指导玉米胚珠和授粉籽粒的母体和支持组织中转基因表达的植物调节区的制作方法

专利名称：指导玉米胚珠和授粉籽粒的母体和支持组织中转基因表达的植物调节区的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体来说涉及植物中基因表达的调节。
背景技术：
植物宿主中异源DNA序列的表达依赖于可操作性连接的调节元件的存在，这 些元件在植物宿主内是具有功能的。启动子序列的选择将决定生物内异源DNA序列 何时与何处进行表达。当需要在特定组织或器官中表达时，可以使用组织优选启动子 (tissue-preferred promoter)。当需要应答刺激物进行基因表达时，可诱导性启动子可选 作调节元件。相反，当需要持续表达遍及植物细胞时，可使用组成型启动子。中心启动子序 列上游和/或下游的附加调节序列可以包括于转化载体的表达构建体中，使转基因植物中 异源核苷酸序列的表达水平发生变化。经常需要在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，增加植物对土壤和空 气传播的病原体感染的抵抗力，可以通过植物基因组的遗传操作来完成，使该基因组包含 可操作性连接于异源病原体抵抗性基因的组织优选启动子，从而使病原体抵抗性蛋白可以 在期望的植物组织中生产。可选地，需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达，来实现所需 要的表型。在此情况下，此抑制可以通过植物转化来完成，使该植物包含可操作性连接于反 义核苷酸序列的组织优选启动子，从而使该反义序列表达产生RNA转录物，该RNA转录物可 以干扰天然DNA序列的mRNA的翻译。另外，需要在处于特定生长或发育阶段的植物组织中表达DNA序列，该阶段为例 如细胞分裂或延长。此类DNA序列可以用于促进或抑制植物生长进程，从而影响生长速度 或植物结构。需要分离与表征再生组织优选(r印roductive-tissue-preferred)启动子，特别 是的未成熟的穗优选(immature-ear-preferred)启动子，用于影响植物中的各种特性以 及可评价标记的使用中，该启动子可以作为以再生组织优选方式表达分离的目的核苷酸序 列的调节元件。发明概述本发明提供了用于调节植物中基因表达的组合物与方法。该组合物包含用于再生 组织优选启动子的新的核苷酸序列。具体来说，提供了肌动蛋白解聚因子4基因的转录起 始区。本发明的其他实施方案包含SEQID NO 1中给出的核苷酸序列与SEQ ID NO 1中给 出的核苷酸序列的片段。也包括SEQ ID NO :1中给出的序列的功能性片段，其促进可操作 性连接的核苷酸序列的再生组织优选表达。本发明的实施方案也包括DNA构建体，该构建体包含可操作性连接于目的异源核 苷酸序列的启动子，其中所述启动子能够促进所述核苷酸序列在植物细胞中的表达并且所 述启动子包含本文所公开的核苷酸序列中的一个。本发明的实施方案还提供了表达载体与 植物或植物细胞，该植物或植物细胞具有稳固地并入其基因组的上文提及的DNA构建体。 另外，该组合物包括这些植物的转基因种子。
其他的实施方案包含在植物中选择性表达核苷酸序列的方法，其包括用DNA构建 体转化植物细胞，和由所述植物细胞再生转化的植物，所述DNA构建体包含启动子与异源 核苷酸序列，该序列可操作性连接于所述启动子，其中所述启动子启动植物细胞中的所述 核苷酸序列的未成熟的穗优选转录。以此方式，启动子序列可用于以优选组织或可诱导方 式控制可操作性连接的编码序列的表达。启动子的转录起始调节的下游可以是目的序列，该序列可提供植物表型的修饰。 此类修饰包括调节内源产物的产生，如其数量、相对分布等，或者外源表达产物的产生，以 便在植物中提供新的功能或产物。例如，包含编码基因产物的异源核苷酸序列，该基因产物 赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体、线虫类或昆虫的抗性或耐性。在另一个具体方案中，提供了调节稳固转化的植物中基因表达的方法，包括步骤 (a)用DNA构建体转化植物细胞，该DNA构建体包含具体方案的启动子，该启动子可操作性 连接于至少一个核苷酸序列；(b)在植物生长的条件下使植物细胞生长；以及(C)由植物细 胞再生稳固转化的植物，其中核苷酸序列的表达改变了植物的表型。


图1显示了 LYNX 大量平行信号测序数据的概要，该数据展示了玉米(zea mays) 中ADF4的表达。图2显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在TO转基因植物中表达时⑶S可评 价标记的转基因表达的照片。图3显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在TO转基因植物中表达时DS-RED 可评价标记的转基因表达的照片。图4A-4H显示了当可操作性连接于ADF4启动子并在Tl转基因植物中表达时 DS-RED与GUS可评价标记的转基因表达的照片。为了进行比较，将来自对照植物的组织显 示于4A中每个面板的右侧；4B中最后两个面板的右侧；如4C中所标记；在4D中较低的穗 与上部的花粉囊中；在4E中较低的穗或右侧的穗横截面中；以及如4F中所示。图5为ADF4启动子(SEQ ID NO 4)的300个碱基对区，通过与如表1_3与实施 例4所述的来自高粱与水稻的直系同源基因(orthologousgenes)的比较，显示了基序的定 位。所提供的彩色照片，⑶S表达显示为蓝色，而DS-RED为红色。所提供的黑白照片， 表达⑶S的组织则比对照或未表达组织更黑。发明详述本发明涉及用于植物启动子的组合物与方法以及它们的应用方法。该组合物包 含肌动蛋白解聚因子(ADF)基因的再生组织优选、优选未成熟的穗优选启动子区的苷酸序 列，更特别地，ADF4启动子。该组合物还包含DNA构建体，该构建体包含核肌动蛋白解聚因 子4(ADF4)基因启动子区的核苷酸序列，所述启动子区可操作性连接于目的异源核苷酸序 列。特别是，本发明提供了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO :1中给出的核苷酸序列，和 其片段、变体以及补体。本发明的ADF4启动子序列包括允许植物中起始转录的核苷酸构建体。在具体实 施方案中，ADF4启动子序列允许以组织优选更特别是穗优选方式起始转录。本发明的此类构建体包含与植物发育调节相关的调节转录起始区。因而，本发明的组合物包括DNA构建 体，该构建体包含可操作性连接于植物启动子的目的核苷酸序列，尤其是ADF4基因的再生 组织优选启动子序列，更特别是玉米ADF4启动子序列。包含玉米启动子区的序列于SEQ ID NO 1中给出。SEQ ID NO 1的特征包括以下位点7-1026所示的ZmADF4上游调节区。ZmADF4的 未翻译前导区显示于位点1027-1147。ZmADF4的第一个内含子显示于位点1151-1319。第 一个ATG是紧接于5’剪接位点之前。内含子可以增强表达；参见例如，Mim，et al. , (2002) Gene292(l-2) :233_243。ZmADF4编码序列的一部分显示于位点1338-1385。此特性可以促 进产生与启动子的翻译融合物。本发明的组合物包括天然ADF4启动子的核苷酸序列及其片段和变体。本发明的 启动子序列可用于表达序列。在具体实施方案中，本发明的启动子序列可用于以再生组织 优选，特别是穗优选方式，表达目的序列。本发明的核苷酸序列也可用于构建表达载体的， 用于在目的植物中随后表达异源核苷酸序列，或者作为探针用于分离其他类似ADF4的启 动子。特别是，本发明提供了分离的DNA构建体，该构建体包含在SEQID NO 1中给出的ADF4 启动子核苷酸序列，该序列可操作性连接于目的核苷酸序列。本发明包含分离的或充分纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或 其生物活性部分当通过重组技术生产时不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基 本上不含化学前体或其他化学物质。“分离的”核酸是不含这样的序列(包括蛋白质编码序 列)，该序列天然地位于生物基因组DNA中核酸(即，位于核酸的5’与3’端的序列)的侧 翼，该核酸来源于该生物。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子可以含有小于约5kb、 4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然地位于细胞基因组DNA 中核酸分子的侧翼，该核酸来源于该细胞。本发明的ADF4启动子序列可以分离自5’未翻 译区的，该未翻译区位于它们各自转录起始位点的侧翼。已公开的启动子核苷酸序列的片段与变体也包含于本发明中。特别是，SEQ ID NO 1的ADF4启动子序列的片段与变体可以用于本发明的DNA构建体中。