能够由蔗糖生产聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的重组微生物和使用该微生物由蔗糖生产聚...的制作方法

专利名称：：能够由蔗糖生产聚乳酸酯或聚乳酸酯共聚物的重组微生物和使用该微生物由蔗糖生产聚...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能够由蔗糖生产聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重组微生物和使用该微生物由蔗糖生产PLA或PLA共聚物的方法。
背景技术：
：聚乳酸酯(PLA)是一种来源于乳酸酯的典型可生物降解的聚合物，其高度应用于商业和生物医药学。虽然目前通过发酵微生物产生的乳酸酯的聚合来制备PLA，但是通过乳酸酯的直接聚合仅仅获得了大约1000到5000道尔顿的低分子量PLA。为了合成分子量为100，000道尔顿或更高的PLA，可以使用链偶联剂将通过乳酸酯的直接聚合获得的低分子量PLA聚合。但是，在这种方法中，由于添加有机溶剂或链偶联剂，而且其不容易被去除，而使整个过程变得复杂。目前商业上可用的制备高分子量PLA的方法包括将乳酸酯转变成丙交酯，和利用丙交酯环的开环缩聚作用合成PLA。当通过乳酸酯的化学合成来合成PLA时，很容易获得PLA均聚物，但是由各种单体组成的PLA共聚物难以合成而且是商业上不可用的。同时，当存在过量的碳源和缺乏其他的养分(如磷⑵、氮(N)、镁(Mg)和氧(0)、等等)时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是微生物储存作为能量或碳源的聚酯。由于PHA具有与来自石油的常规合成聚合物类似的物理性能，并显示完全的生物可降解性，它正被公认为常规合成塑料的替代品。为了使用微生物生产PHA，需要将微生物的代谢产物转变成PHA单体的酶和使用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。当利用微生物合成PLA和PLA共聚物时，需要相同的系统，而且除了提供羟酰辅酶A的酶外，其是PHA合酶的最初底物，还需要提供乳酰辅酶A的酶。而且，为了经济地生产可生物降解的聚合物，采用低成本的底物是非常重要的。特别是，需要开发一种使用蔗糖作为低成本底物来生产PLA或PLA共聚物的技术。
发明内容技术问题本发明旨在一种能够使用蔗糖作为底物生产聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的微生物和使用该微生物生产PLA或PLA共聚物的方法。技术方案本发明的一个方面提供了一种由蔗糖生产聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法。该方法包括在含有乳酸酯和蔗糖的环境中或者在含有乳酸酯、蔗糖和羟基链烷酸酯的环境中，培养细胞或植物或者使细胞或植物生长。该细胞或植物含有将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因，而且能够使用蔗糖作为底物生产PLA或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。然后，从细胞或植物中回收PLA或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。如韩国专利申请第10-2006-0116234号中所公开的，本发明人利用来自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的用于提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶，和使用乳酰辅酶A作为底物的来自假单胞菌属(Pseudomonas)sp.6-19的PHA合酶的突变体，成功合成了PLA和PLA共聚物。而且，本发明人试图利用低成本的底物蔗糖来生产PLA和PLA共聚物，从而经济地生产可生物降解的聚合物。因此，本发明人用表达来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶和来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的质粒，转化利用蔗糖作为低成本底物的大肠杆菌，并发现，使用转化的重组大肠杆菌能有效地由蔗糖生产PLA和PLA共聚物。这使他们完成了本发明。可通过用(a)将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因与(b)使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因的至少之一转化不含有(a)与(b)的至少之一的细胞或植物，来获得能够生产PLA或PLA共聚物(羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物)的细胞或植物。也就是说，可通过用(a)与(b)的至少之一转化不具有(a)与(b)的细胞或植物，或通过用(a)转化不具有(a)但是具有(b)的细胞或植物，来获得能够生产PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的细胞或植物，但是本发明不局限于此。例如，根据本发明，当细胞具有(a)与(b)之一时，可通过增强包含的(a)与(b)之一，和用缺乏的(a)与(b)之一转化细胞，来获得能够生产PLA或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的细胞。