具有改变的特性的α-淀粉酶变体的制作方法

专利名称：具有改变的特性的α-淀粉酶变体的制作方法
具有改变的特性的α-淀粉酶变体序列表本文附带包含SEQ ID NO :1_31的序列表，其中所述每个序列通过引用的方式完整 并入本文。本公开的领域本公开涉及新的α -淀粉酶。特别地，它涉及某些α _淀粉酶变体活性，以及其与 一种或多种其他酶如植酸酶的掺合物。
背景技术：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)构成一组催化淀粉 及相关的线型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。α -淀粉酶可以用于各种目的。例如，α -淀粉酶商业地用于淀粉加工的初始阶段 (例如，液化)中；湿磨工艺中；和从糖类生产醇中。它们也用作洗涤剂基质中的清洁剂或 辅料，在纺织工业中用于淀粉退浆；用在焙烘用途中；用于饮料工业；用于油田的钻井工艺 中；用于再循环过程，例如用于纸张脱墨，和用于动物饲料中。已经试图构建具有针对特定用途如淀粉液化和纺织品退浆的改良特性的α -淀 粉酶变体。需要创造和改善这样的淀粉酶，所述淀粉酶例如为包括谷物商业加工(例如液 化过程)在内的多种用途提供了优于工业标准酶(例如来自地衣芽孢杆菌(Bacillus Iicheniformis))的制造和/或性能优点。也需要包含改良的淀粉酶和额外的酶如植酸酶 的组合物。发明概述在一个方面，本公开尤其涉及亲本α -淀粉酶(如AmyS样α -淀粉酶)的新α -淀 粉分解酶变体，特别是展示在工业加工淀粉(淀粉液化、糖化等)方面有利的改变特性的变 体。例如，与亲本AmyS样α -淀粉酶或参考α -淀粉酶相比较，该变体在以下一个或 多个特性方面改变净电荷、底物特异性、底物切割、底物结合、热稳定性、在一个或多个PH 处的活性、在一个或多个PH处的稳定性[如在特定ρΗ(例如低(例如ρΗ ( 6，尤其ρΗ ( 5) 或高(例如ρΗ > 9)ρΗ值)处提高的稳定性]、氧化条件下的稳定性、金属离子需求[例如 Ca2+依赖性或Ca2+需求]、比活性、催化速率、催化效率、在植酸或另一种植酸盐存在下的活 性(即对于植酸盐抑制的易感性)、在植酸或植酸盐存在下的热或PH稳定性、在液化试验中 影响峰粘度的能力、在液化试验中影响终末粘度的能力和其他目的特性。例如，一个或多个 改变可以产生这样的变体，其与亲本α-淀粉酶(如AmyS样α _淀粉酶)相比较具有降低 的Ca2+依赖性和/或改变的pH/活性特征和/或改变的热稳定性。在一个方面，本公开涉及变体α-淀粉酶，其包含与亲本AmyS样α-淀粉酶的氨 基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸 位置处具有替换，并且还包含一项或多项以下对其氨基酸序列的修饰a) 一个或多个在如下位置处的替换在第349氨基酸位置处的半胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97位置处的精氨酸、在第319位置处的 谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的谷氨酸、在第358位置处的精氨酸、在 第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸；b)在与第97、319、349、358、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位 置处的其他序列修饰；c)在？178、1 179、6180、1181、6182或1(183位置或其成对位置处的一个或多个氨
基酸的缺失；d)在第178、179、180、181、182或183氨基酸位置的一个或多个位置处的其他序列 修饰；e)N193F或V416G或这两者的替换；f)在第193、416或这两者位置处的其他序列修饰；g)用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替换在经修饰的 α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基；h)用另一种天然存在的氨基酸残基替换在经修饰的α -淀粉酶变体的部分中存 在的一个或多个脯氨酸残基；i)用丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸残基替换在亲本α -淀粉 酶中存在的一个或多个半胱氨酸残基；j)用另一种天然存在的氨基酸残基替换在亲本α -淀粉酶中存在的一个或多个 半胱氨酸残基；k)在SEQ ID NO 7是用于编号的参考淀粉酶的情况下，任意的以下突变M15T， L、M15X、V128E、V128X、H133Y、H133X、N188S, Τ, P、Ν188Χ、Μ197Τ, L、M197X、A209V、A209X、 M197T/W138F、M197T/138Y、M15T/H133Y/N188S、M15N128E/H133Y/N188S、E119C/S130C、 D124C/R127C、H133Y/T149I、G475R、H133Y/S187D 或 H133Y/A209V ；1)在 SEQ ID NO 7 是参考淀粉酶的情况下，在 M15、V128、A111、H133、W138、T149、 M197、附88、A209、A210、H405、T412位置的一个或多个位置处的其他修饰；m)在亲本α -淀粉酶包含SEQ ID NO 7的情况下，当SEQ ID