如本文所用，术 语“片段”是指核酸序列的一部分。ADF4启动子序列的片段可以保留起始转录的生物活性， 更特别是，以再生组织优选方式促进转录。可选地，可用作杂交探针的核苷酸序列的片段可 以不需要保留生物活性。ADF4基因启动子区的核苷酸序列的片段的变化范围可以是基因启 动子区的至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，至多本发明的全长核苷酸 序列。ADF4启动子的生物活性部分可以通过分离一部分本发明的ADF4启动子序列的与 评定该部分的启动子活性而制备。作为ADF4启动子核苷酸序列片段的核酸分子包含至少 约 16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、 1100、1200、1300个核苷酸，或至多存在于本文所公开的全长ADF4启动子序列中的核苷酸 的总数。本文所用的术语“变体”是指与本文所公开的启动子序列具有实质相似性的序列。 变体包含天然多核苷酸内一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或增加， 和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。本文所用的“天 然的”核苷酸序列包含天然存在的核苷酸序列。对于核苷酸序列而言，天然存在的变体可以
6通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如，使用本文略述的聚合酶链反应(PCR)与杂 交技术。变体核苷酸序列也包括合成获得的核苷酸序列，诸如通过例如使用定点诱变所产 生的序列。通常，当通过本文别处所述的序列比对程序使用默认参数进行测定时，实施方 案的具体核苷酸序列的变体可以该具体核苷酸序列具有至少40 %、50 %、60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%，至95%、96%、97%、98%、99%或更多的序 列同一性。生物活性变体也包括于实施方案中。生物活性变体包括，例如，具有一个或多个 核苷酸取代、缺失或插入的实施方案的天然启动子序列。启动子活性可以通过使用以下技 术测量，例如RNA印迹分析法(Northern blot analysis)，由转录融合获得的报道子活性测 量等。参见例如，Sambrook, et al. , (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分 子克隆实验室手册)(2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor，N. Y.)，在下文中称为〃 Sambrook"，在此通过引用将其全文并入。可选地，可以测 量报道子基因的水平，如在启动子片段或变体的控制下产生的绿色荧光蛋白(GFP)或类似 物。参见例如，美国专利6，072，050，在此通过引用将其全文并入。变体核苷酸序列也包括源自诱变与重组方法例如DNA改组的序列。通过这类方 法，可以操作启动子的一个或多个不同的ADF4核苷酸序列来产生新的ADF4启动子。以 此方式，可以由包含序列区的相关序列多核苷酸的群体来产生重组多核苷酸库，该序列区 具有序列实质同一性并可以在体外或体内被同源重组。用于此类DNA改组的策略在本 领域是已知的。参见，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 10747-10751 ； Stemmer (1994)Nature 370 389391 ；Crameri, et al. , (1997)Nature Biotech. 15 436-438 ；Moore, et al.，(1997)J. Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang, et al.，(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :4504_4509 ；Crameri, et al.，(1998)Nature 391 :288_291 ；以及 美国专利5，605，793号与5，837，458，在此通过引用将其全文并入。用于诱变和核苷酸序列改造的方法是本领域已知的。见于，例如Kimkel (1985) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel，et al. ， (1987)Methods in Enzymo1. 154 367-382 ；美国专利 4，873，192 号；Walker andGaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company,New York)以及 其中所引用的参考文献，在此通过引用将其全文并入。本发明的核苷酸序列可以用于从其他生物，尤其是其他植物，更尤其是其他单子 叶植物中分离相应序列。以此方式，基于其与本文所给出的序列的序列同一性，可以使用诸 如PCR、杂交等方法鉴定此类序列。基于其与本文所给出的整个ADF4序列或其片段的序列 同一性而分离的序列也包括于本发明中。在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应从cDNA或基因组DNA扩增相 应的DNA序列，该cDNA或基因组DNA由任何目的植物提取而来。设计PCR引物与PCR克 隆的方法是本领域普遍已知的并公开于，Sambrook同上中。也请参见Innis，et al.，eds. (1990)PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications (PCR实验方案方法和应用 指南)(Academic Press, New York) ；Innis and Gelfand, eds. (1995) PCRStrategies (PCR M^) (Academic Press, New York) -MR Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (PCR方法手册)(Academic Press, NewYork)，在此通过引用将其全文并入。已知的PCR方法，包括但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引 物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。在杂交技术中，用所有或部分的已知核苷酸序列均作为探针，该探针可与其他相 应的核苷酸序列选择性杂交，这些序列存在于来自所选生物的克隆的基因组DNA片段或 cDNA片段群体(即，基因组或cDNA文库)中。该杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA 片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可探测基团例如32P或任何其他可探测标记物 标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本发明ADF4启动子序列的合成的 寡核苷酸来获得。制备用于杂交与基因组库构建的探针的方法是本领域已知的并公开于 Sambrook同上中。例如，本文所公开的整个ADF4启动子序列，或其一个或多个部分，可以用作能与 相应的ADF4启动子序列以及信使RNA进行特异性杂交的探针。为了在各种条件下完成特 异性杂交，此类探针包括ADF4启动子序列中独特的序列并长度通常为至少约10个核苷酸 或至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过PCR从所选植物扩增相应的ADF4启动子 序列。此技术可以被用于从所期望的生物中分离其他的编码序列，或作为诊断分析来测定 生物中编码序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库的杂交筛选(斑点或菌落，参见例如 Sambrook,同上)0此类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”是 指使探针与其目标序列杂交的可检测程度比其与其他序列更高(例如，至少比背景高2倍) 的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中是不同的。通过控制杂交和/或洗脱 条件的严格性，100%互补于探针的目标序列可以被识别(同源探测)。可选地，可以调整严 格条件来允许序列中的一些错配，以便可以探测更低程度的相似性(异源探测)。通常，探 针的长度少于约1000个核苷酸，优选长度少于约500个核苷酸。