本发明中，所述羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的羟基链烷酸酯可以是选自3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、具有6到14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸_甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸_甲酯、3-羟基辛二酸_乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酸基辛酸、3-羟基-9-乙酸基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式_十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种，但是本发明不限于此。本发明中，所述将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因可以是丙酰辅酶A转移酶(pet)基因。更具体地说，将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因可以是来自丙酸梭菌的pet基因。在本发明的具体实施例中，将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因可具有选自以下的一种=SEQIDNO:1的碱基序列(CpPCT)；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C获得的碱基序列(CpPCT522)；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的A1200G获得的碱基序列(CpPCT512)；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDN0:2的氨基酸序列中的Gly335Asp获得的碱基序列(CpPCT531)；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的T669C、A1125G禾口T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Gly获得的碱基序列(CpPCT533)；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Asp65Asn获得的碱基序列(CpPCT535)；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Thrl99Ile获得的碱基序列(CpPCT537)；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Ala243Thr获得的碱基序列(CpPCT532)；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Asp257Asn获得的碱基序列(CpPCT534)；和通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T78C、T669C、A1125G禾口T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Vall93Ala获得的碱基序列(CpPCT540)。特别地，CpPCT532基因可以是来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变基因，其优选用于使用蔗糖生产PLA或PLA共聚物。根据本发明的细胞或植物可包含使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因，其是来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的基因。使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因可以是具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的基因，或者具有对应于突变的氨基酸序列的碱基序列的基因，其中SEQIDNO4的氨基酸序列中选自E130D、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R中的至少一个发生突变。特别地，phaClPs6_19400基因可以是来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的基因，其优选用于使用蔗糖生产PLA或PLA共聚物。而且，根据本发明的细胞或植物另外可包含用于由蔗糖生产羟酰辅酶A的酶的基因。由于另外包括由蔗糖生产羟酰辅酶A的酶的基因的重组细胞或植物，本身能生产羟酰辅酶A，即使培养基中不包括羟基链烷酸酯，也可以高产量生产羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物。在本发明的具体实施例中，用于由蔗糖生产羟酰辅酶A的酶可以是酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶，但是本发明不限于此。酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶可来源于富氧罗尔其j通氏菌(Ralstoniaeutropha)。在本发明的具体实施例中，能够生产PLA或羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的细胞可以是细菌，尤其是大肠杆菌。本发明提供了一种用用于生产PLA或PLA共聚物的重组载体转化并使用蔗糖作为底物的细胞或植物，该重组载体含有将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因。