NO 2是参考淀粉酶 时，位于任意的 Μ8、Μ9、Μ96、Μ200、Μ206、Μ284、Μ307、Μ311、Μ316 和 Μ438 位置处的一个或多 个半胱氨酸残基(C363)或一个或多个甲硫氨酸残基的缺失或替换；η)在 SEQ ID NO :1 或 2 是参考淀粉酶的情况下，与 Ρ17、D19、Τ21、Ν28、S51、G72、 V74、Α82、Q86、Q89、Α93、G95、Q97、W115、D117、Ρ123、S124、D125、Ν127、1130、G132、Q135、 P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、R179、G180、I181、G182、K183、W187、P209、 N224、S242、P245、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474或R483相对应的一个或多个氨基酸残基的修饰；或o)a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、 Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成组替换。在目前优选的实施方案中，该α -淀粉酶变体是S242A、S242D、S242E、S242F、 S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。
该α-淀粉酶变体优选地从包含任一SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16 的亲本AmyS样α-淀粉酶衍生。在某些实施方案中，用于氨基酸残基编号的参考α -淀粉 酶优选地是SEQ ID NO :1或2。在一个实施方案中，该变体的氨基酸序列与亲本AmyS样α -淀粉酶的氨基酸序列 至少98%同一。也提供了包含编码序列的核酸，即多核苷酸，其中所述的编码序列编码a)本文中 所述变体的氨基酸序列；或 b)任一 SEQ ID NO :3、4、16、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。 也提供了载体及包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞。在多个实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢 杆菌(B. licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B. Ientus)、短芽孢杆菌(B. brevis)、嗜热脂肪 芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌 (B. amyIoliquefaciens)、凝结芽抱杆菌(B. coagulans)、环状芽抱杆菌(B. circulans)、 灿烂芽孢杆菌(B. Iautus)、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)、变铅青链霉菌 (Streptomyces lividans)、鼠灰链霉菌(S. murinus)；大肠杆菌(Escherichia coli)或假 单胞菌属的物种(Pseudomonas spp.)。在另一方面，在本文中提供了亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌 (Geobaci 1 lusstearothermophiIus) α -淀粉酶的变体，其中该变体具有与亲本嗜热脂肪土 芽孢杆菌α “淀粉酶具有至少95%同源性并包含第242位氨基酸替换的氨基酸序列，其中 肽序列中的氨基酸位置相对于SEQ ID NO :1或2进行编号，并且其中该变体具有α _淀粉 酶活性。在另一方面，提供了组合物，其包含a)如本文中提供的α -淀粉酶变体，和b)至少一种额外的酶。在一个实施方案中，该组合物是一种包含a)至少一种变体淀粉酶和b)至少一种 额外的酶的组合物，其中所述的变体淀粉酶包含与亲本AmyS样α _淀粉酶的氨基酸序列至 少95%同一的氨基酸序列，并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有 替换，所述变体具有可检测的α-淀粉酶活性。额外的酶优选地是植酸酶。该组合物中的α -淀粉酶变体优选地是S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。在一个实施方案中，该α -淀粉酶变体还在与参考α -淀粉酶第97、179、180、193、 319、349、358、416、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处包含序列修 饰。该α-淀粉酶变体也可以包含一个或多个在如下位置处的替换在第349位置处的半 胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97位置处的精氨酸、在 第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的谷氨酸、在第358位 置处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸。在一个实施方案中，该α-淀粉酶变体包含附93或V416或这二者的替换，例如， N193F或V416G或这二者的替换。