通常，严格条件是如下条件，即在该条件中，在pH7. 0-8. 3下，盐浓度低于约1. 5M 钠离子，通常低于约0.01-1. OM钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10-50个 核苷酸)温度为至少约30°C，而对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60°C。 严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来完成。示例性的低严格条件包括在37°C以 30%-35%甲酰胺、IM NaCl、l % SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行杂交，并且在50_55°C 以1倍至2倍SSC (20倍SSC = 3. OM NaCl/0. 3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中度严格 条件包括在37 °C以40 % -45 %甲酰胺、IM NaClU % SDS的缓冲液进行杂交，并且最后在 50-55°C在0. 5-1倍SSC中至少持续洗涤。示例性的高严格条件包括在37°C以50%甲酰胺、 IM NaClU % SDS的缓冲液进行杂交，并且最后在60_65°C下在0. 1倍SSC洗涤持续至少30 分钟。杂交持续时间通常少于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤的持续时间可以是 至少足以达到平衡的时间长度。特异性通常是杂交后洗涤的功能，关键因素是最后洗脱液的离子强度和温度。对 于 DNA-DNA 杂交而言，热熔点(Tm)可以由 Meinkoth andffahl, (1984) Anal. Biochem 138 267284 =Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC)-0. 61(% form)-500/L 等式大致计算出 来；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是杂交液中甲酰胺的百分比，L是碱基对的杂交长度。Tm值是50%的互补性目标序列 与完美配对的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和PH值下)。每错配1%，Tm值就会降低约1°C，因此，可以调整、值、杂交和/或洗涤条件来与所需同一性的序列杂交。例如， 如果要求90%同一性的序列，那么Tm值可以降低10°C。通常，对于特殊的序列及其互补体 而言，在限定的离子强度和PH值下，选择比Tm值约低5°C的严格条件。然而，高度严格的 条件可以在比Tm值低1、2、3或4°C的温度下进行杂交和/或洗涤；中度严格的条件可以在 比Tm值低6、7、8、9或10°C的温度下进行杂交和/或洗涤；低严格的条件可以在比Tm值低 6、7、8、9或10°C的温度下进行杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗脱组合物以及所需 的Tm值，本领域普通技术人员可以理解杂交和/或洗涤液的严格性上的变化是本质上被描 述了的。如果所需的错配程度导致Tm值低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，那么 就优选提高SSC浓度从而可以使用更高的温度。核酸杂交的详尽指导见于TijSSen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes (生物化学和分子生物学实验技术-用核酸探针杂交)，Part I， Chapter 2(Elsevier, New York)禾口 Ausubel, et al. , eds. (1995)Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，Chapter 2 (Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)中，在此通过引用将其全文并入。同样参见Sambrook。因此，本发明包含分离的序列，该序列具有再生组织优选启动子活性，尤其是未成 熟的穗优选启动子活性，并且其在严格条件下与本文所公开的ADF4启动子序列或其片段 杂交。一般而言，具有启动子活性并且与本文所公开的启动子序列杂交的序列，与公开 的序列有至少40 % -50 %的同源性，约60 %、70 %、80 %、85 %、90 %、95 %至98 %或更高的 同源性。即，序列的序列相似性可以在一定范围内，共有至少约40% -50%、约60% -70% 以及约80 %、85 %、90 %、95 %至98 %的序列相似性。以下术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系(a)“参照序 列(reference sequence) “ , (b)“比较窗(comparison window) “ , (c)“序列同一性〃, (d)"序列同一性的百分比"以及(e)"实质同一性"。 本文所用“参照序列，，是指作为用作序列比较根据的限定序列。参照序列可以是 指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或全部的cDNA或基因序 列。本文所用“比较窗”涉及多核苷酸序列的连续且指定的片段，其中对于两个序列的 最佳比对而言，在比较窗中多核苷酸序列与参照序列(不包含增加或删除)相比，可以包含 添加或缺失(例如，缺口)。通常，比较窗的长度是至少20个连续的核苷酸，任选地可以是 30、40、50、100或更长。本领域的那些技术人员理解，为了避免由于多核苷酸序列含有缺口 造成的与参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并且从匹配数中减去。用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。因此，可以使用数学算法来完 成任意两个序列之间的序列同一性百分比的测定。这类数学算法的非限制性实施例为 Myers and Miller, (1988) CABIOS 4 :11_17 的算法；Smith，et al.，(1981) Adv. Appl. Math. 2 482 ；Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 的算法；Pearson and Lipman, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444_2448 的算法；KarIin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872 :264 的算法，Karlin and Altschul, (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877改良的算法，在此通过引用将其全文并入。
可以使用计算机执行这些数学算法，用来比较序列从而测定序列的同一性。这类 执行包括但不限于PC/Gene 程序(可从 Intelligenetics，Mountain View, Calif.获得) 中的 CLUSTAL ;ALIGN 程序(2. 0 版本)以及 GCG Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、 BESTFIT、BLAST、FASTA和 TFASTA，该软件包版本为 10(可从 Accelrys Inc.，9685 Scranton Road, San Diego, Calif.，USA获得)。使用这些程序的比对可以使用默认参数来进行。 CLUSTAL程序由 Higgins，et al.，(1988) Gene 73 :237_244 (1988)、Higgins，et al.，(1989) CABIOS 5 :151-153、Corpet，et al.，(1988) NucleicAcids Res. 16 10881-90、Huang，et al.，(1992) CABIOS 8 155-65 以及 Pearson，et al.，(1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307_331 进 行了很好的描述，在此通过引用将其全文并入。ALIGN程序是以Myers and Miller (1988) 同上的算法为基础的。当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺 口罚分 4 可以与 ALIGN 程序一起使用。