所述细胞或植物另外可包含用于由蔗糖生产3-羟基丁基-辅酶A的酶的基因。载体指包含与能在合适的宿主中表达DNA的适合调控序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体。在本发明中，载体可以是质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体或酵母人工染色体(YAC)载体。为了本发明的目的，可以使用质粒载体。用于本发明目的的典型质粒载体包含(a)允许有效复制以便每个宿主细胞包含几百个质粒载体的复制起点，(b)允许筛选导入了质粒载体的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中可插入外源DNA片段的限制性内切酶切割位点。即使没有合适的限制性内切酶切割位点，可以通过普通方法使用合成的寡核苷酸连接体或接头，很容易地连接载体与外源DNA。连接过程以后，载体必须被转化到合适的宿主细胞中。本发明中，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。原核细胞可以是具有上述3个基因之一的微生物，或者不具有上述3个基因的微生物，例如，大肠杆菌。大肠杆菌可包括大肠杆菌DH5a菌株、大肠杆菌JMlOl菌株、大肠杆菌K12菌株、大肠杆菌W3110菌株、大肠杆菌X1776菌株、大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene)、大肠杆菌B，等等。但是，大肠杆菌菌株，如FMBlOl、匪522、匪538和匪539，以及其他的原核生物种和属也可以使用。除了具有PHA合酶的基因的上述大肠杆菌和微生物以外，土壤杆菌菌株(如土壤杆菌A4)、杆菌(如枯草杆菌)及其他肠细菌(如鼠伤寒沙门氏杆菌或粘质沙雷氏杆菌)，可用作宿主细胞。已知的真核宿主细胞(如酵母和霉菌)、昆虫细胞(如感染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(SF9))、动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠细胞)以及组织培养的人和植物细胞可用作宿主细胞。当载体被转化到合适的宿主中时，载体能复制或发挥功能，而不管宿主基因组，或者有时载体与基因组本身整合。如本领域技术人员已知的，为了提高转化的基因在宿主细胞中的表达水平，转化的基因必须与表达调控序列可操作连接，该表达调控序列在选择的表达宿主中执行转录和喘译功能。优选地，表达调控序列和转化的基因包含在一个表达载体中，该表达载体同时含有细菌选择标记和复制起点。当表达宿主是真核细胞时，表达载体必须另外包含可用于真核表达宿主的表达标记。术语“表达调控序列”指可操作连接的编码序列在特定的宿主中表达不可缺少的DNA序列。调控序列包括转录所需的启动子、用于调控转录的任意的操纵子序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点(RBS)的序列和用于调控转录和翻译终止的序列。例如，适于原核生物的调控序列包含启动子、任意的操纵子序列和RBS。适于真核细胞的调控序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。影响质粒中的基因的表达量的最重要的因子是启动子。SRa启动子或巨细胞病毒启动子可用作高表达启动子。为了表达本发明的DNA序列，任何一种表达调控序列可用于载体。表达调控序列可以是，例如，SV40或腺病毒的早期和后期启动子、Iac系统、trp系统、tac系统、trc系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd编码蛋白的调控区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖解酶的启动子、磷酸酶的启动子(例如，启动子如Pho5)、酵母α-交配体系的启动子、具有原核或真核细胞或它们的病毒的调控表达已知的结构或衍生物的其他序列，及其各种组合。当将一个核酸置入与另一个核酸序列处于功能关系时，该核酸与该核酸序列可操作连接。合适的分子(例如，转录激活蛋白)可以是基因和调控序列，其以这样的方式连接以便当它与调控序列连接时能使基因表达。例如，当它表达为参与多肽分泌的前蛋白时，前序列或分泌性前导区的DNA与多肽的DNA可操作连接；当启动子或增强子影响编码序列的转录时，启动子或增强子与编码序列可操作连接；当RBS影响编码序列的转录时，RBS与编码序列可操作连接；或当RBS倾向于促进翻译时，RBS与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接的序列”指被连接的DNA序列是连续的，而且在分泌性前导区的情况中是连续的且在阅读框中。但是，增强子不必接触编码序列。可通过在适当的限制性内切酶位点中连接来进行序列之间的连接。然而，当没有限制性内切酶位点时，根据普通方法可使用合成的寡核苷酸连接体和接头。当然，应当理解，不是所有的载体和表达调控序列在表达本发明的DNA序列中发挥同等的功能。类似地，相对于相同的表达系统，不是所有的宿主都发挥同等的功能。但是，本领域技术人员可以在各种载体、表达调控序列和宿主中进行合适的选择，而不背离本发明的范围或者承担过量的实验负担。例如，选择载体必须考虑宿主，因为载体必须在宿主中被复制。特别地，还必须考虑载体和由相应的载体编码的其他蛋白(例如，抗生素标记)表达的拷贝数和拷贝数调控。本领域技术人员可以从上述变量的合适范围内的各种载体、表达调控序列和宿主中选择适合的组合。而且，使用上文Sambrook等人的1.82部分描述的氯化钙法，可以很容易地完成真核细胞的转化。或者，电穿孔可用于这些细胞的转化(Neumann等人，EMBOJ.，1841(1982))。同时，利用土壤杆菌、病毒载体等等，通过普通方法可以进行植物的转化。