在其他实施方案中，该α -淀粉酶变体包含第179和180位氨基酸的缺失。在一 个实施方案中，组合物包含这样的α-淀粉酶变体，其与SEQ ID NO :2具有至少95%同源性并且相对于包含氨基酸序列SEQ ID N0:1的参考α-淀粉酶中的编号而言包含第242位氨 基酸替换。如同上文，亲本AmyS样α-淀粉酶优选地是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12,15 或 16。在一个方面，本公开涉及利用α -淀粉酶(AA)活性和植酸盐水解酶(FTU)水解可 溶性淀粉底物。例如，其中AAU FTU的比率是从约1 15至约15 1，优选地是从1 10 至约10 1。在一个实施方案中，AAU FTU的比率是从1 4至3 1。在又一个实施 方案中AAU FTU的比率是1 1。在一个当前优选的组合物中，植酸酶具有SEQ ID NO 31的序列。更具体地，提供了用于处理淀粉浆液的方法，包括步骤a)添加至少一种植酸酶和 至少一种α -淀粉酶至淀粉浆液；其中在相同时间或大致相同时间或以任意顺序分别添加 植酸酶和α-淀粉酶，并且其中该α-淀粉酶是这样的变体淀粉酶，其包含与亲本AmyS样 α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相 对应的氨基酸位置处具有替换，所述变体具有可检测的α-淀粉酶活性；和b)在允许植酸 酶及α-淀粉酶活性的条件下温育该淀粉浆液。用于该方法中的α -淀粉酶变体优选地是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T变体。在一个实施方案中，该α -淀粉酶变体 还在与参考α -淀粉酶第97、179、180、193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相对 应的一个或多个氨基酸位置处包含序列修饰。该α-淀粉酶变体可以包含一个或多个在如 下位置处的替换在第349位置处的半胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处 的谷氨酸、在第97位置处的精氨酸、在第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、 在第358位置处的谷氨酸、在第358位置处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443 位置处的精氨酸。在一个实施方案中，该α-淀粉酶变体包含附93或V416或这二者的替 换，例如，N193F或V416G或这二者的替换。在其他实施方案中，该α-淀粉酶变体的特征 是第179和180位氨基酸的缺失。在该方法的一个实施方案中，亲本AmyS样α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、 9、10、11、12、15 或 16。植酸酶可以在α -淀粉酶变体之前或之后添加。可以在添加植酸酶之后并且在添 加α-淀粉酶变体之前预温育淀粉浆液。在一个实施方案中，植酸酶的纳入相对于不包括 淀粉浆液与植酸酶接触的可比较方法而言引起α-淀粉酶变体的热稳定性提高。在该方 法的一个实施方案中，植酸酶和α “淀粉酶变体在添加至淀粉浆液之前存在于单一掺合物 中。在另一个实施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO :31的氨基酸序列。在又一方面，本公开涉及用于在包含底物的浆液中液化淀粉的方法，所述底物包 括植物材料如来自干磨法或湿磨法的颗粒淀粉，该方法包括初级和/或次级液化步骤，所 述方法包括在初级和/或次级液化步骤中同时或分别地以任意顺序添加至少一种植酸水 解酶和至少一种α-淀粉酶的组合至浆液。该方法可以还包括糖化液化的淀粉以获得可发 酵糖；并且回收可发酵糖。在一些实施方案中，该方法还包括在合适的发酵条件下发酵可发 酵糖以获得终产物如醇。在一些实施方案中，酶组合物含有至少一种α-淀粉酶和植酸酶。 在一些实施方案中，酶组合物为掺合物形式。在又一方面，本公开涉及用于发酵淀粉底物的 方法，该方法包括以任意顺序添加单一或分批量的α-淀粉酶和植酸酶的组合。在另一方面，将处理的淀粉底物发酵成乙醇。在该方法的多个实施方案中，参考α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2，并且α-淀 粉酶变体是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T α -淀粉酶变体。在另一方面是获得可发酵底物的方法，所述方法为通过使含有颗粒淀粉的磨碎 谷物浆液与植酸水解酶在比淀粉凝胶化温度低约0°c至约30°C的温度接触，使该浆液与 α-淀粉酶接触，升高温度高于颗粒淀粉凝胶化温度以引起淀粉凝胶化，通过使凝胶化的淀 粉与α “淀粉酶接触足以水解该淀粉的时间而水解凝胶化的淀粉，并且获得可发酵底物。 植酸水解酶可以是细菌或真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉属(Aspergillus)植酸酶或 布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶。在一些实施方案中，细菌植酸酶来自大肠杆菌。