的(Swift， R. 2003. Addiction 98:73-80)。脂肪酸的浓度可以采用气相色谱或HPLC等常规方法来 测定(Lehotay, S. J. and Hajslova, J. TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21 :686_697 ；Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808 :43_49)。而且，还可以将乙醇和脂肪酸混合后添加到本发明的培养基中。乙醇和脂肪酸的 添加浓度可以是任意的，只要本发明的方法中使用的细菌能够作为碳源同化所述脂肪酸即 可，当在培养基中仅添加乙醇和脂肪酸的混合物作为碳源时，优选合计包含20w/v%以下、 优选10w/v%以下、更优选2w/v%以下。此外，培养基中的乙醇和脂肪酸的混合物的含量可 以是任意的，只要在其含量下本发明中使用的细菌能够作为碳源加以同化即可。当培养基 中仅添加乙醇和脂肪酸的混合作为碳源时，优选与油酸合在一起包含0. 001w/v%以上、优 选0. 05w/v%以上、更优选0.以上。此外，乙醇与脂肪酸的混合比例可以是任意的，只要为本发明的方法中使用的细 菌能够作为碳源同化的浓度即可，可以以相对于乙醇1脂肪酸为2以下、优选1. 5以下、特 别优选1以下左右的比例来进行混合。作为下限，只要混合了脂肪酸即可，优选相对于乙醇 1，混合0. 05以上、优选0. 1以上的脂肪酸。而且，本发明的方法中使用的培养基中除了乙醇或脂肪酸或乙醇和脂肪酸这两者 之外，还可以添加其它碳源。优选的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解 物等糖类，甘油等多元醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。特别优选葡萄糖、蔗糖、果 糖、甘油。作为甘油，也可以使用在生物柴油燃料生产中产生的粗甘油。碳源可以是1种， 也可以是2种以上的混合物。在使用其它碳源的情况下，碳源中的乙醇或脂肪酸、或乙醇和 脂肪酸的混合物的比例优选为10重量％以上、优选30重量％以上、更优选50重量％以上。而且，在本发明中，可以在培养的所有步骤中均包含一定浓度的乙醇或者脂肪酸， 也可以仅在流加培养基或初始培养基中添加有乙醇或者脂肪酸，如果其它碳源充足，则也 可以存在乙醇或脂肪酸不足的一定时间。所谓“暂时性的”，意思是，例如，在发酵总时间的 10%、20%、最大至30%的时间内脂肪酸处于不足的状态。就培养基中添加的其它成分而言，可以使用除碳源外还含有氮源、无机离子和视 需要而定的其它有机成分的常规培养基。本发明的培养基中包含的氮源可以使用氨、硫酸 铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，PH调整中使用的氨气、氨水也 可作为氮源利用。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大 豆水解物等。培养基中也以只含这些氮源中的1种，也可以含有这些氮源中的2种以上。这 些氮源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。此外，初始培养基、流加培养基中可 以使用相同的氮源，也可以将流加培养基的氮源改变为与初始培养基不同。本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源、硫源。作为磷酸源， 可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作为硫源，只要包含硫原 子即可，优选硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等硫酸盐，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫 氨基酸，这其中优选硫酸铵。此外，培养基除碳源、氮源、硫源之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括微量金属、氨基酸、维生素、核酸以及含有所 述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。作为微量金属，可以列 举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以列举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维 生素B12等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含在流加培养基中。此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选在培养基中添补 所需求的营养素。特别是，可在本发明中使用的L-赖氨酸生产菌中大多如后述地强化了 L-赖氨酸生物合成途径，而弱化了 L-赖氨酸分解能力，因此，优选添加选自L-苏氨酸、 L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1种或2种以上。初始培养基和流加培养基的 培养基组成可以相同，也可以不同。此外，初始培养基与流加培养基的培养基组成可以相 同，也可以不同。而且，当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以 相同，也可以不同。培养优选在发酵温度20至45°C，特别优选33至42°C的通气条件下进行。这里， 将氧浓度调节到5至50%，优选至大约10%来进行发酵。此外，优选将pH控制在5至9进 行通气培养。如果在培养期间PH降低，可例如添加碳酸钙或碱例如氨气和氨水以中和培 养物。