重组微生物以及聚-γ-谷氨酸的制造方法

专利名称：：重组微生物以及聚-γ-谷氨酸的制造方法重组微生物以及聚-Y-谷氨酸的制造方法技术区域本发明涉及具有聚_Y_谷氨酸产生能力的重组微生物，以及使用该重组微生物制造聚_Y_谷氨酸的制造方法。
背景技术：
：聚-Y-谷氨酸是谷氨酸的Y-位羧基和α-位氨基通过肽键连接而成的高分子化合物。聚-Y-谷氨酸有时也被称为Y-聚谷氨酸。聚-Y-谷氨酸作为纳豆杆菌(Bacillussubtilisvar.natto)所产生的粘性物质已为人所知，且近年来，由于其具有各种性质，作为新型的高分子材料备受关注。下面的说明中将聚-Y-谷氨酸简称为PGA。作为产生PGA的微生物，可以举出包括纳豆杆菌在内的部分芽孢杆菌(Bacillus)属细菌及其近亲禾中(Bacillussubtilisvar.chunRkookjanR>Bacillusicheniformis、Baci1IusmeRaterium>Bacillusanthracis>Baci1lushalodurans)、NatrialbaaeRyptiaca.Hydra等(例如，参照非专利文献1)。另外，虽然在分类学上，微生物中具有PGA产生能力的纳豆杆菌被认为是不具有PGA产生能力的枯草杆菌的亚种，但是，已知任意菌株都在相同的转录起始调控区域、翻译起始调控区域的下游处存在编码PGA合成酶的_、_及基因，具有基因簇(cluster)结构(操纵子)(例如，参照非专利文献3、6及8)。并且，推测纳豆杆菌的PGA产生调控机制与枯草杆菌转化能力获得机制一起受到细胞内的很多调控因子所参与的复杂调控(例如，参照非专利文献9及10)。作为PGA的产生方法，可以通过上述PGA产生菌的育种来提高其产生能力，但是，在消除野生株的严格的调控机制、消除野生株的复杂的营养需求性、或者为了得到稳定的产生能力而进行优化等方面需要耗费大量的劳力，因而被认为是没有效率的PGA产生方法。为此，作为代替这些野生株的育种的有效率的手法，考虑尝试利用基因重组技术。作为迄今为止所知的利用基因重组技术来产生PGA的例子，已公开在质粒中导入了基因的重组枯草杆菌(BacillussubtilisISW1214株)中约9.Og/L/5日(参照非专利文献2)的产生能力，以及在质粒中导入了基因的重组大肠杆菌中约4g/L/l.5日(参照非专利文献7)的产生能力，或2.5mg/40mg-干燥菌体(参照非专利文献6)的产生能力。然而，上述所公开的产生方法都被认为没有达到充分的产生能力。另外，公开了在纳豆杆菌中凭借称作PgsBCA的膜结合型酶系，非核糖体依赖性地产生PGA(例如，参照非专利文献4)。在这些PGA合成酶系PgsBCA中，已知PgsB(另称为ywsC)参与了作用于谷氨酸的Y-位的羧基的酰胺连接酶反应(例如，参照非专利文献3、5)。而根据非专利文献3可推定，PgsC(另称为YwtA)通过膜结合型蛋白质参与将PGA排出到细胞外；根据非专利文献4及5可知，PgsC与PgsB—起参与谷氨酸的连接反应，而PgsC的功能迄今尚不明确。并目.，非专利文献2中公开了，对在染饩体上缺失DgsB基因、DgsC基因以及DgsA基因的枯草杆菌中，导入单独表汰诜自DgsB基因、DgsC基因及DgsA基因中的1个基因的载体或者组合多个基因进行表达的载体，所得到的PGA产生能力进行研讨的结果。根据非专利文献2可以得到结论，如果ηκ巡基因、_基因及^KM基因不全部表达，则PGA不能产生。另外，在非专利文献3中，在具有PGA产生能力的纳豆杆菌(IF016449株)中，构建盛基因(另称为基因)缺失株、基因(另称为IiM基因)缺失株以及DgsA基因(另称为M边基因)缺失株，对各个缺失株的PGA产生能力进行了验证。其中根据非专利文献3可以得到结论，在具有PGA产生能力的纳豆杆菌中，_基因及_基因对于产生PGA是必需的，并且ηκΜ基因对于高产生PGA也是必需的。并且，在专利文献1中公开了通过使用桉DgsB基因、DgsC基因及DgsA基因的顺序导入这些基因的载体来转化大肠杆菌，原本不具有PGA产生能力的大肠杆菌也被赋予了PGA产生能力，但是，根据非专利文献6可知，虽然在重组大肠杆菌中导入PgsBCA基因的条件下产生了PGA，但是，在导入DgsBC基因的条件下不产生PGA。另外，在专利文献25中公开了通过用各种营养盐培养基培养纳豆杆菌等可产生PGA的微生物，产生平均分子量为数千200万的PGA；另外，在专利文献6中公开了通过给纳豆杆菌施加外部压力来产生300万以上的PGA。另一方面，非专利文献11、专利文献7及8中公开了可以用微生物产生光学纯度高的PGA;专利文献7中公开了使用巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)株，可以以大约10g/L/5日的量产生L-谷氨酸含量为90%以上的PGA；在专利文献8中公开了埃及钠白菌(NatrialbaaeRyptiaca)的突变株以大约5g/L/6日的量产生分子量130万以上的聚-Y-L-谷氨酸。非专禾Ij文献1:Ashiuchi，M.，etal.:Appl.Microbiol.Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)#专禾IjJC^2:Ashiuchi,Μ.,etal.:Biosci.Biotechnol.Biochem.,70,pp.1794-1797(2006)非专利文献3=Urushibata,Y.，etal.J.Bacteriol.，184，pp.337—343(2002)非专利文献4芦内诚等未来材料，3，pp.44-50(2003)非专利文献5:Ashiuchi，M.，etal.:Eur.J.Biochem.,268,pp.5321-5328(2001)非专禾lJ文献6:Ashiuchi,Μ.,etal.:Biochem.Biophys.Res.Commun.,263,pp.6-12(1999)非专利文献7Jiang,H.，etal.=Biotechnol.Lett.，28，pp.1241—1246(2006)非专利文献8=Presecan,Ε.，etal.=Microbiology,143，pp.3313—3328(1997)非专禾Ij文献9:Itaya，M.，etal.:Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,pp.2034-2037(1999)非专利文献10今中忠行等微生物利用的大展开，第1章第4节，pp.657-663(2002)非专禾Ij文献11:Shimizu，K.，etal.:Appl.Environ.Microbiol.,73,pp.2378-2379(2007)专利文献1日本特开2001-17182号公报专利文献2日本特公昭43-24472号公报专利文献3日本特开平1-174397号公报专利文献4日本特开平3-47087号公报专利文献5日本专利第3081901号说明书专利文献6日本特开2006-42617号公报专利文献7日本特开2007-228957号公报专利文献8日本特开2007-314434号公报
发明内容然而，上述非专利文献13、7以及专利文献1中并没有公开用于提高产生PGA的技术，在现有的见解中存在不能高效地产生PGA的问题。而且，迄今为止也没有关于使用基因工程学的手法来调整PGA的分子量的报道。鉴于上述情况，本发明旨在提供能高效地产生PGA的重组微生物、使用该微生物的PGA的制造方法，以及，提供通过基因导入来提高PGA的产生能力的方法、PGA的分子量调整方法以及调整PGA的光学纯度的方法。本发明人对此进行了努力研究讨论，结果发现，通过使用将ηκ巡基因或与该基因相当的基因、以及基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物所得到的重组微生物，能够实现PGA的高产出、PGA的分子量调整和/或光学纯度的调整。本发明是基于上述认识而完成的。本发明所涉及的重组微生物是将参与PGA合成的基因群(DgsBCA某因)中的枯草杆菌的ηκ巡基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的_基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物，并且不将枯草杆菌的nsM基因或与该基因相当的基因导入该宿主微生物。即，与现有的见解相反，本发明所涉及的重组微生物基于的见解是不导入枯草杆菌的MM基因或与该基因相当的基因反而具有出色的PGA产生能力。在此，优选上述M盛基因为编码下列(a)或(b)的蛋白质的基因。(a)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有在序列号2所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有酰胺连接酶活性的蛋白质。另外，优选上述PgSC基因为编码下列(C)或(d)的蛋白质的基因。(c)含有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质；(d)含有在序列号4所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且，具有在上述基因所编码的PgsB蛋白质的存在下生成PGA的功能的蛋白质。