随后，提供了从包含磨碎谷物的含淀粉浆液产生可发酵底物的方法，该方法包括 步骤a)将含淀粉浆液与足以从淀粉产生可发酵底物的量的至少一种植酸酶和至少一 种α“淀粉酶接触；其中在相同时间或大致相同时间或以任意顺序分别启动与植酸酶和α-淀粉酶 的接触，并且其中该α-淀粉酶是这样的变体淀粉酶，其包含与亲本AmyS样α _淀粉酶的 氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸 位置处具有替换，所述变体具有可检测的α-淀粉酶活性；和b)在允许植酸酶及α -淀粉酶活性的条件下温育该淀粉浆液一段引起可发酵底 物产生的时间；其中与植酸酶的接触在该淀粉酶之前启动时，浆液在比该浆液与所述淀粉 酶接触之前的凝胶化温度低0-30°C的温度温育，此后升高温度高于凝胶化温度，持续时间 为有效水解淀粉的时间。在一个实施方案中，参考α -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2，并且亲本AmyS样α -淀 粉酶包含任一 SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16。α-淀粉酶变体优选地是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T α -淀粉 酶变体。在一个实施方案中，该方法包括使用至少一种额外的酶，所述额外的酶是植酸酶、 纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡 聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡 糖苷酶、β “葡糖苷酶、卤过氧化物酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、 果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、核酸酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚 糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜聚糖酶或两种或更多种前述酶的组合。该方法优选地是淀粉降解、液化、发酵工艺、醇生产、甜味料生产、可发酵底物生 产、清洁、洗涤、污渍去除或焙烘过程等过程的一部分。在另一方面，本公开涉及用于产生可发酵糖的方法，包括a)将含有磨碎淀粉的材 料与水和稀釜馏物混合，其中稀釜馏物占10至70% v/v，并且获得包含淀粉及具有20至
干固体(ds)含量的浆液，b)用植酸酶在液化淀粉之前或与之同时处理该浆液，c) 液化该淀粉，d)在步骤b)期间和/或与液化步骤同时添加α -淀粉酶至所述淀粉和e)糖 化液化的淀粉以获得可发酵糖，其中在步骤a)、b)、c)、d)或e)的任意步骤期间不调节pH。在一些实施方案中，将可发酵糖回收和纯化或异构化。在其他实施方案中，在液化步骤之前 添加植酸酶。在其他实施方案中，α-淀粉酶随植酸酶一起添加。又在其他实施方案中，在 液化步骤期间添加第二份α-淀粉酶剂量。本文中也提供了用淀粉酶处理含淀粉材料或淀粉的方法。所述方法包括步骤将 含淀粉材料或淀粉与包含本文中所公开的至少一种α-淀粉酶变体的组合物在足以允许 α-淀粉酶的可检测活性的条件下接触；其中该变体淀粉酶是本文中公开的任意变体；并 且其中该淀粉至少部分地被该变体淀粉酶降解。在优选的实施方案中，该α-淀粉酶变体 是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体 α-淀粉酶。所述方法方便地用作淀粉降解、液化、发酵工艺、醇生产、甜味料生产、可发酵底 物生产、清洁、洗涤、污渍去除或焙烘过程等过程的一部分。附图简述

图1显示用于本文中的几种候选亲本α _淀粉酶(AmyS样淀粉酶)之间氨基酸序 列的比对结果。可以轻易地确定与来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的淀粉酶(SEQ ID Ν0:1)的 任意氨基酸位置(例如1至520)相对应的位置。SEQID NO :1，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌 “BSG”的α -淀粉酶；SEQ ID NO :2，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的截短淀粉酶(AmyS，SPEZYME XTRA) ；SEQID NO :3，嗜热脂肪土芽孢杆菌(S242A变体淀粉酶)；SEQ ID NO :4，嗜热脂肪土 芽孢杆菌(S242Q变体淀粉酶)；SEQ ID NO :5，嗜热脂肪土芽孢杆菌(S242E变体淀粉酶)； SEQ ID NO 6, Yamane 707 淀粉酶；SEQ ID NO :7，成熟的 LAT 淀粉酶；SEQ ID N0:8，地衣 芽孢杆菌野生型淀粉酶[TERMAMYL(NOVOZYMES) =TO 02/10355A2 中的 SEQ ID NO 8]； SEQ ID NO :9，解淀粉芽孢杆菌淀粉酶，BAN ；SEQ ID NO :10，STAINZYME =作为 WO 0060060 中 SEQ ID NO :2 或 US 6，528，298 中 SEQID NO 24 的 AA560 ；SEQ ID NO :11，盐敏芽孢杆菌 (B. halmapalus)淀粉酶(NATALASE) ；SEQ ID NO 12，KSM-1378 (KAO CORP.