Altschul, et al.，(1990) J. Mol. Biol. 215 :403 的 BLAST程序，在此通过引用将其全文并入，以Karlin and Altschul, (1990)同上的算法为基 础。BLAST核苷酸搜索可以与BLASTN程序一起执行，分值=100，子长=12，来获得与本发 明的编码一种蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以与BLASTX程序一 起执行，分值=50，字长=3，来获得与本发明的一种蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了 获得用于比较目的的带缺口的比对，可以使用如Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389所述的Gapped BLAST (BLAST 2. O中)，在此通过引用将其全文并入。可选地， 可以使用PSI-BLAST (BLAST 2. O中)来进行迭代搜索(iteratedsearch)，其可以检测分 子之间的远亲关系。参见Altschul，et al.，(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST、 PSI-BLAST时，可以使用各程序的默认参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋 Θ)。 #=1，Jfi求 Natioriiil Center for Biotechnology Information ^Ntltncbi. nlm. nih. gov。同样也可以通过观察来进行人工比对。除非另有规定，本文所提供的序列同一性/相似性值涉及通过GAP版本10使用以 下参数获得的值使用缺口权重50和长度权重3以及nwsgapdna. cmp评分矩阵的核苷酸序 列的％同一性和％相似性；使用缺口权重8和长度权重2以及BL0SUM62评分矩阵的氨基酸 序列的％同一性和％相似性；或者其任何等同程序。本文所用“等同程序”是任何序列比较 程序，对于任何两个所讨论的序列，当与GAP版本10所产生的相应比对相比时，该程序可产 生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配以及相同序列同一性百分比的比对。GAP程序使用Needleman and Wunsch(同上)的算法，来找出两个完整序列的比对 使配对数量最大化并且使缺口数量最小化。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，并且产 生带最大匹配碱基数和最少缺口数的比对。它允许在匹配的碱基单位中提供缺口产生罚分 和缺口延伸罚分。GAP必须利用其插入的每个缺口匹配的缺口产生罚分数。如果选择缺口 延伸罚分大于0，那么GAP必须另外利用每个插入缺口的缺口长度乘以缺口延伸罚分。GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中对于蛋白序列的默认缺口产生罚分和缺口延伸罚分 分别是8和2。对于核苷酸序列而已，缺口产生罚分是50而缺口延伸罚分是3。缺口产生 罚分和缺口延伸罚分可以表示为选自0-200的整数。因此，例如，缺口产生罚分和缺口延伸 罚分可以是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或更高。GAP表现为最佳比对家族中的一员。这个家族中可以有许多成员，但是没有其他成 员有更好的质量。GAP呈现了四种用于比对的品质指标质量、比例、同一性和相似性。质量是用于比对序列的最大化的衡量标准。比例是被更短片段中的碱基数量除的质量。同一性 百分比是真实匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略跨越缺口的 符号。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0. 50，即相似性的阈值时，对相似性进行评分。 GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中所用的评分矩阵是BL0SUM62 (参见Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915，在此通过引用将其全文并入)。如本文所用，在两个核苷酸或多肽序列的语境下，“序列同一性”或“同一性”是指 当在特定的比较窗中进行最大一致性的比对时，两个序列中相同的残基。当序列同一性的 百分比被用于指蛋白时，公认的是不同的残基位点因保守氨基酸取代通常是不同的，这里 氨基酸残基被其他具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基取代因此不改 变分子的功能特性。当序列在保守的取代方面不同时，序列同一性百分比可以被上调来校 正取代的保守性。因这类保守替代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进 行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这包括将保守的替代评分为部分而 不是全部错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，当相同氨基酸的评分为1而非保 守取代的评分为O时，保守取代的评分在O和1之间。计算保守取代的评分，例如PC/GENE ^MJf (Intelligenetics, Mountain View, Calif.) Miiff 白勺。本文所用“序列同一性百分比，，指通过在比较窗比较两个最佳比对的序列所测定 的值，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗中的一部分多核苷酸序列与参照序列(不包 含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(例如，缺口)。百分比的计算是通过测定在两 个序列中存在相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位点的数目产生匹配位点数，以比较窗中位 点总数除匹配位点的数目，并且将结果乘以100来产生序列同一性百分比。术语多核苷酸序列的“实质同一性”指，通过比对程序使用默认参数与参照序列相 比，包含具有至少70%序列同一性、优选至少80%、更优选至少90%以及最优选95%的序 列的多核苷酸。本领域的技术人员公认通过考虑兼并密码、氨基酸相似性、阅读框定位等， 可以适当地调整这些数值，来测定两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。基于此目 的，氨基酸序列的实质同一性通常指序列同一性至少60%、70%、80%、90%以及至少95% 的序列同一性。另一个表示核苷酸序列是实质同一性的标记是，两个分子在严格条件下是否相互 杂交。通常，在限定的离子强度和PH值下，选择比具体序列的Tm值低约5°C的严格条件。然 而，严格条件包括比Tm值低约1°C至约20°C范围的温度，这取决于如本文另外所限定的所 需的严格程度。在严格条件下不能互相杂交的核酸，如果其编码的多肽是实质相同的，那么 它们仍然是实质相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大的密码简并性来产生核酸拷 贝时，这就可以发生。两个核酸序列是实质相同的一个标记是，第一核酸所编码的多肽与第 二核酸所编码的多肽是免疫交叉反应的。本文所公开的ADF4启动子序列及其变体和片段，用于植物的基因过程，例如，用 于产生转化的或转基因的植物，来表达目的表型。本文所用的术语“转化的植物”和“转基 因的植物”指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸是稳定地整合于 转基因或转化的植物的基因组中，从而使多核苷酸传递给下一代。异源多核苷酸可以单独 或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。需要理解的是本文所用术语“转基因的” 包括基因型被异源核酸的存在改变的任何细胞、细胞系、胼胝体、组织、植物部分或植物，该