并且，本发明所涉及的重组微生物中，所导入的基因优选为上述M盛基因或与该基因相当的基因、以及上述ES丛基因或与该基因相当的基因连接于在宿主细胞内发挥作用的、且表达受正调控的转录起始调控区域、翻译起始调控区域的下游处。并且，本发明所涉及的重组微生物优选为作为宿主的微生物为芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。作为芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，例如可以举出枯草杆菌(Bacillussubtilis)。另一方面，本发明所涉及的PGA的制造方法为，培养上述本发明所涉及的重组微生物，从而获得生成的PGA的方法。另一方面，本发明所涉及的PGA的产生能力提高方法，其特征在于，将参与PGA合成的基因群中的枯草杆菌的—基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的—基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来使PGA的产生能力提高。另一方面，本发明所涉及的PGA的分子量调整方法，其特征在于，将参与PGA合成的基因群中的枯草杆菌的—基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的_基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来调整PGA的分子量(优选使PGA高分子量化)。另一方面，本发明所涉及的PGA的光学纯度调整方法，其特征在于，将参与PGA合成的基因群中的枯草杆菌的—基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的—基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来调整PGA的光学纯度(优选使PGA的L-异构体的比率增加)。图1是流程图，用于说明参与PGA合成的基因群的克隆工序的一个例子，从而构建用于产生PGA的重组载体。图2是流程图，用于说明在制造例5中，通过利用SOE-PCR片段的双交换法(doublecrossingmethod)而进行的靶基因缺失顺序。图3是流程图，用于说明在制造例2及制造例3中，参与PGA合成的基因群的克隆工序，从而构建用于产生PGA的重组载体。图4是流程图，用于说明在制造例4中，参与PGA合成的基因群的克隆工序，从而构建用于产生PGA的重组载体。参照附图，从下述记载可以更明确本发明的上述以及其他特征及优点。具体实施例方式下面对本发明进行详细说明。本发明所涉及的重组微生物是，在作为宿主的微生物中，除了参与PGA合成的基因群中的枯草杆菌的DgsA基因或与该基因相当的基因以外，将枯草杆菌的DgsB基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的M巡基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物而得到的，并且具有聚_Y_谷氨酸产生能力。在此，参与PGA合成的基因群是指，在枯草杆菌中，由pgSB基因(另称为BG1253111丛基因、或迎迪基因)、M巡基因(另称为BG12532:ywtA基因、或capC基因、)以及MM基因(另称为BG12533:n坦基因、或迎M基因)构成的基因群。作为基因重组的宿主微生物而被广泛利用的BacillussubtilisMarburgNo.168系统株，虽然其染色体上具有这些_基因、MsC基因以及MM基因，却没有PGA产生能力。与此相同，纳豆杆菌(Bacillussubtilisvar.natto)在其染色体(基因组)上具有这些PrsB基因、M巡基因以及MM基因，但是，却具有PGA产生能力。另外，基因的名称、编号都是基于JAFAN[JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BS0RFDB)]网上公开(http://Bacillus,genome,ad.jp/,2006年1月18日更新)的枯草杆菌基因组数据的记载的。序列号1表示DgsB基因的碱基序列，序列号2表示DgsB基因所编码的PgsB蛋白质的氨基酸序列。另外，本发明中的ηκ巡基因并不限定于由序列号ι所示的碱基序列构成的基因，而是包括编码以下蛋白质的基因该蛋白质含有在序列号2所示的氨基酸序列中使ι个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且以谷氨酸作为基质而具有酰胺连接酶活性。在此，多个是指，例如可以为280个，优选为240个，更优选为220个，进一步优选为210个，最优选为25个。另外，本发明中的_基因包括以下基因该基因含有相对于序列号1所示的碱基序列具有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性(geneticidentity)的碱基序列，且编码具有酰胺连接酶活性的蛋白质。在此，碱基序列的同源性利用Lipman-Pearson法[参照Lipman，DJ.，Pearson,WR.=Science,227,PP.1435-1441(1985)]计算。具体而言，使用基因信息处理软件Genetyx-Win(Software开发)的同源性解析(Searchhomology)程序，将Unitsizetocompare(ktup)设定为2进行解析并由此计算。另外，上述酰胺连接酶活性的测定如下在以谷氨酸和ATP作为基质，在其中加入氯化锰后作为反应溶液使用的情况下，通过确认反应溶液中PGA的生成来进行测定[例如，参照Urushibata,Y.，etal.:J.Bacteriol.，184，pp.337-343(2002)]。并且，本发明中的_基因包括以下基因该基因在严格条件下与序列号1所示的碱基序列的互补链杂交，且编码具有酰胺连接酶活性的蛋白质。在此，作为“严格条件下”，例如可以举出分子克隆实验指南第三版(MolecularCloning-ΑLABORATORYMANUALTHIRDEDITION)[JosephSambrook,DavidW.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)]记载的条件。例如，可以举出将探针置于含6XSSC(1XSSC的组成0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.5%SDS、5XDenhardt以及100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，并且在65°C下恒温培养816小时，并使之杂交的条件。另外，如下面具体说明的实施例所示，上述酰胺连接酶活性是指，DgsB基因与ES丛基因一起被导入宿主微生物的时候，在菌体外产生PGA的能力。对规定的微生物中的PGA产生能力的评价，可以按照以下方法进行，例如在含有谷氨酸或其盐的PGA产生琼脂培养基中进行培养的时候，对形成在菌落周边的半透明粘性物质进行目测观察的方法；根据SDS-PAGE检测PGA的方法[例如，参照Yamaguchi，F.，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.60,pp.255-258(1996)]；或是在酸解后使用氨基酸分析装置进行定量的方法[例如，参照Ogawa，Y.，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.,61,pp.1684-1687(1997)]；精制培养液后求出干燥重量的定量法[例如，参照Ashiuchi，Μ.，etal.=Biochem.Biophys.Res.Commun.，263:pp.6-12(1999)]；根据采用了凝胶过滤色谱柱的HPLC(高效液相色谱法)的定量/定性法[例如，参照Kubota,H.，etal.=Biosci.Biotechnol.Biochem.，57，pp.1212-1213(1993)]。序列号3表示M巡基因的碱基序列，序列号4表示PgSC基因所编码的PgsC蛋白质的氨基酸序列。另外，本发明中的M巡基因并不限定于由序列号3所示的碱基序列构成的基因，而是包括编码以下蛋白质的基因该蛋白质含有在序列号4所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有在上述PgsB蛋白质的存在下生成PGA的功能。在此，多个是指，例如可以为230个，优选为215个，更优选为28个，进一步优选为24个，最优选为2个。另外，本发明中的_基因包括以下基因该基因含有相对于序列号3所示的碱基序列具有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别为优选99%以上的遗传一致性的碱基序列，且对具有在上述Eg巡蛋白质的存在下生成PGA的功能的蛋白质进行编码。