例如，用包含根据本发明的基因的重组载体转化微生物，转化的土壤杆菌微生物可以感染靶植物的组织，从而获得转化的植物。例如，可以与WO94/11519或US6，103，956中公开的使用转化植物生产PHA的方法相同的方式或类似的方式，获得根据本发明的转化植物。更具体地说，转染植物的产生可包括(a)预培养靶植物的外植体和共培养外植体与用于转染植物的转化的土壤杆菌；(b)在愈伤组织诱导培养基中培养转染的外植体以获得愈伤组织；和(C)切出愈伤组织并在芽诱导培养基中培养切出的愈伤组织以获得芽。本发明中，术语外植体”指从植物切割的组织片段，而且包括子叶或胚轴。子叶或胚轴可用作植物的外植体，用于本发明的方法。优选使用通过消毒和清洁植物的种子，并在Murashige和Skoog(MS)培养基中萌发种子而获得的子叶。本发明中，待转化的靶植物可以是烟草、番茄、红辣椒、豆、水稻植物、玉米等等，但是本发明不限于此。而且，本领域技术人员知道即使用于转化的植物是可有性繁殖的，它可通过组织培养等无性繁殖。有益效果如上面解释的，本发明提供了一种能够由蔗糖有效生产聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的细胞或植物和通过使该细胞或植物生长或者培养该细胞或植物生产PLA和PLA共聚物的方法。图1是根据本发明的实施例制备含有来自假单胞菌属sp.6-19的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的突变基因、来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变基因和来自富氧罗尔斯通氏菌的PhaAB的基因的重组表达载体的方法的示意图。具体实施例方式在下文中，将更详细地描述本发明的实施例。然而，本发明不限于下面公开的实施例，但是可以各种修饰形式实现本发明。提供本实施例足以使本领域普通技术人员能具体化和实施本发明。实施例1重组大肠杆菌的制备制备用pPs619C1400CPPCT532ReAB质粒转化的重组大肠杆菌W。根据本实施例的大肠杆菌菌株W(ATCC9637)可代谢作为碳源的蔗糖。构建制备用于本发明的pPs619C1400CPPCT532ReAB质粒来表达4种主要的酶。这些主要的酶对大肠杆菌中聚(3-羟基丁酸酯-共-乳酸酯)的生物合成是必不可少的，聚(3-羟基丁酸酯-共-乳酸酯)是一种可生物降解的聚合物。这些主要的酶可以是phaClPs6_19400(其是来自假单胞菌属sp.6-19(KCTC11027BP)的聚合酶)、来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)(其是将辅酶A从乙酰辅酶A转移到要被转变成乳酰辅酶A的乳酸酯的酶)、和来自富氧罗尔斯通氏菌的酮硫解酶(PhaAlffi)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(phaBEE)(其是用于由蔗糖合成3-羟基丁基-辅酶A的酶)。PPs619C1400CPPCT532ReAB质粒包含分别编码上述主要的酶的phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAKE和phaBKE基因(参见图1)。而且，通过突变phaClPs6_19的基因(其是SEQIDNO3的来自假单胞菌属sp.的PHA合酶)和SEQIDNO1的CP-PCT的基因分别获得phaClPs6_19400和CPPCT532基因，其对于PLA和PLA共聚物是有利的。制备pPs619C1400CPPCT532ReAB质粒以在重组大肠杆菌中组成性表达全部4种基因。实施例1-1由假单胞菌属sp.6-19制备PHA合酶的底物特异性突变体在各种PHA合酶中，II型PHA合酶已知为中链长的PHA(MCL-PHA)合酶，用于聚合具有相对较多碳原子的底物，而且期待MCL-PHA合酶在生产PLA共聚物中非常有用。虽然来自假单胞菌属sp.61-3的phaCl合酶是II型合酶，其与根据本发明获得的phaClPs6_19具有高度同源性，已经报道PhaCl合酶具有相对宽范围的底物特异性(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180:6459，1998)，并报道了对适于生产短链长PHA(SCL-PHA)的突变体的研究结果(Takase等人，Biomacromolecules,5480,2004)。基于上述研究，如韩国专利申请第10-2006-0116234号中公开的，使用影响SCL激活的氨基酸通过SDM方法，本发明人制备了phaClPS6_19合酶的突变体。更具体地说，为了从假单胞菌属sp.6-19(KCTC11027BP)分离PHA合酶(phaClPs6_19)基因，提取假单胞菌属sp.6-19的总DNA，根据phaClPs6_19的碱基序列(Ae-jinSong,Master'sThesis,DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,KAIST，2004)制备具有SEQIDNO:5和6的碱基序列的引物，并进行聚合酶链式反应(PCR)以获得phaClPs6_19基因。SEQIDNO55'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3'SEQIDNO65'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'当对PCR反应物进行琼脂糖凝胶电泳时，证实了对应于phaClPs6_19基因的1.7kbp基因片段。为了表达phaClPs6_19合酶，采用操纵子型组成型表达系统，其中同时表达单体供给酶和合酶。