11异源核酸包括那些由转基因学最初如此改变的异源还是以及那些由有性繁殖或无性繁殖 从最初转基因产生的异源核酸。转基因“事件”是用异源DNA构建体，包括含有目的转基因的核酸表达盒，转化植 物细胞，由转基因插入植物的基因组导致植物群体的再生，以及选择特征为插入特定基因 组位点的特定植物。事件的表型特征是转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物基因组 成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性繁殖所产生的后代，其中后代 包括异源DNA。本文所用术语植物包括全部的植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、植物细胞、植 物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物胼胝体、植物丛(plant clumps)以 及植物中完整的植物细胞或植物的部分，例如胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、 穗、玉米穗轴(cobs)、外壳(husk)、茎、根、根尖、花粉囊等。谷物是指非培育或繁殖种类目 的的商业栽培物所生产的成熟的种子。再生植物的后代、变体和突突变体也包括于本发明 的范围内，假定这些部分包含所引入的多核苷酸。本发明可以用于转化任何植物种类，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植 物。植物种类的实例包括玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)种类(例如，甘蓝型油 菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜(B. jimcea))尤其那些可用植物油的芸苔属 禾中￥、胃胃H (Medicago sativa)>/jCfS (Oryza sativa)(Secale cereale) > ^ 梁(Sorghum bi col or、Sorghumvu Igar e)、稷(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍 (Panicum miliaceum) >SHISfS (Setaria italica) (Eleusine coracana)) > (π| H^ (Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆 (Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘 薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属(Coffea spp·))、椰子 (Cocos nuc if era)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(柑橘属禾中类(Citrus spp·))、可可 豆(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属种类(Musa spp·))、鳄梨 (Perseaamericana)、无花果(Ficus casica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、 H (Olea europaea) (Carica papaya)、！(Anacardium occidentale)、 澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属种类(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物，以及和针 叶树。蔬菜包括番爺(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如 Lactuca sativa)、青豆 (Phaseolus vulgaris)、禾马豆(Phaseolus limensis)、豆|5豆(Lathyrusspp.)，以及黄瓜 属成员例如黄瓜(C. sativus)、哈密瓜(C. cantalupensis)和甜瓜(C. melo)。观赏性植物 包括杜鹃花(杜鹃属种类(Rhododendronspp.))、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉 (Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属种类(Rosa spp·))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属种类(Narcissus spp.))、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨 (Dianthuscaryophyllus) >一mil (Euphorbia pulcherrima)以及菊可以用于实施本发明的针叶树包括，例如，松树如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松 (Pinus elliotii)、美国黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinusradiata)；花方萁松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉 (Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；冷杉如银揪(Abies amabilis)禾口香月旨 (Abies balsamea)；以及雪松如西部铅笔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)0在具体实施方案中，本发明的植物是农作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、 向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等)。在其他实施方案中，玉米和 大豆植物是最佳的，而在另外的实施方案中，玉米植物是最佳的。其他目的植物包括可提供感兴趣的种子的谷类植物，含油种子的植物和豆科植 物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等等。含油种子的植 物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、紫花苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆和豌 豆。豆包括瓜尔豆、角豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。本发明的ADF4启动子所表达的异源编码序列可以用于改变植物的表型。表型的 各种变化时有利的，包括改良植物中基因的表达，改变植物防御病菌或昆虫的机制，增强植 物对除草剂的耐性，改变植物发育来应答环境应激，调解植物对盐、温度(热和冷)、干旱等 的应答。可以通超表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来实现这些结果。在具体 实施方案中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提高的内源植物序列。 可以通过提供表达改变的一个或多个内源基因产物或影响植物中的营养摄取来获得这些 结果，内源基因产物尤其是激素、受体、信号分子、酶、转运蛋白或辅因子。如ADF启动子所 提供的组织优选表达可以实现具体目的植物部分和/或生长阶段如生长中的生殖组织的 表达的改变。这些改变可以导致转化植物表型的改变。本发明目的核苷酸序列的一般种类包括，例如，与信息有关的那些基因，如锌指 纹，与传送信息有关的那些基因，如激酶，以及与常规事件有关的那些基因，如热激蛋白。 转基因的更多具体种类，例如，包括编码农业经济、抗昆虫、抗疾病、抗除草剂、抗环境应激 (对寒冷、盐、干旱等的耐性改变)和谷物特性等重要遗传性状的基因。还有其他种类的转 基因，包括用于诱导外源产物表达的基因，异源产物如来自植物和其他真核生物以及原核 生物的酶、辅因子和激素。公认的是，任何目的基因都可以可操作性连接于本发明的启动子 上并且在植物中表达。影响谷物质量的农业经济上重要的遗传性状，例如油的水平和类型、饱和和不饱 和、必需氨基酸的质量和数量、纤维素、淀粉和蛋白含量水平，可以使用实施方案的方法来 进行基因改变。谷物遗传性状的修饰包括但不限于，提高油酸、饱和和不饱和油的含量，提 高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。玉米中Hordothionin蛋白的修饰 已在美国专利5，990，389号、5，885，801号、5，885，802号和5，703，049号中公开；在此通过 引用将其全文并入。