在这些条件下，进行优选大约10至120小时的培养，从而在培养液中蓄积显著量的 L-氨基酸。蓄积的L-氨基酸的浓度只要是高于野生型菌株中的浓度并且在该浓度下能够 将L-氨基酸从培养基收集和回收即可，可以是50g/L以上，理想的是75g/L以上，更理想的 是100g/L以上。当目的氨基酸为碱性氨基酸时，可以采用通过下述方法进行发酵、并回收目的碱 性氨基酸的方法来进行生产(参照特开2002-065287号)将培养中的pH控制在6. 5 9. 0、培养结束时的培养基的pH控制在7. 2 9. 0、发酵中的发酵槽内压力控制为正的方法， 或者，向培养基供给二氧化碳或含二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离 子和/或碳酸根离子为至少2g/L以上的培养期，并以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子 作为以碱性氨基酸为主的阳离子的抗衡离子的方法。就培养结束后从培养液中收集L-氨基酸的方法而言，可以按照公知的回收方法 来进行。例如，在采用离子交换树脂法、沉淀法，或通过离心分离等从培养液中除去菌体后， 进行浓缩晶析来进行收集。在本发明中，为了确保高于一定水平的L-氨基酸蓄积，微生物的培养可以分为种 子培养(seed culture)和主培养(main culture)来进行，种子培养可通过使用培养瓶等 的摇动培养或通过分批培养来进行，而主培养可以以流加培养或连续培养的形式进行。或 者，种子培养和主培养均可以以分批培养的方式进行。在本发明中，当进行流加培养或连续培养时，可以以间歇的方式流加流加培养基， 使乙醇或脂肪酸或其它碳源的流加发生暂时的停止。优选的是，停止流加培养基供给的时 间为流加进行时间的至多30%，理想的是至多20%，特别理想的是至多10%。当间歇流加 流加培养液时，可添加一定时间的流加培养基，并如下控制第二次及以后的添加在某个添 加期前面的添加停止期中发酵培养基内碳源耗尽时PH的上升和溶氧浓度的上升通过计算 机被检测到时，即开始添加；从而培养罐(culture tank)中的基质浓度总是自动保持在低 水平(美国专利5，912，113号说明书)。流加培养中使用的流加培养基，优选采用含乙醇或脂肪酸和其它碳源、以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基，并且可以进行控制，使得发酵培养基中 的脂肪酸浓度在一定浓度以下。这里，所谓一定浓度以下，是指制备添加10w/v%以下、优选 5w/v%以下、更优选以下的培养基。作为其它碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油；作为生长促进因子，优选氮源、磷 酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐 或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营 养缺陷型突变株的场合，优选添补所需求的营养素。此外，流加培养基可以是1种，也可以 混合2种以上的培养基。在使用2种以上的流加培养基时，这些培养基可以混合起来通过 1个补料罐流加，也可以用多个补料罐流加。在将连续培养方法用于本发明时，可以同时进行取出和流加；也可以取出一部分 后再进行流加。此外，所述方法也可以是将包含L-氨基酸和细胞的培养液取出，然后仅将 细胞再循环回发酵罐，对菌体进行再利用的连续培养方法(参照法国专利号2669935说明 书)。作为连续或间歇流加营养源的方法，可以使用与流加培养中所用的相同方法。再利用菌体的连续培养方法是如下所述的方法在氨基酸浓度达到预定水平时， 将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出L-氨基酸，并且将包含菌体的过滤残余物再循环 到发酵罐中，这种方法可通过参考例如法国专利号2669935说明书来实施。其中，将培养液间歇取出时，可以在L-氨基酸浓度达到预定浓度时取出部分L-氨 基酸，并且新流加培养基来继续培养。此外，至于添加的培养基的量，优选进行设定使其最 终与取出之前的培养液的量为等量。这里，“等量”的意思是取出之前培养液量的大约93 107%的量。在将培养液连续取出时，优选在流加营养培养基的同时或之后开始取出。例如，开 始取出的时间是添加开始之后的5小时之内，优选3小时之内，更优选1小时之内。此外， 至于培养液的取出量，优选取出的量和流加的量为等量。
实施例以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受其限制。〔实施例1〕<大肠杆菌来源的醇脱氢酶(AdhE)突变株的构建>为了使大肠杆菌能够以需氧方式同化乙醇，获取了醇脱氢酶AdhE突变体。大肠杆 菌来源的野生型AdhE基因(adhe)的碱基序列及其编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 21 禾口 SEQ ID NO :22。<1-1> 大肠杆菌 MG1655: :PL_tacadhE 株的构建通过 Datsenko 禾口 Wanner 开发的称为"Red—driven integration，，的方法 (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640_6645)禾口 λ 噬菌体来源的切出系统(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)将大肠杆菌 adhE基因的启动子区域替换成Pptac;。通过本方法，使用以5'侧设计有目的基因的一部分、3'侧设计有抗生素抗性基 因的一部分的合成寡核苷酸作为引物而得到的PCR产物，可以一步式地构建基因重组株。 进而，结合使用λ噬菌体来源的切出系统，可以将整合到基因重组株中的抗生素抗性基因 除去。