用BamHI/EcoRI切割来自pSYL105载体(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994,441337-1347)的DNA片段，其含有来自富氧罗尔斯通氏菌H16的产生PHB的操纵子，然后插入到pBluescriptII(Stratagene)的BamHI/EcoRI限制性位点，从而制备pReCAB重组载体。已知pReCAB载体通过PHB操纵子启动子组成性表达PHA合酶(phaCKE)和单体供给酶(phaAKE*phaBKE)，而且在大肠杆菌中有效地被操纵(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，441337-1347)。用BstBI/Sbfl切割pReCAB载体以除去富氧罗尔斯通氏菌H16PHA合酶(phaCRE)，并将phaClPs6_19基因插入到BstBI/Sbfl限制性位点，从而制备pPs619CI-ReAB重组载体。为了制备在任意一个末端具有仅仅一个BstBI/Sbfl限制性位点的phaClPs6_19合酶基因片段，通过定点诱变(SDM)除去内源的BstBI位点而不改变氨基酸，并使用具有SEQIDNO7和8、9和10、以及11和12的碱基序列的引物，通过重叠PCR添加BstBI/Sbfl限制性位点。SEQIDNO75'-atgcccggagccggttcgaa~3'SEQIDNO85'-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3'SEQIDNO95'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3‘SEQIDNO105'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3‘SEQIDNO115'-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3‘SEQIDNO125‘-aacgggagggaacctgcagg-3‘通过测序证实制备的PPs619Cl-ReAB重组载体的phaClPs6_19基因的序列，并表示为SEQIDNO:3，而且由SEQIDNO3的碱基序列编码的氨基酸的序列表示为SEQIDNO4。为了检验phaClPs6_19合酶是否生产PHB，将PPs619Cl-ReAB重组载体转化到大肠杆菌XL-IBlue(Stratagene)中，然后转化的大肠杆菌生长于PHB检测培养基(LuriaBertani(LB)琼脂，葡萄糖20g/L，尼罗红0.5μg/ml)中。结果，没有检测到PHB产物。通过氨基酸序列分析，发现了影响SCL活性的3个氨基酸位点，并使用表1中所示的SEQIDNO1318的引物，通过SDM制备了phaClPs6_19合酶的突变体。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>S325TSEQIDNO135'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'SEQIDNO145'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'Q481MSEQIDNO155'-CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3'SEQIDNO165'-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3'E130DSEQIDNO:17:5'-ateaacctcatgaccgatgcgatggcgccgacc_3'SEQIDNO:18:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat_3'重组载体被转化到大肠杆菌XL-IBlue中，并生长于PHB检测培养基中(LB琼脂，葡萄糖20g/L，尼罗红0.5μg/ml)。结果，在用pPs619C1200-ReAB转化的大肠杆菌XL-IBlue和用pPs619C1300-ReAB转化的大肠杆菌XL-IBlue中都能证实PHB的生产。也就是说，由于单体供给酶(phaAKE和phaBKE)，由蔗糖产生了3HB-辅酶A，而且phaClPs6_19合酶SCL突变体(phaClPs6_19200&phaClPs6_19300)利用3HB-辅酶A作为底物合成了PHB。这里，为了构建表达来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)的操纵子型组成型表达系统，其用于提供作为合成PLA和PLA共聚物所需的单体的乳酰辅酶A，使用cp-pct基因。对于cp-pct基因，使用SEQIDNO19和20的引物，通过PCR克隆由聚合丙酸梭菌的染色体DNA获得的DNA片段。在这种情况下，通过SDM除去野生型cp-pct基因中存在的NdeI位点以便于克隆。SEQIDNO195'-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGASEQIDNO205'-gctctagattaggacttcatttccttcagacccattaagccttctg还使用SEQIDNO21和22的引物进行重叠PCR，以便添加Sbfl/Ndel限制性位点。SEQIDNO215‘-aggcctgcaggcggataacaatttcacacagg-3‘SEQIDNO225'-gcccatatgtctagattaggacttcatttcc_3'包含phaClPs6_19300的pPs619C1300_ReAB载体(phaClPs6_19300是phaClPs6_19合酶SCL突变体)用Sbfl/Ndel切割以从富氧罗尔斯通氏菌H16除去单体供给酶(phaAKE和phaBKE)，并将PCR克隆的cp-pct基因插入到Sbfl/Ndel限制性位点中，从而产生pPs619C1300-CPPCT重组载体。类似地，使用下列引物产生各种PHA合酶突变体。