另一个实例是1996年3月20日提交的美国专利5，850，016号所述的 大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，以及Williamson，et al. , (1987) Eur. J. Biocheml65 99-106中的大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，在此通过引用将以上公开内 容的全文并入。昆虫抗性基因可以编码对害虫的抗性，害虫会造成极大的生产阻碍例如食虫、毛 虫、玉米螟等。这类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白 基因，美国专禾U 5，366,892 号、5，747，450 号、5，736，514 号、5，723，756 号、5，593,881 号；和Geiser，et al.，(1986)Gene48 :109，在此通过引用将以上公开内容的全文并入。编码 疾病抗性遗传性状的基因包括，例如，解毒基因，如使伏马毒素(fumonisin)解毒的那些基 因(美国专利5，792，931号)；无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones, etal.，(1994) Science 266 789 ；Martin, et al.， (1993) Science 262 1432 ；以及 Mindrinos，et al.， (1994)Cell 78 1089)，在此通过引用将其全文并入。除草剂抗性遗传性状可以包括编码用于抵抗除草剂的基因，该除草剂会抑制乙酰 乳酸合成酶(ALS)的作用，尤其是磺脲型除草剂(例如，含有导致此类突变尤其是S4和/ 或Hra突变的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因)，编码除草剂抗性的基因，该除草剂会抑制谷氨 酰胺合成酶，如膦丝菌素或草铵膦(basta)(例如，bar基因)，编码草甘膦抗性的基因(例 如，EPSPS基因和GAT基因；参见例如，美国专利申请公布2004/0082770和W003/092360，在 此通过引用将其全文并入)或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码除草剂草铵膦抗 性，nptll基因编码抗生素卡那霉素和遗传霉素抗性，而ALS-基因突变编码除草剂绿黄隆 抗性。草甘膦抗性是由突变的5-烯醇丙酮酸-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和aroA 基因赋予的。参见，例如，Shah等的美国专利4，940，835号，其公开了可以赋予草甘膦抗 性的EPSPS形式的核苷酸序列。Barry等的美国专利5，627，061号也公开了编码EPSPS酶 的基因。同样参见美国专利6，248，876 Bl号、6，040，497号、5，804，425号、5，633，435号、 5，145，783 号、4，971，908 号、5，312，910 号、5，188，642 号、4，940，835 号、5，866，775 号、 6，225，114 Bl 号、6，130，366 号、5，310，667 号、4，535，060 号、4，769，061 号、5，633，448 号、 5，510，471 号、Re. 36，449 号、RE 37，287E 号和 5，491，288 号，以及国际公布 WO 97/04103 ； WO 97/04114, WO 00/66746、W001/66704、WO 00/66747 和 WO 00/66748，在此通过引用将其 全文并入。同样赋予植物草甘膦抗性，该植物表达编码草甘膦氧化还原酶的基因，如美国专 利5，776，760和5，463，175中更充分的描述，在此通过引用将其全文并入。此外可以通过 超表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因来赋予植物草甘膦抗性。参见例如，美国专利序列 号11/405,845和10/427，692，在此通过引用将其全文并入。不育基因也可以编码于DNA构建体中，并且为自然去雄提供选择。以此方式 使用的基因的实例包括雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因，例如美国专利 5，583，210号所述的QM，在此通过引用将其全文并入。其他基因包括激酶和那些编码对雄 性或雌性配子体发育有毒的化合物的基因。商业遗传性状也可以编码入基因中，该基因可以提高例如用来生产乙醇的淀粉 或提供蛋白的表达。转化植物的另一个重要的商业用途是，多聚体和原生质体的生产，例 如美国专利5，602，321号所述，在此通过引用将其全文并入。基因例如β-酮硫解酶、 PHBase (聚羟基丁酸合成酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert，et al. , (1988) J. Bacteriol. 170 :5837_5847，在此通过引用将其全文并入)可以促进聚羟基链烷酸酯 (PHAs)的表达。外源产物包括植物酶和产物以及那些源于其他来源的包括原核生物和其他真核 生物的产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。其他可用基因及其相关表型的实例包括，编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因， 或其他可赋予病毒抗性的病毒或植物基因；可赋予真菌抗性的基因；可促进产量改善的基
14因；以及提供应激抗性的基因，例如寒冷、干旱、热和盐分导致的脱水、有毒金属或微量元素寸。为了说明而非限制，以下是基因类型的实例，这些基因可以与本发明的调节序列
一同使用。1.转基因，其赋予昆虫或疾病抗性并编码(A)植物疾病抗性基因。植物防御通常被植物中的疾病抗性基因(R)的产物 和病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用所激活。可以用克 隆的抗性基因转化植物的种类，以便人工改造对特定病原体菌株具有抗性的植物。参 见，例如，Jones，et al.，(1994) Science266 :789 (克隆番茄抗褐孢霉(Cladosporium fulvum)的 Cf-9 基因)；Martin, et al.，(1993) Science 262 1432 (抗番茄丁香假单胞 胃(Pseudomonassyringae pv.)白勺 Pto ■ @ IS 石马胃白) ；Mindrinos, et al., (1994) Cell78 :1089 (抗丁香假单胞菌的拟南芥属(Arabidopsis) RSP2 基因)；McDowell and ffoffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4) 178-83 以及 Toyoda，et al. , (2002) Transgenic Res. 11(6) :567_82，在此通过引用将其全文并入。对疾病有抗性的植物与野生 型植物相比，是对病原体具有更强抗性的植物。(B)苏云金杆菌蛋白，其衍生物或以其为模型合成的多肽。参见例如，Geiser, et al.，(1986)Gene 48 :109，其公开了 Bt δ -内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编 码S-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, MD)购买，例如，通过 ATCC 登录号 40098、67136、31995 和 31998。 被遗传改造的苏云金杆菌转基因的其他实例在以下专利和专利申请中给出并且为此目 的通过引用并入美国专利5，188，960号、5，689，052号、5，880，275号；WO 91/14778 ； WO 99/31248 ；WO 01/12731 ；WO 99/24581 ;W097/40162 和美国申请序列号10/032，717、 10/414，637和10/606，320，在此通过引用将其全文并入。(C)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素，其变体，基于其的模拟 物，或其拮抗剂或兴奋剂。参见例如，Hammock，et al. , (1990) Nature 344 :458公开的克隆 的保幼激素酯酶在杆状病毒中的表达，保幼激素酯酶是一种保幼激素灭活剂，在此通过引 用将其全文并入。(D)昆虫特异性肽，其表达后能破坏感染的害虫的生理机能。例如，见于Regan， (1994) J. Biol. Chem. 269 :9 (表达克隆产生编码用于昆虫利尿激素受体的DNA) ；Pratt, et al.