，EPl 199356 中的 SEQ ID NO 3) ；SEQ ID NO :13，芽孢杆菌属物种 KSM-K38 (KA0C0RP.，US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 4) ；SEQ ID NO 14，芽孢杆菌属物种 KSM-K36 (KAO CORP. , US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 2) ； SEQ ID NO 15，LIQUOZYME SC (N0V0ZYMES) ； SEQ ID NO :16，亲本 α -淀粉酶 共有序列#1。图 2 显示 pHPLT-AmyS 质粒。图3显示S242变体在95°C热应激30分钟后的残余活性百分数。还显示了具有羧 基端截短29个氨基酸的Δ 179-180的嗜热脂肪土芽孢杆菌阳性对照(即SEQ ID NO 2)。 线指示在野生型酶的残余活性百分数的标准差之上2倍和3倍。S242A和S242Q清晰地显 示比野生型更高的残余活性。图4 图4Α、B、C、D、Ε、F、G、H和I分别显示来自图1的几个序列的逐对比对结果 和共有序列及特征，分别显示共有序列2、3、4、5、6、7、8、9和10或SEQ ID NO :22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30。图5显示在没有钙添加的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图6显示在2mM添加的钙存在下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图7显示Spezyme Xtra和两种变体相对于Liquozyme SC在4、10和20分钟的活 性断面图。图8显示4种变体相对于S242Q变体在3个时间点的活性断面图。
图 9 显示因 30 μ g 剂量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC、Spezyme Ethyl 或 Spezyme Xtra的作用所致的谷物粉粘度降低。图10显示因30 μ g剂量的α -淀粉酶Liquozyme SC或Spezyme Xtra或两种变 体(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。图11显示因20 μ g剂量的α -淀粉酶Liquozyme SC或Spezyme Xtra或两种变 体(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。图 12 显示用 Liquozyme SC、Spezyme Xtra 或两种变体(S242A 和 S242Q)之一经 过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。喷射之前和之后的液化酶投放 量表示为“Χ+Υ”，其中-X和Y分别代表喷射之前和之后添加的酶单位数。图 13 显示用 Liquozyme SC、Spezyme Xtra 或两种变体(S242A 和 S242Q)之一经 过时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。X和Y如图12所示。图14显示用植酸酶和淀粉酶(Spezyme Xtra或S242Q变体)经过时间(0、30、60 和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。MAXALIQ是从Danisco分公司Genencor可获得的 植酸酶/淀粉酶掺合物。在全磨谷物(含有30%稀釜馏物的32% ds.谷物)、无喷射蒸煮 的低pH(5. 2)液化工艺中，在使用242Q AA的初级液化期间观察到植酸酶作用，参考实施例 8。图15显示用植酸酶和淀粉酶(例如，Spezyme Xtra或S242Q变体)经过时间(O、 30,60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。条件如图14中那样。参考实施例8。图16显示用S242Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的DE进展。条件包括含有 30%稀釜馏物，pH 5. 2的32%全磨谷物。在30分钟预温育期间，以O (对照)、1、2、4、6、9 和12FTU添加BP-17植酸酶，随后进行初级液化。初级液化期间使用的酶242Q 4AAU/gm ds谷物，温育时间是在70°C 45分钟。次级液化是在90°C 90分钟。参考实施例9。图17显示用S242Q变体和植酸酶处理的全磨谷物的喷射之后粘度。观察到移除 植酸盐对于在90°C，pH 5. 2分批液化全磨谷物期间粘度降低的影响。与植酸酶的预温育如 图16中那样。参考实施例9。图18显示植酸酶处理全磨谷物对提高S242Q变体的热稳定性和低pH稳定性的影 响。观察到低PH对全磨谷物(含有30%稀釜馏物的32% ds.谷物)液化过程的影响。三 角形，pH 5. 2 ；正方形，pH 4. 8 ；菱形，pH 4. 5 ；和圆形，pH 4. 2。参考实施例9。图19显示在全磨谷物初级液化期间添加植酸酶对喷射蒸煮后粘度降低的影响。 条件如图18中那样。白色，pH 5. 2 ；黑色，pH 4. 8 ；点划线，pH 4. 5 ；并且虚线，pH 4. 2。参 考实施例9。图20是这样的图，该图显示观察到BP-17浓度全磨谷物于pH 5. 