产生的突变体排列在下面的表2到5中。E130DSEQIDNO:175'-ateaacctcatgaccgatgcgatggcgccgacc_3'SEQIDNO:18:5'-ggteggcgccatcgcateggtcatgaggttgat_3'S325TSEQIDNO135'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'SEQIDNO145'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'S477RSEQIDNO235'-gaattcgtgctgtcgagecgcgggcatatc_3'SEQIDNO-.24-.5'-gatatgcccgcggetcgacagcacgaattc_3'S477HSEQIDNO255'-gaattcgtgctgtcgagecatgggcatatc_3'SEQIDNO:26:5'-gatatgcccatggetcgacagcacgaattc_3'S477FSEQIDNO275'-gaattcgtgctgtcgagetttgggcatatc_3'SEQIDNO285'-gatatgcccaaagetcgacagcacgaattc~3'S477YSEQIDNO295'-gaattcgtgctgtcgagetatgggcatatc_3'SEQIDNO:30:5'-gatatgcccatagetcgacagcacgaattc_3'S477GSEQIDNO315'-gaattcgtgctgtcgageggcgggcatatc-3'SEQIDNO:32:5'-gatatgcccgccgetcgacagcacgaattc_3'Q481KSEQIDNO:33:5'-gggcatateaaaageatectgaacccgc_3'SEQIDNO345'-gcgggtteaggatgcttttgatatgccc_3'Q481MSEQIDNO:35:5'-gggcatateatgageatectgaacccgc_3'SEQIDNO365'-gcgggtteaggatgcteatgatatgccc_3'Q481RSEQIDNO:37:5'-gggcatatecgcageatectgaacccgc_3'SEQIDNO385'-gcgggtteaggatgctgcggatatgccc_3'[表2]组合酶ι核酸取代酸取代ι引物pPs619C1200AGC—ACCS325T__SEQIDNO:13和14_CAG—ATGQ481M__SEQIDNO:35和36pPs619C1202GAA-^GATE130D__SEQIDNO:17和18__CAG—AAAQ481K__SEQIDNO:33和34pPs619C1203AGC—ACCS325T__SEQIDNO:13和14_CAG—AAAQ481K__SEQIDNO:33和34tjAA-^GAT^EQTPTO:IT^TO_CAG-^ATGQ481M__SEQIDNO:35和36pPs619C1205GAA—GATE130D__SEQIDNO:17和18_CAG-CGCQ481RSEQIDNO:37和38[表3]"i组合酶I核酸取代酸取代I引物pPs619C1300|GAA—GAT|E130D|SEQIDNO:17和18<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>使用上述的易错PCR，对最终选择的突变体512和522进行随机诱变，从而获得下面的CP-PCT突变体531-537。[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>其后，为了扩增包含CpPct532突变的PCR片段，使用SEQIDNO:39和40的引物，在通常条件下，进行PCR方法。用Sbfl/Ndel切割pPs619C1300-CPPCT载体，以除去野生型CP-PCT基因，并将扩增的CpPct532PCR片段插入到Sbfl/Ndel限制性位点中，以产生连接混合物，从而产生用于下面的实施例1-3中的pPs619C1300-CPPCT532载体。实施例1-3:pPs619C1300-CPPCT532载体的制备使用SEQIDNO41和42的引物，利用phaClPs6_19合酶突变体(phaClPs6_19300)，通过SDM制备来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶突变体(phaClPs6_19400)，其具有其中E130D、S325T、S477R和Q481M突变的氨基酸顺序。SEQIDNO415'_ttcgtgctgtcgageagagggcatatc-3'SEQIDNO425'-gatatgccctctgetcgacagcacgaa_3'将得到的重组载体(pPs619C1400-CPPCT532)转化到大肠杆菌JM109中，并生长于包含3HB的聚合物检测培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，3HB2g/L，尼罗红0.5μg/ml)中。结果，检测到聚合物产生。实施例1-4:PPs619C1400CPPCT532ReAB质粒的制备和大肠杆菌的转化为了产生包含phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAEE和phaBEE基因的质粒，phaClPs6_19400、CPPCT532、phaAKE和phaBKE基因分别编码从蔗糖有效生产PLA和PLA共聚物所需的酶，对于产生PHB的启动子pReC和来自富氧罗尔斯通氏菌H16的phaAKE和phaBKE基因，分别使用SEQIDNO43和44的引物与SEQIDNO45和46的引物，对pSYL105载体(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，441337-1347)进行PCR克隆。