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包含I\_ta。和编码氯霉素抗性(CmK)基因的cat基因的片段，以国际专利申请 W02006/043730记载的大肠杆菌MG1655PL_ta。xylE株的基因组为模板，使用SEQ ID NO :23和 SEQ ID NO :24所示的引物，通过PCR法来进行扩增。SEQ ID NO :23的引物包含adhE基因 的上游区域的互补序列，SEQID NO 24的引物包含adhE基因的5'区域的互补序列。PL_tac 的序列如 SEQ ID NO 25 所示。PCR 中使用了 Gene Amp PCRSystem 2700 扩 增仪(Applied Biosystems)和Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)。所得扩增片段采用琼 脂糖凝胶电泳来进行纯化、回收。通过电穿孔将片段导入携带具有温度敏感型的复制能力 的质粒 PKD46 的大肠杆菌 MG1655/pKD46 株中。质粒 pKD46 (Datsenko，K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)中包含 λ 噬菌体的总计 2154 个碱基 的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459，第31088位 33241位)，该片段中包含阿拉伯 糖诱导性ParaB启动子控制下的编码λ Red同源重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo 基因)。质粒PKD46对于将PCR产物整合至MG1655株的染色体上而言是必要的。对于扩增得到的PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，通过电穿孔将其导入 到包含具有温度敏感型的复制能力的质粒PKD46的大肠杆菌MG1655株中。电穿孔用感受态 细胞按下述制备。具体地，将在含100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵 母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中30°C培养过夜的MG1655/pKD46株用含氨苄青霉素(lOOmg/ L)和L-阿拉伯糖(IOmM)的5mL的LB培养基稀释100倍。对于所得稀释物，于30°C在通气 条件下使其生长至0D600为约0. 6后，100倍浓缩，用10%甘油洗涤3次，从而使其能够用于 电穿孔。电穿孔使用70 μ L的感受态细胞与约IOOng的PCR产物来进行。在电穿孔后的杯 子中力口入 ImL 的 SOC 培养基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),于 37°C培养 1小时后，于37°C在含Cm(氯霉素)(40mg/L)的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取 物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)上进行平板培养，选择出Cm抗性重组体。将Cm抗性株接种到含2 %乙醇的M9平板培养基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上，从37°C、培养2-3日所生长出的菌株中选取约100个克 隆，再于含2%乙醇的M9平板培养基上37°C进行培养，选择36小时以内生长出的菌株。为 了考察所述菌株的CmK基因与启动子区域的序列，使用SEQ ID NO 26和SEQ ID NO :27所 示的引物通过PCR法进行了扩增。对于经确认adhE基因的启动子区域中包含0^基因的一 个克隆，于37°C进行培养来除去温度敏感型质粒pKD46，从而得到了 MG1655: :PL_tacadhE株。<1-2>大肠杆菌MG1655 Δ adhE株的构建对于大肠杆菌MG1655 (ATCC 700926)野生型的adhE基因，采用Datsenko和 Wanner开发的方法将其替换成非活性型adhE基因。以质粒pACYC177 (GenBank/EMBL accession number X06402、Fermentas 公司)为模板，使用 SEQ ID N0:28 禾口 SEQ ID NO 29 所示的引物，通过PCR法扩增了包含编码卡那霉素抗性(KanK)基因的kan基因的片段。SEQ ID NO :28的引物包含与adhE基因318bp上游的区域的40个碱基互补的序列，SEQ IDNO 29 的引物包含与adhE基因3'侧区域的41个碱基互补的序列。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700 扩增仪(Applied Biosystems)禾口 Taq DNA 聚合酶(Fermentas 公司)。将所 得扩增片段用琼脂糖凝胶电泳进行纯化、回收。对于该片段，通过电穿孔将其导入携带质粒