2被S242Q变体 AA(4AAU/gds谷物)初级液化期间在90°C对DE进展速率的影响。测量了 DE进展的速率 (正方形)和植酸作为IP6的降低百分数(菱形)。图21是显示S242Q α -淀粉酶变体对常规加工条件下DE进展的影响的图。观察 了 PH对伴有喷射蒸煮的液化(32%03，30%稀釜馏物，10分钟，浆液在851+1071喷射+3 分钟停留时间+在85°C次级分批液化90分钟)中S242Q性能的影响。正方形，pH 5. 8 ；菱 形，pH 5. 5。参考实施例8。图22是这样的图，其描述使用S242Q组合电荷文库，在20°C于2倍Tide中清洁稻淀粉微量样品时，S242Q(实心圆圈)及其变体(空心圆)在北美洗衣条件下稻淀粉微量样 品测定法中作为电荷之函数的性能。参考实施例16。图23是这样的图，该图描述了使用TS23t组合电荷文库，在40°C于Persi 1中清洁 稻淀粉微量样品时，具有以下突变Q98R、M201L、S243Q、R309A、Q320R、Q359E和K444E的芽 孢杆菌属物种截短TS-23淀粉酶(实心圆)及其电荷变体(空心圆)(见2008年6月6日 提交的共同待决美国专利申请号PCT/US2008/007103)在西欧洗衣条件下稻淀粉微量样品 测定法中作为电荷之函数的性能。参考实施例16。图24是这样的图，该图描述S242Q(实心圆)及其变体(空心圆)在BODIPY-淀粉 测定法中作为电荷之函数的性能。S242Q组合电荷文库(CCL)、对BODIPY-淀粉的比活性、 标准测试条件参考实施例16。图25A是描述作为相对振摇管表达之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用(即，相 对BODIPY-淀粉水解与相对振摇管表达)的图。图25B是描述作为相对振摇管表达之函数 的相对微量样品_淀粉水解作用(即，相对微量样品_淀粉水解作用与相对振摇管表达) 的图。参考实施例19。图26A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图26B是描述作为电荷之 函数的相对BODIPY-淀粉水解作用的图。参考实施例19。图27A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图。图27B是描述作为电荷之 函数的相对微量样品清洁活性的图。参考实施例19。发明详述1.定义和缩写根据该公开，以下缩写和定义适用。应当指出如本文中所用，单数形式“一个”、“一 种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。因此，例如，对“一种多肽”的提及 包括多种此类多肽，并且对“该制剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种制剂 和其等同物的提及等。除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通 常所理解的相同意义。下文提供了以下术语。1.1. _旨写
除非另外说明，使用以下缩写
AATCC美国纺织化学师与印染师协会
ADff自动餐具洗涤；
AE脂肪醇乙氧基化物；
AEO脂肪醇乙氧基化物；
AEOS乙氧基化脂肪醇醚硫酸盐；
AES氧基化脂肪醇醚硫酸盐；
AFAU酸性真菌α-淀粉酶单位；
AGU葡糖淀粉酶活性单位；
AOSα-烯基磺酸盐；
AS醇硫酸盐；
BAA细菌α-淀粉酶；0105]V摄氏度；0106]CCL组合电荷文库；0107]cDNA互补性DNA ；0108]CMC羧甲基纤维素；0109]dE如CIE-LAB颜色空间所定义的总色差；0110]dH20去离子水；0111]dIH20Milli-Q过滤去离子水；0112]DE右旋糖等同物；0113]DNA脱氧核糖核酸；0114]dNTP三磷酸脱氧核糖核苷酸；0115]DO溶解氧；0116]DP3具有3个亚单元的聚合程度；0117]DPn具有η个亚单元的聚合程度；0118]DS (或ds)干固体含量；0119]DSC差示扫描量热法；0120]DTMPA二乙三胺五乙酸；0121]EC酶分类酶学委员会；0122]EDTA乙二胺四乙酸；0123]EDTMPA乙二胺四甲叉膦酸；0124]EO环氧乙烷；0125]eq、l/. ga. 白里；0126]ETOH乙醇；0127]F&HC织物和家居用品护理0128]FTU“植酸酶(fitase) ”单位，植酸盐水解单位；0129]g (或gm)克；0130]GAU葡糖淀粉酶单位；0131]gpg格令/加仑；0132]g/1克/升；0133]Genencor Danisco US Inc，Genencor Division,Palo Alto, CA0134]H2O水；0135]HDG重垢颗粒洗涤剂；0136]HDL重垢液体洗涤剂；0137]HFCS高果糖玉米糖浆；0138]HFSS基于高果糖淀粉的糖浆；0139]HPAEC-PAD具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；0140]hr小时；0141]IKA北卡莱罗纳州威尔明顿SE North Chase公园大街26350142]IKA Works Inc ；0143]IPTG异丙基β-D-硫代半乳糖苷；
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
0191]
0192]
0193]
0194]
0195]
0196]
0197]
0198]