在此，碱基序列的遗传一致性的定义与上述相同。另外，本发明中的_基因包括以下基因该基因在严格条件下与序列号3所示的碱基序列的互补链杂交，且对具有在上述Ek^蛋白质的存在下生成PGA的功能的蛋白质进行编码。在此，“严格条件下”的定义与上述相同。另外，所谓在上述Ek盛蛋白质的存在下生成PGA的￡￡巡蛋白质功能是指，使_基因和DgsC基因一起在宿主微牛物中表汰的时候,在菌体外产牛PGA的能力。具体如下面实施例及参考例所示，在使ηκ巡基因单独表达的宿主微生物中不产生PGA，而在使_基因和DgsC基因一起表汰的时候则产牛PGA,这是基于本发明人提出的见解。另一方面，本发明所涉及的重组微生物并不限定于将上述那样的来自枯草杆菌的DgsB基因和Dgsc基因导入宿主微牛物,例如也可以在来自枯草杆菌以外的微牛物的PGA合成关联基因所构成的基因群中，将与ηκ巡基因相当的基因(Μ巡同源基因)以及与_基因相当的基因同源基因)导入宿主微牛物。DgsB同源基因以及DgsC同源基因，可以按照常法由公知的产生PGA的微生物分离和鉴定得到。作为具有PGA产生能力的微生物，除TBacillussubtilis以夕卜，还可以举出Bacilluslicheniformis、BaciIlusmegaterium、Bacillusanthracis、Bacillushalodurans、Natrialbaaegyptiaca、Hydra等，可以从这㈣微牛物分离和鉴定PRSB同源基因以及DgsC同源基因。例如，可以从上述微生物提取基因组DNA，通过将由上述序列号1所示的碱基序列构成的多核甙酸作为探针的Southern杂交来分离DgsB同源基因。对于M巡同源基因也可以进行同样的分离。并且，随着近年来基因组测序的迅速发展，即使是不产生PGA的微生物，也可以基于其基因组序列信息，来分离和鉴定如上述那样定义的枯草杆菌M盛同源基因。并目.，对于枯草杆菌DgsC同源基因也可以同样地分离和鉴定。本发明所涉及的重组微生物通过将上述M盛基因或M盛同源基因、以及M丛基因或M巡同源基因导入宿主微生物来制造得到。在此，本发明中所使用的宿主微生物没有特别限定，但是，具体而言，可以举出Bacilluslicheniformis、Bacillusmegaterium、Bacillusanthracis>Bacillushalodurans>Bacillussubtilis等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，梭菌(Clostridium)属细菌，棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌，大肠杆菌(Escherichiacoli)或酵母等，其中优选芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。并且，从其全基因组信息已明确，且基因工程学、基因组工学技术已确立的观点，以及作为宿主微生物的安全性及优良性已得到认可的微生物菌株已开发的观点出发，特别优选枯草杆菌(Bacillussubtilis)。并且，所选择的宿主细胞可以使用野生型的细胞、或将规定的突变导入野生型细胞而得到的突变株中的任一种。并且，在突变株中，尤其是通过使编码PGA分解酶的基因(PGA分解酶基因)缺失的突变株作为宿主来使用，可以期待更好的效果。作为枯草杆菌中的PGA分解酶基因，已知的有^rt基因[例如，参照Kimura，K.，etal.Microbiology，150，pp.4115-4123(2004)]。序列号7表示sgi基因的碱基序列，序列号8表示被sgi基因编码的PGA分解酶的氨基酸序列。另外，在使用枯草杆菌以外的微生物作为宿主的情况下，也优选使用与KSi基因相当的基因已缺失的突变株。另外，本发明中的SSi基因并不限定于由序列号7所示的碱基序列构成的基因，而是包括编码以下蛋白质的基因该蛋白质含有在序列号8所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且编码具有PGA分解活性的蛋白质。在此，所谓多个，例如可以为2120个，优选为260个，更优选为230个，进一步优选为215个，最优选为28个。另外，本发明中的SSt基因包括以下基因该基因含有相对于序列号7所示的碱基序列具有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性的碱基序列，且编码具有PGA分解活性的蛋白质。在此，碱基序列的遗传一致性的定义与上述同样。并且，本发明中的Sgi基因包括以下基因该基因在严格条件下与序列号8所示的碱基序列的互补链杂交，且编码具有PGA分解活性的蛋白质。在此，“严格条件下”采用与上述同样的定义。作为使SSi基因或其同源基因缺失的方法，可以适当采用现有公知的手法。例如，将含有部分SSt基因的DNA片段克隆在适当的质粒(载体)上得到环状的重组质粒，将该重组质粒导入亲本微生物细胞内，利用靶基因的部分区域中的同源重组，来分割亲本微生物基因组上的靶基因并使其失活[例如，参照Leenhouts，K.，etal.:Mol.Gen.Genet.，253，pp.217-224(1996)]。尤其是在使用枯草杆菌作为用于构建本发明微生物的亲本微生物的情况下，对于利用同源重组来使靶基因缺失或失活的方法，已有几个报道例[例如，参照Itaya，Μ.，Tanaka,Τ.:Mol.Gen.Genet.,223,pp.268-272(1990)]，通过反复使用该方法，可得到目标宿主微生物。另外，作为使随机基因失活的方法，还可通过使用突变诱发剂以及对亲本微生物实施紫外线、Y射线等照射。在这种情况下，除了向M结构基因内进行碱取代、碱插入或部分缺失等突变导入以外，还可以向启动子区域等调控区域进行同样的突变导入，或向与M基因的表达调控相关联的基因进行同样的突变导入，都能获得同等的效果。并且，作为更有效率的手法，也可以实施以下手法通过利用S0E(spliCingbyoverlapextension)-PCR法[例如，参照Horton，RM.，etal.:Gene,77,pp.61-68(1989)]构建含有_基因的上游、下游区域、但不含腿t基因的直链状的DNA片段，将该DNA片段插入亲本微生物细胞内，在亲本微生物基因组上的M基因外侧的两个位点处发生双交换的同源重组，从而使基因组上的M基因缺失(参照图1)。另外，所选择的宿主细胞，可以是原本具有PGA产生能力的微生物，即使是原来不具有PGA产生能力的微生物也可以。即，可以是在染色体(基因组)上具有DgsBCA基因、且具有PGA产生能力的微生物，或是在染色体上具有prsBCA基因、但不具有PGA产生能力的微生物，以及不具有DgsBCA基因的微牛物中的仵意一种。在具有PGA产生能力的微生物中导入上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因的情况下，PGA产生能力被强化、及/或PGA被高分子量化。另一方面，在不具有PGA产生能力的微生物中导入上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因的情况下，赋予PGA产生能力。作为宿主细胞，也可以使用在染色体(基因组)上所具有的枯草杆菌WpgSBCA基因或与该基因相当的基因上游处，通过导入在微生物中发挥作用的转录起始调控区域及/或翻译起始调控区域等而具有PGA产生能力的微生物。作为在本发明的宿主微生物中发挥作用的转录起始调控区域及/或翻译起始调控区域(下面称为“调控区域”)，优选以适当的形式连接，最优选连接转录起始调控区域及翻译起始区域。所述调控区域，更优选组成性地表达所连接的下游基因，并提高该基因在宿主细胞内的表达。作为这样的调控区域，可以举出芽孢杆菌(Bacillus)属细菌来源的α-淀粉酶基因的调控区域、蛋白酶基因的调控区域、aorE基因的调控区域、sdoVG基因的调控区域、_基因的调控区域、Bacillussp.KSM-S237株的纤维素酶基因的调控区域、Staphylococcusaureus来源的卡那霉素抗件基因的调控区域、氯霉素抗件基因的调控区域等。在DgsBCA基因或与该基因相当的基因的基因组上的上游讲行的所沭调控区域的导入，只要取代枯草杆菌的ηκ^Δ基因或与该基因相当的基因的原本的调控区域中的部分或全部即可。所述调控区域的取代，例如可以采用公知的同源重组的方法(Mol.Gen.Genet.，223，268，1990记载的方法等)进行。例如，首先利用SOE-PCR法(上述)等通常的方法该方法将含有DgsBCA基因的原本的转录起始调控区域的上游区域的DNA片段、以及耐药性基因片段连接在含有所涉及的调控区域的DNA片段上游处另一方面，将含有pgSBCA基因的翻译起始调控区域和结构基因区域的部分或全部、或者PgsBCA基因的结构基因区域的部分或全部的DNA片段连接在下游处。通过如此，可以得到以下DNA片段该DNA片段是按顺序连接含有pgSBCA基因的原本的转录起始调控区域的上游区域的DNA片段，耐药性基因片段，含有上述调控区域的DNA片段，以及含有pgSBCA基因的翻译起始调控区域和结构基因区域的部分或全部、或者PRsBCA基因的结构基因区域的部分或全部的DNA片段而得到的(参照图3)。