36pKD46的大肠杆菌MG1655/pKD46株。为了确认在含20 μ g/ml卡那霉素的LB平板培养基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上生长出的克隆中存在KmK基因，使用SEQ ID N0:30和SEQ ID NO :31所示的引物，采用PCR法进行了扩增。对于一个已确认在adhE基因区域中包含KmK 基因的克隆，通过在37°C进行培养，除去温度敏感型质粒pKD46，从而得到了 MG1655AadhE 株。<1-3>突变型醇脱氢酶(AdhE*)的构建为了将Glu568Lys (E568K)突变导入AdhE，使用与adhE基因的碱基序列 1662-1701和1703-1730互补、且第1702位的碱基引入g — a突变的SEQID NO 32所示的 引物、以及与adhE基因碱基序列的3’末端侧区域同源的SEQ ID NO :33所示的引物，以大 肠杆菌MG1655株基因组为模板，进行了 PCR。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700扩 增仪(AppliedBiosystems)和Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造)。对于所得的1. 05kbp的扩 增片段，用琼脂糖凝胶电泳进行了纯化、回收。以大肠杆菌MG1655: :PL_tacadhE株基因组为模板，使用SEQ ID NO 34所示的引物 以及导入了突变的1. 05kbp片段作为引物，进行了 PCR。SEQ IDNO 34的引物是位于adhE 基因起始密码子上游402-425bp的引物。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700扩增 仪(Applied Biosystems)和TaKaRaLA DNA聚合酶(宝酒造)。对于所得4. 7kbp的扩增片 段，用琼脂糖凝胶电泳进行了纯化、回收。为了使野生型adhE基因区域与突变型adhE基因重组，对于包含CmK基因和Pptac 下游的突变型adhE基因的4. 7kbp片段(cat_PL_ta。adhE*)，采用Datsenko和Wanner的方法， 通过电穿孔将其导入MG1655 Δ adhE/pKD46株。对于所得克隆，在包含2%乙醇作为唯一碳 源的M9平板培养基上进行选择。测定了生长出的克隆的adhE基因的序列，结果鉴定出下述 引起氨基酸取代的突变Glu568Lys(gag_aag)、Ile554Ser(atc_agc)、Glu22Gly (gaa-gga)、 Met236Val (atg-gtg)、Tyr461Cys (tac-tgc)以及 Ala786Val (gca-gta)，将该克隆命名为 MG1655: :PL_ta。adhE* 株。以大肠杆菌MG1655:: PL_tacadhE*株作为供体，使P 噬菌体感染MG1655 Δ tdh rhtA* ^ 白勺 Pl ^ (Miller, J. H. (1972)Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview，NY)，得到了具有乙醇同化性的L-苏氨酸生产株 MG1655 Δ tdh rhtA*PL_tacadhE* 株。MG1655 Δ tdhrhtA* 株是这样得到的 L-苏氨酸生产株 从MG1655株出发，采用Datsenko和Warmer的方法破坏编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，并 在rhtA基因中通过Pl转导导入了来自于在极限培养基中对高浓度苏氨酸具有抗性的菌株 VL614rhtA23 (Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154 :123-135)的 rhtA23 突变。<l-4>大肠杆菌WC196 Amez株来源的醇脱氢酶(AdhE)突变株的构建为了对L-赖氨酸生产菌赋予乙醇同化性，以MG1655 Δ tdh rhtA*PL_ta。adhE*株作 为供体，对国际专利公报W02005/010175所述的L-赖氨酸生产菌WC196 Δ mez/pCABD2株进 行了 Pl转导，得到了具有乙醇同化性的L-赖氨酸生产株WC196Amez PL_tacadhE*/pCABD2 株。WC196 Amez株是编码苹果酸酶(malic enzyme)的sfcA以及b2463基因被破坏的WC196 株(W02005/010175)。pCABD2是携带美国专利No. 6，040, 160所述的对L-赖氨酸反馈抑制呈抗性的dapA*基因、对L-赖氨酸反馈抑制呈抗性的IysC*基因、dapB基因以及ddh基因 的质粒。〔实施例2〕<绿硫菌来源的丙酮酸合酶基因表达质粒的构建与活性测定><2-1>绿硫菌来源丙酮酸合酶基因表达质粒的构建绿硫菌是最适生长温度为48°C的中高温型自养细菌，绿硫菌TLS株的基因组序列 已由 Eisen 等阐明(Eisen,J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :9509_9514)。从 该菌株中分离出丙酮酸合酶基因，构建了表达质粒。<2-2>绿硫菌来源丙酮酸合酶基因表达株的丙酮酸合酶活性的测定以绿硫菌TLS株(ATCC49652)的染色体为模板，使用SEQ ID N0:35、36所示 的寡核苷酸进行PCR，扩增了丙酮酸合酶基因片段。将所得基因片段用SacI切割，插入 PSTV28 (TakaraBio公司制造)的SacI位点，构建了质粒，将其命名为pSTV-PS。在使用 BigDye Terminators vl. 1 Cycle SequencingKit 确认了丙酮酸合酶基因全长中没有 PCR 错误后，用SacI从pSTV-PS中切出将丙酮酸合酶基因，插入到pMW_Pthr的SacI位点，构建 了丙酮酸合酶基因表达用质粒pMW-Pthr-PS。pMW-Pthr是在载体pMW219 (NipponGene公司 制造)的HindIII位点与XbaI位点之间具有大肠杆菌K-12株的苏氨酸操纵子(thrABC) 的启动子区域(Pthr)的质粒，可通过在该启动子的下游克隆基因来进行基因表达。所使用 的苏氨酸操纵子的启动子序列如SEQ IDNO 37所示。通过电穿孔在WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2中分别导入pMW_Pthr_PS以及比较对 照用载体pMW-Pthr，以卡那霉素抗性为指标获得了转化体，确认了质粒的导入。