0199]
0200] 0201]
百分污渍去除指数； 同时糖化和发酵； 四乙酰乙二胺；
DSC曲线的热中点或蛋白质的熔融温度；
三硝基苯磺酸； 微克；
% SRI SSF TAED T
1 m
TNBS μ g
μ 1，(yL)微升；
μ Nm 微牛顿米； μ m微米；
μM微摩尔；
U单位；
V/V体积比体积；
WE西欧；
wt % 重量百分数； w/v (或W/V)重量/体积； w/v (或ff/w)重量/重量； Wt野生型。
1.2.定义
在一些方面，本公开依赖于遗传工程和分子生物学中使用的常规技术和方法。以 下资源包括对根据本文中所公开内容有用的一般方法学的描述=Sambrook等人，MOLECULAR CLONING :A LAB0RAT0RYMANUAL (第二版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER ANDEXPRESSION ； A LABORATORY MANUAL (1990)和 AusubeI 等人，编著.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些通用参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。除非本文另外定 义，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同 意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROB10L0GY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wileyand Sons, New York(1994)禾口 Hale 与 Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向技术人员提供了本公开中所使用的众多术语的通 用字典。“分离的”意指分离的物质(例如一种化合物或序列)借助人工相对于如自然界中 存在的该化合物或序列而言被修饰。例如，分离的序列至少部分地不含或甚至基本上不含 如自然界中存在的与该序列天然关联的至少一种其他组分。当用来描述材料或物质时，“纯化的”意指该材料或物质处于相对纯的状态，例如， 至少约90%纯度，至少约95%纯度、至少约98%纯度或至少约99%纯度。如本文中所用，术语“淀粉”指包含复杂多糖的任意糖组合物，其包含具有式 (C6H10O5) x的直链淀粉和/或支链淀粉，其中X可以是任意数字。优选地，淀粉指在包括但不 限于谷粒、牧草、根状茎或根的植物中天然存在并且更具体来自小麦、大麦、谷物、燕麦、稻、 高粱、木薯(cassava)、谷子、马铃薯、甘薯和木薯的任意碳水化合物。淀粉也可以指合成性 淀粉或改性淀粉，如用作酶测定法的可检测底物的化学改性淀粉或者旨在改善一种或多种使用特性的化学改性或酶改性淀粉。如本文中所用，“植酸”(或肌醇六磷酸(IP6))是磷在多种植物组织如麸、种子等 中的主要贮藏形式。植酸在本文中也称作“植酸盐”，尤其处于盐形式时。多种其他肌醇磷 酸如肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)和肌醇三磷酸(IP3)在本文中也称作植酸盐。植 酸盐通常是人和大多数单胃动物可消化的。降解植酸盐的酶在本文中称作“植酸酶”或“植酸酶(fytase)，，并且一般是六 磷酸肌醇磷酸水解酶。植酸酶活性定义为植酸酶单位(FTU或U)，其中一个FTU定义为 在pH 5.5和37°0每分钟从0.0015!1101/1植酸钠中释放1微摩尔无机磷的酶量。该定义 提供了对植酸酶活性量的有用测量并代表一种简单的基准度量。已经鉴定并表征了酵母 (例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、异常毕赤酵(Pichia anomala)、 Arxulaadeninivorans)、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌 属的物种(Pseudomonas spp.)、克雷伯菌属某些物种(Klebsiella spp.))和革兰氏阳性 (例如芽孢杆菌属的某些物种(Bacillus spp.))的植酸盐降解酶。来自许多植物和来自 丝状真菌如青霉属某些物种(Penicillium spp.)、曲霉属某些物种(Aspergillus spp·)、 木霉属某些物种(Trichoderma spp.)、梨形毛霉(Mucor piriformis)和枝孢霉属某些物 种(Cladosporium spp.)的植酸酶也是已知的。已经根据启动水解的位点表征了 3-植酸 酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。另外，植酸酶已经基于它们的“最适pH” 表征为酸性(最适PH约5)或碱性(最适pH约9)。多种商业植酸酶是可获得的，包括 ROVABIO(Genencor International)。“淀粉酶”指能够催化淀粉底物的切割，从而导致淀粉降解或部分降解的 酶。淀粉酶通常是切割淀粉中糖苷键的水解酶。如本文中所用，淀粉酶包括任意的葡 糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶，例如芽孢杆菌属的某些物种、尤其地衣芽孢杆菌 (B. Iicheniformis)的野生型 α -淀粉酶。