其次，根据通常的方法将所涉及的DNA片段插入亲本微生物细胞内，在亲本微生物基因组的PgsBCA基因的本来的转录起始调控区域的上游区域、以及PgSBCA基因的翻译起始调控区域和结构基因区域的部分或全部、或者M^SA基因的结构基因区域的部分或全部的区域的两处位置上，发生双交换的同源重组。其结果是，转化体可以采用上述耐药性基因作为指标来分离，其中，该转化体原本的调控区域被上述调控区域取代。由此，被导入到基因组上的PgsBCA基因上游处的调控区域可以保持遗传稳定。另外，本发明所涉及的重组微生物不将参与PGA合成的基因群中的MM基因导入宿主微生物。序列号5表示PgSA基因的碱基序列，序列号6表示被PgSA基因编码的蛋白质的氨基酸序列。虽然启示了被MM基因编码的蛋白质是参与将PGA排出到菌体外的蛋白质(例如，参照非专利文献5)，但是迄今为止其功能尚不明确。另一方面，本发明所涉及的重组微生物，其具有的特征为无论是否导入^sM基因，PGA的产生能力都出色。本发明中的nsM基因并不限定于由序列号5所示的碱基序列构成的基因，而是包括编码以下蛋白质的基因该蛋白质含有在序列号6所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，且被推定为与EK盛和E^—起具有PGA合成活性的蛋白质。在此，多个是指，例如可以为280个，优选为240个，更优选为220个，进一步优选为210个，最优选为25个。另外，本发明中的ηκΜ基因包括，含有相对于序列号5所示的碱基序列具有80%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性的碱基序列，且对被推定为与Eg盛和一起具有PGA合成活性的蛋白质进行编码的基因。在此，碱基序列的遗传一致性的定义与上述相同。并且，在本发明中的基因包括以下基因该基因在严格条件下与序列号5所示的碱基序列的互补链杂交，且对被推定为与Ek巡和￡￡巡一起具有PGA合成活性的蛋白质进行编码。在此，“严格条件下”采用与上述同样的定义。在此，“不将胆M基因导入宿主微生物”是指，不导入对PGA合成过程中发挥作用的EkM蛋白质进行编码的基因。因此，本发明的技术范围中也包括即使导入与序列号5所示的基因具有很高的遗传一致性的基因，但是该基因没有表达的情况，或是由该基因表达所产生的蛋白质在PGA合成过程中不发挥作用的情况。另外，本发明所渉及的重组微牛物，优诜上沭DgsB基因或DgsB同源基因、以及_基因或_同源基因在其上游处连接有在宿主细胞内发挥作用、且表达受正调控的转录起始调控区域、翻译起始调控区域。所述调控区域，更优选使所连接的下游基因表达，并能够提高该基因在宿主细胞内的表达，特别优选使下游基因组成性表达或/及高表达。作为这样的调控区域，可以举出芽孢杆菌(Bacillus)属细菌来源的α-淀粉酶基因的调控区域、蛋白酶基因的调控区域、aprE基因的调控区域、spoVG基因的调控区域、rapA基因的调控区域、Bacillussp.KSM-S237株的纤维素酶基因的调控区域、Staphylococcusaureus来源的卡那霉素抗性基因的调控区域、氯霉素抗性基因的调控区域等，但是没有特别限定。序列号9表示作为上述Bacillussp.KSM-S237株的纤维素酶基因调控区域的、来源于纤维素酶基因的翻译起始点上游0.41.Okb区域的调控区域的碱基序列。另外，所述调控区域并不限定于序列号9所示的碱基序列，例如可以为相对于序列号9所示的碱基序列具有70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性的碱基序列。在此，碱基序列的遗传一致性采用与上述相同的定义。另外，序列号10表示枯草杆菌来源的spoVG基因(BG10112)的上述调控区域的碱基序列。作为上述调控区域并不限定于序列号10所示的碱基序列，例如可以为相对于序列号10所示的碱基序列具有70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性的碱基序列。在此，碱基序列的遗传一致性采用与上述相同的定义。并且，序列号11表示枯草杆菌来源的rapA基因(BG10652)的上述调控区域的碱基序列。另外，所述调控区域并不限定于序列号11所示的碱基序列，例如可以为相对于序列号11所示的碱基序列具有70%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为96%以上、更进一步优选为97%以上、最优选为98%以上、特别优选为99%以上的遗传一致性的碱基序列。在此，碱基序列的遗传一致性采用与上述相同的定义。在将上述M盛基因或M盛同源基因、以及M巡基因或M巡同源基因导入宿主微生物的时候，可以使用通常的质粒(载体)。另外，可以根据基因导入对象的宿主微生物的种类来适当选择质粒。在将枯草杆菌作为宿主的情况下，例如，可以举出PT181、pC194、pUBllO、pE194、pSN2、pHY300PLK等。所选择的质粒，优选在宿主细胞内可以自我复制的质粒，更优选其质粒为多拷贝。并且，其质粒的拷贝数相对于宿主基因组(染色体)为2以上且100拷贝以下即可，优选为2以上且50拷贝以下，更优选为2以上且30拷贝以下即可。另外，在利用表达载体进行转化时，可以应用通常的手法，例如原生质体法[例如，参照Chamg,S.,Cohen,SH.:Mol.Gen.Genet.,168,pp.111-115(1979)]或感受态细胞法[例如，参照Young，FE.，Spizizen,J.J.Bacteriol.，86，pp.392-400(1963)]。通过使用以上已说明的本发明所涉及的重组微生物，能够以出色的产生能力制造PGA0所制造的PGA可以用于化妆品、医药品、食品、水质净化剂、保水材料、增粘剂等各种用途中。特别是在本发明所涉及的重组微生物中，与现有的基因重组技术中的PGA产生法相比较，具有出色的产生能力，因此能够大幅降低在上述用途中利用的PGA的生产成本。特别是，在使用本发明所涉及的重组微生物来制造PGA的时候，首先，在恰当的培养基中培养该重组微生物，从培养基回收产生在菌体外的PGA。作为培养基，可以使用含有下述组分的培养基，下述组分为甘油、葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖和各种有机酸等碳源；各种氨基酸、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵和尿素等氮源；钠盐等无机盐类；以及其他必要的营养源；微量金属盐等。另外，作为培养基可以是合成培养基，也可以是天然培养基。特别是，为了使PGA的产生能力提高，优选使用添加了谷氨酸的培养基，其中谷氨酸的量较作为培养对象的重组微生物生长所必需的谷氨酸的量为过量。具体而言，培养基中优选添加谷氨酸钠，其浓度例如可以为0.005600g/L，优选为0.05500g/L，更优选为0.1400g/L，最优选为0.5300g/L。在培养基中的谷氨酸钠浓度过低的情况下，培养基中的谷氨酸被重组微生物的生长所消耗，会有PGA的产生能力无法提高的担忧。另外，在培养基中的谷氨酸浓度过高的情况下，由于超过谷氨酸钠的饱和溶解度，会有产生谷氨酸钠和其他培养基成分析出的问题的担忧。在回收培养基中积累的PGA的时候，必须除去产生PGA的微生物菌体，进行该操作可以举出凭借离心分离的方法、使用超滤膜的方法、电渗析法、将PH维持在PGA的等电点附近使其沉淀来进行回收的方法等，并且也可以组合使用上述手法。如上操作，从而能够通过利用本发明所涉及的重组微生物来进行PGA的制造。而且，如后述的实施例所示，本发明所涉及的重组微生物表示出1.5g/L以上的高产生能力，与利用现有公知的基因重组技术的产生PGA的微生物相比较，本发明的重组微生物导入了枯草杆菌的M盛基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的M丛基因或与该基因相当的基因，并且，没有导入枯草杆菌的MM基因或与该基因相当的基因，PGA产生能力出色，因而可用于PGA的工业生产。如后述实施例所示，如果在赋予了PGA产生能力的微生物中导入枯草杆菌的prsB基因或与该基因相当的基因、以及DgsC基因或与该基因相当的基因，则能够使PGA高分子化；因而，如果在赋予了PGA产生能力的微生物中导入上述基因，则能够调整PGA的分子量；进而，如果使用所得到的重组微生物，则能够高效地制造具有所希望的分子量的PGA。特别是，在使用prsBCA基因的上游的调控区域连接有上述Bacillussp.KSM-S237株的纤维素酶基因的调控区域的微生物的情况下，能够产生重均分子量约7，000,0007，800,000的高分子PGA；如果在该微生物中导入枯草杆菌的M盛基因或与该基因相当的基因、以及基因或与该基因相当的基因，则能够调整PGA的分子量，使PGA高分子化至优选为110115%。另外，在使用prsBCA基因上游的调控区域连接有上述_基因的调控区域的微生物来作为宿主细胞的情况下，则能够产生重均分子量约590,000600,000的中分子PGA;如果在该微生物中导入枯草杆菌的_基因或与该基因相当的基因、以及μ巡基因或与该基因相当的基因，则能够调整PGA的分子量，使PGA高分子化至优选为1，2001，600%。