SEQIDNO435‘-agacatatgcaagtaccttgccgacatctatg-3‘SEQIDNO445'-gatgacaacgtcagtcatgatttgattgtctctctg_3'SEQIDNO455'-cagagagacaatcaaateatgactgacgttgtcatc~3'SEQIDNO465'-gcaggtcagcccatatgcag-3'PCR反应物在琼脂糖凝胶上进行纯化，并使用PCR反应物作为模板，和SEQIDNO43和46的引物，进行重叠PCR。PCR反应物和pPs619C1400CPPCT532载体用NdeI切割，并将PCR反应物(pReC-phaABRE)插入到pPs619C1400CPPCT532载体的NdeI限制性位点，从而得到pPs619C1400CPPCT532ReAB载体，如图1所示。在pPs619C1400CPPCT532ReAB载体中，产生PHB的启动子(pReC)另外被插入到phaAKE和phaBKE基因的前部分，以进一步促进靶phaARE和phaBRE基因的转录。重组载体(pPs619C1400CPPCT532ReAB)被转化到大肠杆菌JM109中，并生长于不含3HB的聚合物检测培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，尼罗红0.5μg/ml)中。结果，能观察到聚合物产生。因此，可以证实另外插入到pPs619C1400CPPCT532载体中的phaAKdnphaBKE基因被正常表达和操纵。实施例2使用蔗糖作为碳源由重组大肠杆菌制备聚(3-羟基丁酸酯-共-乳酸酯)(P(3HB-共-LA))将包含100mg/L氨苄青霉素作为抗生素的LB琼脂平板上的克隆，接种到3mL包含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，并于30°C培养12小时，同时以200rpm搅动。将ImL培养液分别接种到IOOmL甲基红(MR)培养基与IOOmLLB培养基中，其含有100mg/L氨苄青霉素，20g/L蔗糖，和有时2g/L3-羟基丁酸酯。然后，每种培养液于30°C培养4天，同时以200rpm搅拌。使用10NNaOH调节MR培养基的初始pH到pH7。下面的表8中显示了用于本培养方法中的培养基的例子。培养完成以后，从培养液回收生物量。回收的细胞用蒸馏水洗涤3次，并在干燥器中保持在大约100°C干燥24小时。部分收集干燥的细胞并进行气相色谱(GC)分析，从而测定细胞中合成的P(3HB-共-LA)的含量。用于GC分析的标准材料是P(3HB-共-3HV)共聚物(包括大约12%的3HV，按重量计)和PLA均聚物。GC分析结果示于下面的表9中。从表9中能看出，不管是否添加3HB，在MR和LB培养基中，都能生物合成P(3HB-共-LA)共聚物。而且，能证实在MR培养基中比在LB培养基中更有效地生物合成P(3HB-共-LA)共聚物。因此，使用根据本发明的重组大肠杆菌，能由蔗糖生产P(3HB-共-LA)共聚物。[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*痕量溶液(/L)IOgFeSO4·H2O;2·25gZnSO4·H2O；IgCuSO4·H2O；0.5gMnS04·H2O；2gCaCl2·H2O；0.23gNa2B4O7·H2O；0.Ig(NH4)6Mo7O24；IOmL35%HCl。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*Su:20g/L蔗糖**3HB:2g/L3_羟基丁酸酯虽然已经参考其某些实施例显示和描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以多种形式和细节对其进行各种改变，而不背离如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。权利要求一种由蔗糖生产聚乳酸酯(PLA)或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物的方法，包括在包含乳酸酯和蔗糖的环境或者包含乳酸酯、蔗糖和羟基链烷酸酯的环境中，培养细胞或植物或者使细胞或植物生长，其中，所述细胞或植物包含将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因，而且其能够使用蔗糖作为底物生产PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物；和从所述细胞或植物中收获PLA或羟基链烷酸酯-乳酸酯共聚物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过用将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因中的至少一种，转化不含有将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因中的至少一种且能够使用蔗糖作为底物的细胞或植物，来获得所述细胞或植物。