，(1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 :1243(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出昆虫神经肽咽侧体抑制激素)；Chattopadhyay，et al.，(2004)Critical Reviews inMicrobiology 30(1) 33-54 ；Zjawiony(2004) J Nat Prod 67(2) 300-310 ； Carlini and Grossi-de-Sa(2002)Toxicon 40(11) 1515-1539 ；Ussuf, et al.，(2001) Curr Sci. 80(7) :847-853 ；以及 Vasconcelos and Oliveira(2004)Toxicon 44(4) 385-403公开的内容，在此通过引用将其全文并入。同样参见Tomalski等的美国专利 5，266，317号，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因，在此通过引用将其全文并入。(E)引起单萜、倍半萜烯、类固醇、羟肟酸、苯丙烷类化合物的衍生物或另一个带杀 虫剂活性的非蛋白分子超堆积的酶。(F)与生物学活性分子修饰包括翻译后修饰有关的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、解脂酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹 性蛋白酶、几丁质酶以及葡聚糖酶，不论是天然的还是合成的。参见Scott等的PCT申请 WO 93/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列，在此通过引用将其全 文并入。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以从例如ATCC登录号39637和67152获 得。同样参见 Kramer，et al.，(1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23 :691，其公开了编 码烟草天蛾几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck，et al.，(1993)Plant Molec. Biol. 21 :673，其提供了欧芹ubi4-2多遍在蛋白质基因的核苷酸序列，美国专利申请序列 号10/389，432、10/692，367和美国专利申请6，563，020号，在此通过引用将其全文并入。(G)刺激信号转导的分子。例如，参见 Botella，et al.，(1994)PlantMolec. Biol. 24 757公开的绿豆调钙蛋白cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess，et al.，(1994) Plant Physiol. 104 :1467，其提供了玉米调钙蛋白cDNA克隆的核苷酸序列，在此通过引用 将其全文并入。(H)疏水性力矩肽(hydrophobic moment peptide) 参见 PCT 申请 WO95/!6776 和美国专利申请5，580，852(公开了抑制真菌的植物病原体的速普肽的肽衍生物)以及PCT 申请WO 95/18855和美国专利申请5，607，914(公开了可赋予疾病抵抗力的和合成的抗菌 肽)，在此通过引用将其全文并入。(I)膜透性酶，一种通道构成剂或通道封阻剂。例如，参见Jaynes，etal.，(1993) Plant Sci. 89:43公开的杀菌肽-β细胞溶解酶的肽类似物的异源表达，使转基因的烟草 植物对青枯假单胞菌具有抗性，在此通过引用将其全文并入。(J)病毒入侵蛋白或其衍生的复合毒素(complex toxin)。例如，转化的植物细胞 中的病毒外壳蛋白的积聚赋予其对病毒感染和/或由外壳蛋白基因来源的病毒和相关病 毒引起的疾病发展的抗性。参见，Beachy，etal.，(1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28 :451，在 此通过引用将其全文并入。外壳蛋白介导的抗性赋予转化的植物抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花 叶病毒、烟草条纹病毒、土豆病毒X、土豆病毒Y、烟草蚀刻病毒、烟草皱屈病毒和烟草花叶 病毒的能力。同上。(K)昆虫特异性抗体或其衍生的抗毒素。因此，靶向昆虫消化道内关键的新陈代 谢功能的抗体会使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。参见Tayl0r，et al. ,Abstract #497， SEVENTH INT ‘ L SYMPOSIUM 0匪0LECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS(Edinburgh, Scotland, 1994)(通过单链抗体片段的产生使转基因烟草中的酶失活)，在此通过引用将 其全文并入。(L)病毒特异性抗体。参见例如，Tavladoraki，et al.，(1993)Nature366 :469，其 公开了表达重组抗体的转基因植物可以免受病毒的攻击，在此通过引用将其文并入。(M)由病原体或寄生虫天然产生的发育抑制蛋白(developmental-arrestive protien)。因此，真菌内α-1，4_D_多聚半乳糖醛酸酶可以通过溶解植物细胞壁的同 源-a-1，4_D-半乳糖醛酸酶来促进真菌建群以及植物营养物质释放。参见Lamb，et al., (1992)Bio/TechnologylO :1436，在此通过引用将其全文并入。Toubart, et al.，(1992) Plant J. 2 :367描述了编码豆内源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征，在此 通过引用将其全文并入。(N)植物天然产生的发育抑制蛋白。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/
16Technology 10 305公开了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物的真菌疾病抗性增强， 在此通过引用将其全文并入。(0)与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病机制相关的基因。Briggs， (1995)Current Biology 5(2) 128-131，Pieterse and Van Loon(2004)Curr. Opin. Plant Bio. 7(4) :456-64 和 Somssich(2003)Cell 113(7) :815_6，在此通过引用将其文并入。(P)抗真菌的基因(Comelissen and Melchers, (1993)PI. Physiol. 101 :709_712， 和 Parijs，et al.，(1991)Planta 183 :258_264，以及 Bushnell，etal.，(1998)Can. J. of Plant Path. 20(2) 137-149)。同样参见美国专利申请09/950，933，在此通过引用将其全 文并入。(Q)解毒基因，例如用于烟曲霉毒素、白僵菌素、念珠镰刀菌素和玉米烯酮及其结 构上相关的衍生物。例如，见于美国专利5，792，931号，在此通过引用将其全文并入。(R)半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见美国申请序列号 10/947，979，在此通过引用将其全文并入。(S)防卫素基因。参见W003000863和美国申请序列号10/178，213，在此通过引用 将其文并入。(T)赋予抗线虫抗性的基因。参见 WO 03/033651 和 Urwin，et. al.，(1998) Planta 204 472-479, Williamson(1999)Curr Opin Plant Bio. 2(4) :327_31，在此通过引用将其 全文并入。(U)诸如赋予炭疽病茎腐烂抗性的rcgl等的基因，炭疽病茎腐烂是由真菌 Colletotrichum graminiola弓|起的。参见 Jung, et al. ,Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping ofAnthracnose Stalk Rot genes in Maize,Theor. Appl. Genet. (1994)89 413-418以及美国专利申请60/675，664，在此通过引用将其全文并 入。