并目.，通过在不具有PGA产牛能力的微牛物中导入枯草杆菌的DgsB基因或与该基因相当的基因、以及基因或与该基因相当的基因，则能够使L-谷氨酸的含有率优选为80%以上，更优选为90%以上。而且，根据本发明，能够制造光学纯度高的PGA(例如，光学纯度优选为80100%，更优选为90100%)。本发明所涉及的重组微生物，能够适当地产生根据各种用途而分子量有所不同的PGA，而且能够大幅降低用于各种用途的PGA的产生成本，并且由于能够产生光学纯度高的PGA,因而也可用于PGA的工业生产。实施例下面，采用实施例进一步详细说明本发明，但是，本发明的技术范围并不限定于下列实施例。表1中一并示出了本实施例中使用的引物的名称、其序列以及序列号。另外，在表1所示的碱基序列中，下划线的部分表示添加的限制酶识别序列。表1基序列序列号pgsB-FATTTAGGAGGTAATATGATGTGGTTACTCATTATAGCCTG12pgsA-RCGAAGCTTAGATGGCTTTGACAAATTTCATC13pgsC-RCCCAAGCTTGACCTTCGGCGTTTCCGCT14pgsB-RCCCAAGCTTGGCAGCGAATTTTCTGCGTCC15P—S237-FWCAACTAAAGCACCCATTAGGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAG16P—S237-RVCATCATATTACCTCCTAAATATTTTTAAAGTA17ggt-FTCCTTCATGTCTTTCGTATA18ggt/Cm-RCTAATGGGTGCTTTAGTTGGTTCTCCCTCCTATATGAA19ggt/Cm-FCTGCCCCGTTAGTTGAAGATAAAAAACTGTACTCGCTTC20ggt-RTAGCCAATATCACTTTTCATC21<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>〔制造例1〕载体的构建(1)本制造例表示参与PGA合成的基因群的克隆方法(参照图1)。首先，将由Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制备的染色体DNA作为模板，使用表1所示的pgsB-F(序列号12)和pgsA-R(序列号13)的引物对，制备DgsBCA基因2.9kb的DNA片段(A)。另外，序列号47表示Bacillussp.KSM-366株的胆盛基因的碱基序列，序列号48表示上述胆盛基因所编码的蛋白质的氨基酸序列，序列号49表示_基因的碱基序列，序列号50表示上述_基因所编码的蛋白质的氨基酸序列，序列号51表示^kM基因的碱基序列，序列号52表示上述ηκΜ基因所编码的蛋白质的氨基酸序列。另外，使用表1所示的PgsB-F和pgsC-R(序列号14)的引物对，制备胆巡C基因1.7kb的DNA片段(B)。讲而，将由Bacillussp.KSM-S237株(FERMBP-7875)制备的染色体DNA作为模板，使用表1所示的P_S237-FW(序列号16)和P_S237_RV(序列号17)的引物对，制备来自KSM-S237株的纤维素酶基因(参照日本特开2000-210081号公报)启动子区域0.6kb的DNA片段(C)。其次，将所得到的片段㈧和(C)作为模板，使用P_S237-FW和PgsA-R的引物对，按照SOE-PCR法得到含有㈧和(C)片段的3.5kb的DNA片段(AC)。同样地，将片段(B)和(C)作为模板，使用P_S237-FW和pgsC-R的引物对，按照SOE-PCR法得到含有⑶和(C)片段的2.3kb的DNA片段(BC)。分别用限制酶MmHI及一111来对这些DNA片段(AC)和(BC)进行限制酶处理，使用已实施了同样的限制酶处理的质粒载体pHY300PLK(Takara)和DNALigationkitVer.2(Takara)进行连接反应(结合化)。使用上述连接试料，按照感受态细胞法转化大肠杆菌(HB101株)，将在添加有15ppm四环素-盐酸盐(SIGMA-ALDRICH)的LB琼脂培养基(LBTc琼脂培养基)上出现的菌落作为转化体。再使所得到的转化体在LBTc琼脂培养基中生长，采用高纯度质粒分离试剂盒(HighPurePlasmidIsolationKit)(RocheDiagnostics)由所得到的菌体制备重组质粒。用限制酶MmHI及HMIII对这些重组质粒进行限制酶处理，根据电泳法确认在质粒载体上的BamHI及HindIII限制酶识别部位上插入作为目标的上述DNA片段(AC)和(BC)。在本制造例中，将已确认插入了DNA片段(AC)和(BC)的重组质粒分别作为用于产生PGA的重组载体pHY-P_S237/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBC。另外，采用GeneAmp9700(ΡΕAppliedBiosystems)和TaKaRaLATaq(Takara)，按照试剂盒中附加的操作规范来实施PCR反应。〔制造例2〕载体的构建(2)本制造例表示参与PGA合成的基因群的克隆方法(参照图3)。首先，将由BacillussubtilisMarburgNo.168株(枯草杆菌168株)制备的染色体DNA作为模板，使用表1所示的P_spoVGFW2(序列号24)和P_spoVG/CmR(序列号25)的引物对，制备上游侧0.9kb的DNA片段(spoVG-UP)，用于在spoVG基因ORF大约0.6kb上游处插入来源于质粒PC194[例如，参照Horinouchi，S.，Weisblum，B.J.Bacteriol.，150，pp.815-825(1982)]的氯霉素抗性基因(Cmr)。同样地，使用表1所示的P_spoVG/CmF与(序列号26)P_spoVGRV(序列号27)的引物对，制备下游侧0.6kb的DNA片段(spoVG-DW)(此时P_spoVGRV的引物被设计成将spoVG基因ORF的起始密码子gtg改变为atg)。另夕卜，将质粒PC194作为模板，使用表1所示的comp_CmFW(序列号28)和comp_CmRV(序列号29)的引物对，制备氯霉素抗性基因0.9kb的DNA片段(Comp_Cm)。其次，将所得到的片段(spoVG-UP)、(spoVG-DW)和(Comp_Cm)作为模板，使用P_spoVGFW2和P_spoVGRV的引物对，按照SOE-PCR法得到连接上述3种片段而成的2.4kb的DNA片段(Cm-P_spoVG)。并且，使用上述操作得到的DNA片段，根据感受态细胞法(上述)进行枯草杆菌168株的转化，将在已添加IOppm氯霉素(SIGMA-ALDRICH)的LB琼脂培养基(LBCm琼脂培养基)上生长的菌落作为转化体进行分离。其次，将从所得到的转化体提取的基因组DNA作为模板，使用表1所示的Comp_CmFff和P_spoVGRV的引物对，按照PCR法制备由氯霉素抗性基因和spoVG基因启动子区域构成的1.5kb的DNA片段(P-spoVG_Cm2)。并且，使用comp_P_spoVGR/BSpgsBatgFW(序列号30)和pgsCFW(序列号31)的引物对，将从枯草杆菌168株制备的基因组DNA作为模板，按照PCR法制备胆巡基因1.2kb的DNA片段(胆巡1)，使用pgsB/CmF(序列号32)和pgsBRV(序列号33)的引物对，制备胆巡基因ORF上游侧1.Ikb的DNA片段(pgsB-UP)。并且，将所得到的上述(PgsBl)、(P-spoVG-Cm2)以及(pgsB-UP)的3片段作为模板，使用pgsCFff和pgsBRV的引物对，根据SOE-PCR法制备3.6kb的DNA片段。接着，使用上述操作得到的DNA片段，按照感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化，将LBCm琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离(下面，将所得到的重组枯草杆菌作为lCp-P_SpoVG/pgSBCACm株)。将从得到的转化体提取的基因组DNA作为模板，使用PgsC-R和BamHI_PspoVGFW(序列号34)的引物对,制备在枯草杆菌DgsBC基因的上游处具有枯草杆菌sdoVG基因启动子的2.3kb的DNA片段(P_sp0VG/pgsBC)。并且，按照与制造例1同样顺序，将所得到的DNA片段克隆到质粒载体上，将得到的用于产生PGA的重组载体作为pHY-P_spoVG/pgsBC。〔制造例3〕载体的构建(3)本制造例，与制造例2同样地表示参与PGA合成的基因群的克隆方法(参照图3)。将从枯草杆菌168株制备的染色体DNA作为模板，使用表1所示的rapAFW(序列号35)和P_rapA/CmR(序列号36)的引物对，制备上游侧0.5kb的DNA片段(rapA-UP)，用于在_基因ORF大约0.5kb上游处插入来源于质粒pC194的氯霉素抗性基因。同样地，使用表1所示的P_rapA/CmF(序列号37)和P_rapARV(序列号38)的引物对，制备下游侧0.5kb的DNA片段(rapA-DW)(此时P_rapARV的引物被设计成将_基因ORF的起始密码子ttg改变为atg)。