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯_乳酸酯共聚物的羟基链烷酸酯是选自3-羟基丁酸酯、3-羟基戊酸酯、4-羟基丁酸酯、具有6到14个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4-羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基-4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式_己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3-羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-6-顺式-十二碳烯酸、3-羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-7-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸_丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酸基辛酸、3-羟基-9-乙酸基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基-3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四碳烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7-氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴i^一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二碳烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因是丙酰辅酶A转移酶基因(pet)。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因是来自丙酸梭菌的pet基因。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因具有选自以下的一种SEQIDNO1的碱基序列；通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C获得的碱基序列；通过突变SEQIDN0:1的碱基序列中的A1200G获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Gly335Asp获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Gly获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp65Asn获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Thrl99Ile获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Ala243Thr获得的碱基序列；通过突变SEQIDNO1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Asp257Asn获得的碱基序列；和通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C和突变SEQIDNO2的氨基酸序列中的Vall93Ala获得的碱基序列。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因具有通过突变SEQIDNO:1的碱基序列中的A1200G和突变SEQIDNO:2的氨基酸序列中的Ala243Thr获得的碱基序列。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因是来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的基因。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因具有对应于以下的碱基序列SEQIDNO4的氨基酸序列；或者其中SEQIDNO4中选自E130D、S325T、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K和Q481R中的至少一个突变的氨基酸序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶的基因具有对应于其中SEQIDNO4中的E130D、S325T、S477R和Q481M突变的氨基酸序列的碱基序列。11.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中，所述细胞或植物另外包含由蔗糖生产羟酰辅酶A的酶的基因。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述由蔗糖生产羟酰辅酶A的酶是酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶来源于富氧罗尔斯通氏菌。14.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中，所述细胞是细菌。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。全文摘要本发明提供了一种能够由蔗糖生产聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的微生物和使用该微生物由蔗糖生产PLA或PLA共聚物的方法。把将乳酸酯转变成乳酰辅酶A的酶的基因和使用乳酰辅酶A作为底物的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶的基因引入到能够使用蔗糖作为底物的微生物中，并使用蔗糖作为底物培养该微生物，从而有效地生产PLA或PLA共聚物。文档编号C12N15/05GK101835895SQ200880105983公开日2010年9月15日申请日期2008年8月8日优先权日2007年9月7日发明者姜惠玉,朴时载,李相贤,梁宅镐,金泰完申请人:Lg化学株式会社;韩国科学技术院