2.赋予除草剂抗性的转基因，例如(A)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺脲。这种示例性的基 因编码例如由 Lee，et al.，(1988) EMBO J. 7 :1241 和 Miki，etal.，(1990) Theor. Appl. Genet. 80 449分别公开的突变的ALS和AHAS酶。同样参见美国专利5，605, 011号、 5，013，659 号、5，141，870 号、5，767，361 号、5，731，180 号、5，304，732 号、4，761，373 号、 5，331，107号、5，928，937号和5，378，824号，以及国际公布WO 96/33270，在此通过引用将 其全文并入。(B)草甘膦(分别由突变的5-烯醇丙酮酸-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和 aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物例如草丁膦(膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)和 吸水链霉菌(Str印tomyces hygroscopicus)膦丝菌素乙酰转移酶(bar)基因)，以及氧化 吡啶(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环异己酮(ACCase抑制剂编码的基因)。参见例如， Shah等的美国专利4，940，835，其公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序 列。Barry等的美国专利5，627，061也公开了编码EPSPS酶的基因。同样参见美国专利 6，566，587 号、6，338，961 号、6，248，876B1 号、6，040，497 号、5，804，425 号、5，633，435 号、 5，145，783 号、4，971，908 号、5，312，910 号、5，188，642 号、4，940，835 号、5，866，775 号、 6，225，114B1 号、6，130，366 号、5，310，667 号、4，535，060 号、4，769，061 号、5，633，448 号、
175，510，471 号、Re. 36，449 号、RE 37，287E 号和 5，491，288 号，以及国际公布 EP1173580、WO 01/66704、EP1173581和EP1173582，在此通过引用将其全文并入。同样赋予植物草甘膦抗 性，该植物表达编码草甘膦氧化还原酶的基因，如美国专利5，776，760号和5，463，175号中 更充分描述的，在此通过引用将其全文并入。此外可以通过超表达编码草甘膦N-乙酰转移 酶的基因，赋予植物草甘膦抗性。参见，例如，美国专利序列号11/405，845和10/427，692， 以及PCT申请US01/46227，在此通过引用将其全文并入。编码突变的aroA基因的DNA分子 可以通过ATCC登录号39256获得，并且Comai的美国专利4，769，061号公开了突变基因的 核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入。Kumada等的欧洲专利申请0333033和Goodman 等的美国专利申请4，975，374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其可以赋予对 例如L-膦丝菌素等除草剂的抗性，在此通过引用将其全文并入。膦丝菌素乙酰转移酶基 因的核苷酸序列由Leemans等的欧洲专利申请0 242 246和0 242 236，以及De Greef， et al. , (1989)Bio/Technology 7 :61所提供，De Greef等公开了表达编码用于膦丝菌素 乙酰转移酶活性的嵌合的bar基因的转基因植物的产生，在此通过引用将其全文并入。同 样参见美国专利 5，969，213 号、5，489，520 号、5，550，318 号、5，874，265 号、5，919，675 号、 5，561，236 号、5，648，477 号、5，646，024 号、6，177，616 Bl 号和，879，903 号，在此通过引用 将其全文并入。赋予对苯氧基丙酸和环异己酮例如稀禾定和吡氟氯草灵抗性的示例性基 因，是 Marshall，et al.，(1992)Theor. Appl. Genet. 83 :435 公开的 Accl-Sl，Accl_S2 和 Accl-S3基因，在此通过引用将其全文并入。(C)抑制光和作用的除草剂，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基 因)。Przibilla，et al.，(1991)Plant Cell 3 :169 公开了用编码突变的 psbA基因的质粒 转化衣藻，在此通过引用将其文并入。Stalker的美国专利4，810，648公开了腈水解酶基因 的核苷酸序列，在此通过引用将其全文并入，并且含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC 登录号 53435,67441 和 67442 获得。Hayes, et al.，(1992)Biochem. J. 285 173 公开了编 码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达，在此通过引用将其全文并入。(D)乙酰羟酸合成酶，发现其用于获得表达抗多种除草剂的这一类酶的植物，已 被引入多种植物中(参见例如，Hattori，et al.，(1995)Mol GenGenet 246:419，在此通 过引用将其全文并入)。赋予除草剂抗性的其他基因包括编码鼠细胞色素P4507A1和酵 母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota，et al.，(1994)Plant Physiol. 106(1) 17-23)，谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono,et al.，(1995) Plant Cell Physiol 36 1687)，以及用于多种磷酸转移酶的基因(Datta, et al.，(1992) Plant Mol Biol 20 :619)，在此通过引用将其全文并入。(E)原卟啉原氧化酶(protox)是生产叶绿素所必需的，其对所有植物的存活是 必需的。protox酶作为多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂也会抑制所有存在的不同 种类的植物的生长，导致它们完全摧毁。美国专利6，288，306 Bl号、6，282，837 Bl号和 5，767，373号，以及国际公布WO 01/12825描述了含有改变的protox活性的对这些除草剂 有抗性的植物的发育，在此通过引用将其全文并入。3.赋予或有助于改变的谷物特性的转基因，例如(A)改变的脂肪酸，例如，通过(1)下调硬脂酰-ACP去饱和酶来增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon，etal. , (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 2624禾口W099/64579(Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn(玉米种改变脂质特性的去饱和酶基因))，在此通过引用 将其全文并入，(2)通过FAD-2基因修饰来提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰来降低亚麻酸(参 见美国专利6，063，947号、6，323，392号、6，372，965号以及WO 93/11245，在此通过引用将 其全文并入)，(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如WO 01/12800中，在此通过引用将其全文 并入，(4)改变 LEC1、AGP、DekU SuperalU milps，各种 Ipa 基因例如 lpal, lpa3, hpt 或 hggt。例如，参见 WO 02/42424、WO 98/22604、WO 03/011015、美国专利 6，423，886 号、 美国专禾IJ 6，197，561号、美国专利6，825，397号，美国专利申请
发明者卡尔利·雷曼, 尼古拉斯·J·贝特 申请人:先锋高级育种国际公司