其次，将所得到的片段(rapA-UP)、(rapA-DW)以及制造例2中制备的DNA片段(comp_Cm)作为模板，使用rapAFW和P_rapARV的引物对，按照SOE-PCR法得到连接上述3片段而成的1.9kb的DNA片段(Cm-P_rapA)。并且，使用上述操作得到的DNA片段，根据感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化，将LBCm琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离。其次，将从所得到的转化体提取的基因组DNA作为模板，使用表1所示的Comp_CmFW和P_rapARV的引物对，根据PCR制备由氯霉素抗性基因和rapA基因启动子区域构成的1.4kb的DNA片段(P-rapA_Cm2)。另外，使用comp_P_rapAR/BSpgsBatgFff(序列号39)和pgsCFff的引物对，将从枯草杆菌168株制备的基因组DNA作为模板，根据PCR制备μ盛基因1.2kb的DNA片段(pgsB2)。并且，将所得到的上述(pgsB2)、(P-rapA-Cm2)以及制造例2中制备的DNA片段(pgsB-UP)3片段作为模板，使用pgsCFff和pgsBRV的引物对，根据SOE-PCR制备3.5kb的DNA片段。接着，使用按照与制造例2同样的顺序得到的DNA片段，根据感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化(下面，将得到的重组枯草杆菌作为lcp-PjapA/pgaBCAcm株)。从所得到的转化体制备基因组DNA，将该基因组DNA作为模板，使用pgsC-R和BamHI_PrapAFff(序列号40)的引物对，制备在枯草杆菌基因的上游处具有枯草杆菌X^A基因启动子的2.2kb的DNA片段(P_rapA/pgsBC)。并且，按照与制造例1同样的顺序将DNA片段克隆到质粒载体上，将所得到的重组质粒作为用于产生PGA的重组载体pHY-P_rapA/pgSBC。〔制造例4〕载体的构建(4)本制造例，与制造例2同样地表示参与PGA合成的基因群的克隆方法(参照图4)。将制造例1中制备的pHY-P_S237/pgsBCA作为模板，使用表1所示的pgsC-R和tet4_l(序列号41)的引物对，制备质粒上含有四环素抗性基因(Tet1O、且在上游处具有S237纤维素酶启动子序列的DgsB基因DNA片段3.3kb(tet-P_B)。另外，将从枯草杆菌168株制备的染色体DNA作为模板，使用tet4-l_COmp/pgSBFff(序列号42)和pgsBRV的引物对，制备枯草杆菌基因组上的PRsBCA基因的上游1.Okb的DNA片段(pgsB-DWl)。将上述片段(tet_P_B)和(pgsB-DWl)作为模板，使用pgsC-R和pgsBRV的引物对，按照SOE-PCR法连接2片段，得到DNA片段(tet_P_S237)，该DNA片段用于取代枯草杆菌某因纟目卜.的DgsBCA某因橾纵子的卜.游启动子。并且，用所得到的DNA片段(tet-P_S237)按照感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化，将LBTc琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离。另外，从所得到的转化体提取基因组DNA，将其作为模板，根据PCR确认该转化体是在DgsBCA基因操纵子上游导入S237纤维素酶启动子的枯草杆菌突变株(下面作为lcp-P_S237/pgsBCAtet株)。其次，将从Bacillussp.KSM-S237株(FERMBP-7875)制备的染色体DNA作为模板，使用P_S237-RV和P_S237-F的引物对，根据PCR法制备S237纤维素酶启动子区域大约0.6kb的DNA片段(PS237-Cm)。另外，将质粒pC194作为模板，使用P_S237_Comp/CmFff(序列号43)和CmRV(序列号23)的引物对，制备氯霉素抗性基因0.9kb的DNA片段(Cm-PS237)。接着，混合上述DNA片段(PS237-Cm)、(Cm_PS237)以及在后述制造例6中制备的DNA片段(BCA-UP)作为模板，使用P_S237-RV和pgsBRV的引物对，根据SOE-PCR得到3.2kb的DNA片段。使用该得到的DNA片段，根据感受态细胞法对枯草杆菌突变株(lcp-P_S237/PRsBCAtet)进行转化，将LBCm琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离(下面将得到的转化体作为lcp-P_S237/pgsBCAcm株)。其次，将从得到的转化体制备的染色体DNA作为模板，使用pgsC-R和pC194CmRV/HindIIIRV(序列号44)的引物对，制备含有氯霉素抗性基因、且在上游处具有S237纤维素酶启动子序列的M^S基因片段3.4kb。将得到的DNA片段精制、回收后，用限制酶HindIII进行处理，使用进行了同样的限制酶处理的质粒载体PHY300PLK和DNALigationkitVer.2进行连接反应(结合化)。采用上述连接试料，按照原生质体法转化枯草杆菌168株，将已添加了氯霉素5ppm的原生质体再生培养基(DM3培养基)上出现的菌落作为转化体。再使所得到的转化体在LBCm琼脂培养基中生长，采用高纯度质粒分离试剂盒从得到的菌体制备质粒，将所得到的质粒作为用于产生PGA的重组载体pHY-P_S237/pgsBC-Cm。〔制造例5〕枯草杆菌突变体的制作(1)本制造例表示用于导入制造例1中得到的载体的枯草杆菌突变株的制作方法(参照图2)。首先，将从枯草杆菌168株制备的基因组DNA作为模板，使用表1所示的ggt-F(序列号18)和ggt/Cm-R(序列号19)的引物对、以及ggt/Cm_F(序列号20)和ggt_R(序列号21)的引物对，分别制作邻接基因组上的Μ基因上游处的1.Okb的DNA片段(D)和邻接下游处的1.Okb的DNA片段(E)。另一方面，将质粒pC194作为模板，使用表1所示的CmFW(序列号22)和CmRV的引物对，制备含有氯霉素抗性基因的0.9kb的DNA片段(F)。其次，混合所得到的3个DNA片段⑶、(E)和(F)作为模板，使用ggt_F和ggt_R的引物对，按照SOE-PCR法按(D)-(F)-(E)的顺序连接3片段，得到用于基因缺失的2.9kb的DNA片段。其次，用该DNA片段，根据感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化，将LBCm琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离。并且，从所得到的转化体提取基因组DNA，将其作为模板，根据PCR确认该转化体是基因的结构基因(ORF)被氯霉素抗性基因(片段F)取代的目标枯草杆菌突变株(下面作为△ggt株)。〔制造例6〕枯草杆菌突变株的制作(2)本制造例表示用于导入制造例1中得到的载体的枯草杆菌突变株的制作方法(参照图2)。首先，将从枯草杆菌168株制备的基因组DNA作为模板，分别使用表1所示的pgsAFW(序列号45)和pgsA/CmR(序列号46)的弓I物对，制作与基因组上的PgsBCA基因下游处邻接的1.Okb的DNA片段(BCA-UP)，进而使用pgsB/CmF和pgsBRV的引物对，制作与基因组上的PrsBCA基因上游处邻接的1.Okb的DNA片段(BCA-DW2)。其次，混合所得到的DNA片段(BCA-UP)、(BCA-DW2)以及制造例5中制备的DNA片段(F)作为模板，使用pgsAFff和pgsBRV的引物对，按照S0E-PCR按(BCA-UP)-(F)-(BCA-DW2)的顺序连接3片段，得到用于基因缺失的2.9kb的DNA片段。其次，使用该基因缺失用DNA片段，根据感受态细胞法进行枯草杆菌168株的转化，将LBCm琼脂培养基上生长的菌落作为转化体进行分离。并且，从所得到的转化体提取基因组DNAJf其作为模板，根据PCR确认该转化体是prsBCA基因操纵子被氯霉素抗件基因(片段F)取代的目标枯草杆菌突变株(下面作为ABCA株)。〔制造例7〕导入质粒进行的转化本制造例表示成为宿主的枯草杆菌株及其突变株、其他芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的转化法。针对枯草杆菌(BacillussubtilisMarburgNo.168株、NCIMBl1623株及IF03215株)、制造例5中制造的枯草杆菌突变株(Aggt株)、制造例6中制造的枯草杆菌突变株(ABCA株)、制造例4中制造的lcp-P_S237/pgsBCAcm株以及制造例3中制造的lcp_P_rapA/pRsBCAcm株、以及BacillusmeRateriumATCC14581株及WH320株，采用制造例1、2禾口3中得到的用于产生PGA的重组载体(pHY-P_S237/pgsBCA、pHY_P_S237/pgsBC、pHY_P_spoVG/pgsBC及pHY-P_rapA/pgsBC、以及调控载体(pHY300PLK)，进行转化。