将绿硫菌来 源的丙酮酸合酶基因表达株命名为WC196 Δ cadA Δ 1 dcC/pCABD2/pMW-Pthr-PS,将对照株命 名为 WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW_Pthr。将上述菌株接种于含20mg/L链霉素和40mg/L卡那霉素的LB培养基，37°C振荡培 养过夜。通过离心分离回收菌体，悬浮于50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中。将悬浮液用超 声波破碎机破碎，15000rpm离心15分钟后，以所得上清作为粗酶液。使用Protein Assay CBB溶液(Nakalai Tesque公司制造)测定粗酶液中的蛋白 质浓度，将相当于250μ g总蛋白质的粗酶液用于活性测定。活性测定如下进行。在下述反应溶液2mL中加入粗酶液进行反应。首先，将包含 除底物丙酮酸以外的所有成分的反应溶液加入光谱测定用比色皿中，用橡胶塞和铝盖将比 色皿密闭起来。使用注射器向比色池中吹入氩气5分钟，降低比色池内的氧浓度。然后，将 比色皿置于分光光度计(日立公司制造U-3210 Spectrophotometer)上，使用注射器添加 丙酮酸溶液开始反应。37°C反应30分钟，其中通过经时测定578nm的吸光度来观察还原型 甲基紫精(methylviologen)的量的变化。结果如表1所示。表中，比活性的单位为U/mg 蛋白。IU定义为每1分钟还原Inmol甲基紫精的活性。〔反应液〕MgCl2ImM二硫苏糖醇ImM甲基紫精5mMCoA0. 25mM丙酮酸IOmM(测定即将开始添加)
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HEPES (ρΗ8· 0)50mM表1表 权利要求
一种微生物，其具有生产选自L 赖氨酸、L 苏氨酸、L 色氨酸、L 苯丙氨酸、L 缬氨酸、L 亮氨酸、L 异亮氨酸和L 丝氨酸中的L 氨基酸的能力，且经过修饰而增强了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化还原酶的活性。
2.权利要求1所述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸合酶的活性。
3.权利要求1所述的微生物，其经过修饰而增强了丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性。
4.权利要求1 3中任一项所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化还 原酶的活性是通过增加编码丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因的表达量和/ 或增加所述基因的翻译量而增强的。
5.权利要求4所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性是 通过提高编码丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因的拷贝数或修饰所述基因的 表达调节序列而增强的。
6.权利要求4或5所述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因编码下述(A) (D)中任一项所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、 (I)和(J)的多肽(A)包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 2中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列的多肽；(D)包含在SEQID NO 4中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复 合体的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复 合体的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复 合体的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的氨基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的氨基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基 酸序列，并且能够与至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 质复合体的多肽。
7.权利要求4或5所述的微生物，其中，所述编码丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任一项的DNA,或下述(e)、(f)、(g)和(h)的DNA,或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和 (j)的 DNA (a)具有SEQID NO 1所示的碱基序列的DNA ；(b)与SEQID NO :1所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在 严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQID NO 3所示的碱基序列的DNA ；(d)与SEQID NO :3所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在 