对于从上述野生株及突变体通过溶菌酶处理制备而成原生质体IO5IO6个，提供上述质粒DNA20IOOng,从而进行质粒导入。选出在添加有四环素_盐酸盐20ppm的DM3原生质体再生培养基(DM3培养基)上生长的菌落作为导入了质粒的目标枯草杆菌转化体。在BacilluslicheniformisATCC9945a株中，使用制造例4中得到的用于产生PGA的重组载体(pHY-P_S237/pgsBC-Cm)进行转化，使用添加了15ppm氯霉素的DM3原生质体再生培养基(DM3培养基)，选出在再生培养基上生长的菌落作为导入了质粒的目标转化体。〔实施例1〕产生能力评价(1)将制造例7中制备的在枯草杆菌168株中导入pHY-P_S237/pgsBCA或pHY_P_S237/pgsBC而得到的转化体分别接种到LBTc琼脂培养基上，在30°C下静置培养一晚之后，将该LBTc琼脂培养基上生长的枯草杆菌转化体在已预先杀菌的2.OmL的微量离心管内，在可有0.81.6mL改变的2xL/麦芽糖培养基(triptone2.O%、酵母提取物1.0%、氯化钠1.0%、麦芽糖7.5%、7.5ppm硫酸锰4_5水合物、15ppm四环素-盐酸盐)中进行搅拌/悬浮，静置之后将上清液作为种培养液。将该种培养液以(ν/ν)接种到新的可变2xL/麦芽糖培养基中，在Sakaguchi烧瓶中，在37°C、120rpm下往复振荡培养3天(TB-20R-3F，高崎科学机器)。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表2所示，与作为对照的导入了PgsBCA基因的菌株相比较，导入了pgSBC基因的菌株具有更高的PGA产生能力。〔实施例2〕产生能力评价(2)将制造例7中制备的在枯草杆菌168株中导入pHY-P_S237/pgsBCA或pHY_P_S237/pgsBC而得到的转化体分别接种到LBTc琼脂培养基上，在30°C下静置培养一晚之后，在可变的2xL/麦芽糖+MSG培养基(triptone2.0%、酵母提取物1.0%、氯化钠1.0%、麦芽糖7.5%、8.0%谷氨酸钠一水合物、7.5ppm硫酸锰4_5水合物、15ppm四环素-盐酸盐)进行搅拌/悬浮，静置之后将上清液作为种培养液。将该种培养液以(ν/ν)接种到新的可变2xL/麦芽糖+MSG培养基中，在Sakaguchi烧瓶中，在37°C、120rpm下往复振荡培养3天(TB-20R-3F,高崎科学机器)。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如表3所示，可知在培养基中含有过量的谷氨酸的情况下，PGA的产生能力尤其得到提高。并且，可知在培养基中含有过量的谷氨酸的情况下，即使从培养开始3日后PGA的产生能力也不降低，表现出较高的值。〔实施例3〕产生能力评价(3)对制造例7中制备的在枯草杆菌168株以及制造例5中制造的枯草杆菌突变株(ΔΜ株)中导入DHY-PS237/prsBC而得到的转化体，采用与实施例1同样的顺序进行PGA产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表4所示，可知在将Aggt株作为宿主的情况下，与将作为野生株的枯草杆菌168株作为宿主的情况相比较，其PGA产生能力出色，且即使从培养开始3日后也能够维持较高的产生能力。〔实施例4〕产生能力评价(4)对制造例7中制备的在枯草杆菌168株以及制造例6中制造的枯草杆菌突变株株)中导入pHY-P_S237/pgsBC得到的转化体，采用与实施例1同样的顺序进行PGA产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表5所示，不但是在枯草杆菌168株中，而且在ABCA株中都能获得较高的PGA产生能力，其中，枯草杆菌168株不具有PGA产生能力，但在染色体上具有prsBCA基因，而ΔBCA株缺失了pgsBCA基因。〔实施例5〕产生能力评价(5)对制造例7中制备的在枯草杆菌168株中导入pHY-P_S237/pgsBC、pHY-P_spoVG/pgsBC、或pHY-P_rapA/pgSBC而得到的转化体，采用与实施例2同样的顺序进行PGA产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表6所示，不仅通过使用S237纤维素酶启动子，而且通过使用枯草杆菌来源的sdoVG基因和_基因启动子，导入了具有PRsBC基因的用于产生PGA的重组载体的枯草杆菌转化体也能获得较高的PGA产生能力。〔实施例6〕产生能力评价(6)对制造例7中制备的在枯草杆菌(NCIMB11623株及IF03215株)中导入pHY_P_S237/pgsBC而得到的转化体，采用与实施例2同样的顺序进行PGA产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表7所示，可知不仅是在枯草杆菌168株中，而且在其他的枯草杆菌中导入只具有prsBC基因的用于PGA产生的重组载体，也能够产生PGA。〔实施例7〕产生能力评价(7)对制造例7中制备的在BacilluslicheniformisATCC9945a株中导入了pHY_P_S237/PRsBC-Cm而得到的转化体，采用与实施例2同样的顺序进行PGA重组产生能力评价(所使用的抗生素从15ppm四环素变更为5ppm氯霉素)。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表8所示，可知不仅是在枯草杆菌中，而且在其他的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌中导入具有胆迴基因的用于PGA产生的重组载体，PGA的产生能力也得到提高。〔实施例8〕产生能力评价(8)分别对制造例7中制备的在BacillusmegateriumATCC14581株中导入了pHY_P_spoVG/pgsBC而得到的转化体、以及制造例7中制备的在BacillusmegateriumWH320株中导入了pHY-P_S237/pgsBC而得到的转化体，采用与实施例2同样的顺序进行PGA重组产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量，评价结果如表9所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表9所示，可知不仅是在枯草杆菌中，而且在其他的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌中导入只具有胆迴基因的用于PGA产生的重组载体，PGA产生能力得到提高。〔实施例9〕产生能力评价(9)(分子量评价)对制造例7中制备的、在制造例3及4所制造的lCp-P_rapA/pgSBCACm株以及lcp-P_S237/pgsBCAcm株中导入了pHY_P_S237/pgsBC而得到的转化体，采用与实施例2同样的顺序进行PGA重组产生能力评价。评价培养结束后，在下面测定例所示的分析条件下测定PGA产生量及分子量，评价结果如表10及11表示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表10所示，确认在产牛PGA的枯草杆菌突变体中导入R具有DgsBC基因的用于PGA产生的重组载体，与基因导入前相比较，其PGA产生能力得到提高。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表11所示，确认在产生PGA的枯草杆菌突变体中导入R具有DgsBC基因的用于PGA产生的重组载体，与基因导入前相比较，其所产生的PGA得到高分子量化。〔测定例〕PGA的定量及分子量测定法将实施例19所示的评价培养结束后的培养液试料，在室温下以14，SOOrpm进行离心分离(商品名称himacCF15RX，日立工机)30分钟，对离心分离所得到的培养液的上清液中的重组PGA产生量进行测定。上清液试料中的PGA检出按照Yamaguchi等人的方法(上述)，将试料供给琼脂糖凝胶电泳之后，进行亚甲基蓝的凝胶染色，根据有无来源于PGA的染色物质来确认重组PGA的产生。并且，对于已检出重组PGA的试料，采用TSKGelG4000PWXL以及TSKGe1G6000PWXL凝胶过滤色谱柱(商品名称，Tosoh)实施HPLC分析。另夕卜，分析条件如下洗提液使用0.IM硫酸钠，流速为1.OmL/分钟，株温为50°C，UV检测波长为210nm。另外，使用分子量80万的PGA(MeijiFoodMateria)制作标准曲线进行浓度测定。并且，分子量测定采用已使用普鲁蓝(ShodexSTANDRDP_82，商品名称，昭和电工)预先求出了重均分子量的各种分子量不相同的聚谷氨酸[和光纯药工业(162-21411，162-21401)、SIGMA-ALDRICH(P-4886，P-4761)、MeijiFoodMateria(分子量88万)]。另夕卜，表示评价结果的表中的表示PGA产生能力的数值单位是(g/L)。另外，表示评价结果的表中的记号“ND”表示低于检测限。〔实施例10〕产生能力评价(10)(PGA组成的光学纯度测定)将从在实施例2中导入了pHY-P_S237/pgsBCA的枯草杆菌168株转化体所得到的培养液、以及从在实施例4中导入了pHY-P_S237/pgsBC的枯草杆菌突变株(ABCA株)转化体所得到的培养液作为试料来使用。在培养液的上清液中添加等量的乙醇，离心分离回收生成的沉淀。接着，干燥所回收的沉淀生成物，在其中加入6N盐酸进行氮封，在115120°C下进行加热处理24小时。加热处理后，在氮气气流下蒸馏除去盐酸和水分，作为水解试料进行回收。接着，采用全自动氨基酸分析计L-8500(商品名称，日立计测机器)以及L-谷氨酸测定试剂盒(Yamasa酱油)，进行上述水解物试料的氨基酸组成和L-谷氨酸的定量分析。另外，根据全自动氨基酸分析计分析得到旋光异构体(D-异构体及L-异构体)的总量作为定量结果，从总量中减去根据L-异构体测定试剂盒得到的定量结果，差值作为D-异构体的量。另外，将从Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制备的PGA作为Bacillus属细菌的野生株所产生的PGA标准品，用于上述分析。并且，为了评价水解反应中的氨基酸的外消旋率，使用D-谷氨酸及L-谷氨酸(和光纯药工业)作为标准品。其结果如表12所不。表12^tMM谷氨酸组成比_料寺_D-异构体L-异构体已导入pHY-P_S237/pgsBCA的168株的培养液~~的上清液_____I_己导入pHY-P_S237/pgsBC的ABCA株的培养液的上清液____Bacillussp.KSM-366株产生的PGA__79__21谷氨酸(试剂用于评价外消旋率)793)-谷氨酸(试剂用于评价外消旋率)I91I9如表12所示，确认导入R具有DgsBC基因的用于PGA产牛的重组载体而成的重组枯草杆菌所产生的PGA是具有L-谷氨酸的含量为90%以上的纯度的光学纯度高的PGA。而且，由于在同时讨论的水解处理条件下的氨基酸的外消旋率约为10%，因此，可以推定从R导入了DgsBC基因的重组枯草杆菌所得到的PGA的光学纯度为80100%。〔参考例〕与制造例1同样将从Bacillussp.KSM-366株(FERMBP-6262)制备的染色体DNA作为模板，使用表1所示的PgsB-F和pgsB-R(序列号15)的引物对，制备胆巡基因1.2kb的DNA片段(G)。将该片段和KSM-S237株来源的纤维素酶基因启动子区域的DNA片段(C)作为模板，使用P_S237-FW和pgsB-R的引物对，按照SOE-PCR法得到具有(G)和(C)片段的1.8kb的DNA片段(GC)。下面，根据与制造例1所示相同的实验方法，将已确认在质粒载体pHY300PLK(Takara)的MlHI及HindIII限制酶识别部位上插入了上述DNA片段(GC)的重组质粒，作为用于产生PGA的重组载体pHY-P_S237/pgsB。在使用PGA合成基因导入前的DHY300PLK、以及上沭DgsB基因单独表汰的质粒(pHY-P_S237/pgsB)，对实施例1及2所示的PGA产生能力进行评价的时候可以确认，在任意的实验条件下都没有PGA生成。产业上的可利用性本发明的重组微生物具有聚-Y-谷氨酸产生能力。因此，本发明的重组微生物能够适用于聚_Y_谷氨酸的制造。另外，通过使用本发明的重组微生物，能够制造具有希望的分子量以及结构的聚_Y_谷氨酸。因此，本发明的重组微生物能够适用于聚_Y_谷氨酸的产生能力的提高、分子量的调整方法、以及光学纯度的调整方法。尽管将本发明与其实施方式一起进行了说明，但是，除非另有规定，本发明并不限于说明书中的任何细节，而且，在不违反所附的权利要求所示的发明的宗旨和范围内，应作宽泛的解释。本发明基于2007年9月20日在日本进行专利申请的特愿2007-244023要求优先权，在此引入其内容作为本说明书所记载的一部分进行参考。权利要求一种具有聚-γ-谷氨酸产生能力的重组微生物，其特征在于，将参与聚-γ-谷氨酸合成的基因群中的枯草杆菌的pgsB基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的pgsC基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物，且，不将枯草杆菌的pgsA基因或与该基因相当的基因导入所述宿主微生物。2.根据权利要求ι所述的重组微生物，其特征在于，所述_基因为编码下列(a)或(b)的蛋白质的基因(a)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(b)含有在序列号2所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且具有酰胺连接酶活性的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，所述_基因为编码下列(c)或⑷的蛋白质的基因(c)含有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质；(d)含有在序列号4所示的氨基酸序列中使1个或多个氨基酸缺失、取代、添加或插入而得到的氨基酸序列，并且，具有在所述盛基因所编码的PgsB蛋白质的存在下生成聚-Y-谷氨酸的功能的蛋白质。4.根据权利要求13中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述巡基因或与该基因相当的基因、以及所述_基因或与该基因相当的基因被重组入在所述微生物的宿主细胞内能够自我复制的质粒(载体)中。5.根据权利要求14中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述M盛基因或与该基因相当的基因、以及所述M丛基因或与该基因相当的基因在其上游处具有在微生物中发挥作用的转录起始调控区域及/或翻译起始调控区域。6.根据权利要求15中任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述宿主微生物为芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述芽孢杆菌(Bacillus)属细菌为枯草杆菌(Bacillussubtilis)。8.—种聚-Y-谷氨酸的制造方法，其特征在于，培养权利要求17中任一项所述的重组微生物，从而获得所生成的聚_Y_谷氨酸。9.一种聚-Y-谷氨酸的产生能力提高方法，其特征在于，将参与聚-Y-谷氨酸合成的基因群中的枯草杆菌的DgsB基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的M丛基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来使聚_Y_谷氨酸的产生能力提高。10.根据权利要求9所述的聚-Y-谷氨酸的产生能力提高方法，其特征在于，所述重组微生物为权利要求17中任一项所述的重组微生物。11.一种聚-Y-谷氨酸的分子量调整方法，其特征在于，将参与聚_Y_谷氨酸合成的基因群中的枯草杆菌的M盛基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的M巡基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来调整聚_Y_谷氨酸的分子量。12.根据权利要求11所述的聚_Y_谷氨酸的分子量调整方法，其特征在于，所述重组微生物为权利要求17中任一项所述的重组微生物。13.一种高分子量聚_Y_谷氨酸的制造方法，其特征在于，采用权利要求11或12所述的聚-Y-谷氨酸的分子量调整方法。14.一种聚-γ-谷氨酸的光学纯度调整方法，其特征在于，在使用微生物来产生聚_Y_谷氨酸时，将参与聚_Y_谷氨酸合成的基因群中的枯草杆菌的pgsB基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的pgsC基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物来得到重组微生物，使用该重组微生物来调整聚-Y-谷氨酸的L-异构体的比率。15.根据权利要求14所述的聚-Y-谷氨酸的光学纯度调整方法，其特征在于，所述重组微生物为权利要求17中任一项所述的重组微生物。16.一种L-异构体的比率高的聚_Y_谷氨酸的制造方法，其特征在于，采用权利要求14或15所述的聚-Y-谷氨酸的光学纯度调整方法。17.一种权利要求17中任一项所述的重组微生物的使用。全文摘要本发明涉及具有聚-γ-谷氨酸产生能力的重组微生物，以及使用所述重组微生物的聚-γ-谷氨酸的制造方法。其中，将参与聚-γ-谷氨酸合成的基因群中的枯草杆菌的pgsB基因或与该基因相当的基因、以及枯草杆菌的pgsC基因或与该基因相当的基因导入宿主微生物，且不将枯草杆菌的pgsA基因或与该基因相当的基因导入所述宿主微生物。文档编号C12N1/21GK101802169SQ20088010749公开日2010年8月11日申请日期2008年9月19日优先权日2007年9月20日发明者泽田和久,萩原浩申请人:花王株式会社