严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的碱基序列的DNA ；(e2)与SEQ ID NO :56所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA —起编码具有丙酮酸合 酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(f)下述(fl)或(f2)的DNA (Π)具有SEQ ID NO 58所示的碱基序列的DNA ；(f2)与SEQ ID NO :58所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA —起编码具有丙酮酸合 酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的碱基序列的DNA、(g2)与SEQ ID NO :60所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA —起编码具有丙酮酸合 酶活性的蛋白质复合体的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的碱基序列的DNA、(h2)与SEQ ID NO :62所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA —起编码具有丙酮酸合酶活性的蛋白质复合体的DNA ； ⑴下述(il)或( 2)的DNA: (hi)具有SEQ ID NO 64所示的碱基序列的DNA ；(h2)与SEQ ID NO :64所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起编码具有丙酮酸 合酶活性的蛋白质复合体的DNA ； (j)下述(jl)或(j2)的 DNA: (jl)具有SEQ ID NO 66所示的碱基序列的DNA ；(j2)与SEQ ID NO :66所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针 在严格条件下杂交，并且能够与至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起编码具有丙酮酸 合酶活性的蛋白质复合体的DNA。
8.权利要求4或5所述的微生物，其中，编码丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因编码下 述㈧或⑶所示的多肽(A)包含SEQID NO 6所示的氨基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 6中取代、缺失、插入或添加1个或数个氨基酸而得到的氨基酸 序列，并且具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的多肽。
9.权利要求4或5所述的微生物，其中，编码丙酮酸NADP+氧化还原酶的基因包含下 述(a)或(b)的 DNA (a)具有SEQID NO 5所示的碱基序列的DNA ；(b)与SEQID NO :5所示的碱基序列的互补序列或与能够由该碱基序列制备的探针在 严格条件下杂交，并且编码具有丙酮酸NADP+氧化还原酶活性的多肽的DNA。
10.权利要求1或权利要求2 7中任一项所述的微生物，其经过修饰而增强了铁氧还 蛋白-NADP+还原酶的活性。
11.权利要求1、权利要求2 7或权利要求10中任一项所述的微生物，其经过修饰而 提高了产生铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白的能力。
12.权利要求1 11中任一项所述的微生物，其经过修饰而降低了苹果酸酶的活性。
13.权利要求1 12中任一项所述的微生物，其经过修饰而降低了丙酮酸脱氢酶活性。
14.权利要求1 13中任一项所述的微生物，其经过修饰从而能够以需氧方式同化乙醇。
15.权利要求1 14中任一项所述的微生物，其中，所述微生物是属于选自埃希氏菌 属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属中的属的细菌。
16.权利要求15所述的微生物，其中，该微生物的NAD型苹果酸酶和NADP型苹果酸酶 二者的活性均已降低。
17.权利要求1 14中任一项所述的微生物，其中，所述微生物为棒状杆菌型细菌。
18.—种生产L-氨基酸的方法，其中，在培养基中培养权利要求1 17中任一项所述 的微生物，使该培养基中或菌体内生成并蓄积选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯 丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸，并从该培养基或菌 体收集L-氨基酸。
19.权利要求18所述的方法，其中，所述培养基的特征在于含有乙醇或脂肪酸作为碳源。
全文摘要
在培养基，例如包含乙醇或脂肪酸作为碳源的培养基中培养具有选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸中的L-氨基酸的生产能力、且经过修饰而增加了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化还原酶的活性的微生物，使该培养基中或菌体内生成并蓄积所述L-氨基酸，并从该培养基或菌体采集L-氨基酸。
文档编号C12P13/06GK101939412SQ200880105639
公开日2011年1月5日 申请日期2008年9月3日 优先权日2007年9月4日
发明者伊里纳·B·奥尔特曼, 劳尼德·R·普蒂辛, 塔蒂亚纳·A·亚姆波尔斯卡亚, 寺下优, 松井和彦, 纳塔利亚·S·厄米纳, 纳塔利亚·V·斯托诺瓦, 臼田佳弘 申请人:味之素株式会社