通常，α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ； α _D_(1 —4)-葡 聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内部—4)0-糖苷键的内切 作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2;和a-D-(l —4)-葡聚糖 麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 133)从非 还原末端切割底物淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 20 ； a-D-葡糖苷葡 萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ;a -D-(1 — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特 异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽低聚糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的野生型α -淀粉酶或“AmyS”淀粉酶在本文中有时候称作XTRA或 SPEZYME XTRA，它们是来自 GenencorInternational 的商业 AmyS 产物。如本文中所用，“AmyS样α -淀粉酶”用作本文中的亲本淀粉酶。AmyS样α-淀 粉酶基于它们之间存在的实质同源性而构成本文中的一类α-淀粉酶。“AmyS样α _淀粉 酶”意图指在氨基酸水平针对本文中具有SEQ ID NO :2中所示氨基酸序列的α-淀粉酶显 示实质同一性的α-淀粉酶类，特别地指芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其指嗜热脂肪土芽孢杆 菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) ct-淀粉酶。从 Genencor 分公司 Danisco US Inc 可商业地获得Spezyme Xtra0嗜热脂肪土芽孢杆菌已经在文献中称作嗜热脂肪芽孢杆菌 并且这二者可以在本文中互换地使用。具有本文中分别作为SEQ IDNO :1、6、7、8、9、10、11、 12、15和16所提供的氨基酸序列的全部α-淀粉酶视为AmyS样α-淀粉酶并且因而适合作为亲本α -淀粉酶。AmyS样α -淀粉酶也包括这样α _淀粉酶，其i)具有与SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示氨基酸序列至少之一具有至少60%同源性(同一 性),如至少70 %、至少75 %或至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少 97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列和/或ii)由这样的DNA序列编码，其中 所述DNA序列与编码以上所述任意α-淀粉酶的DNA序列或明显来自WO 06/002643的SEQ ID NO 9 (BAN)、5 (BSG)、3 (SP722)、1 (SP690)、7 (LAT)、11 (AA560)中或本说明书的那些 DNA 序列杂交，其编码本文分别在SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示的任意氨基 酸序列。用作AmyS样α-淀粉酶并因而用作产生本文变体的亲本酶的其他同源α -淀粉 酶还包括由ΕΡ0252666中描述的地衣芽孢杆菌菌株产生的α -淀粉酶；在WO 91/00353和 WO 94/18314中鉴定的(ATCC 27811)和α -淀粉酶。商业AmyS样α-淀粉酶包含于按以 下商品名称出售的产品中Spezyme AA 和 ULTRAPHL0W(从 Danisco US Inc, Genencor Division 可获得)和 Keistase (从 Daiwa 可获得)和 LIQUEZYME SC (从丹麦 Novozymes 可获得)。本文以下1.5部分提供了关于AmyS样α-淀粉酶的进一步信息。其中的表A 提供了几种有用AmyS样α -淀粉酶的名单以及比较彼此之间氨基酸序列同一性的便利方 法。技术人员会理解可以对其他α-淀粉酶构建相似表格以确定它们作为亲本酶在本文中 的适用性。如本文中所用，“分光光度酸性蛋白酶单位”(“SAPU”)是蛋白酶酶活性的单位，其 中ISAPU是在测定法的条件下每分钟从酪蛋白底物中释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性的量。“葡糖淀粉酶单位”(“GAU”)是解淀粉活性的度量，其定义为在ρΗ 4. 2和60°C每 小时将从可溶性淀粉底物产生Ig还原性糖(计算为葡萄糖)的酶活性的量。本文中所用，术语“变体”可以与术语“突变体”互换地使用。“变体”可以指多肽或 核酸。变体包括一个或多个序列“修饰”，其中如在本文中所用，所述的序列修饰包括相对于 参考序列在一个或多个位置处的替换、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。每种修饰可以包 括相对于参考序列导致序列中一个或多个氨基酸残基或核苷酸改变的变化。变体核酸包括 与能够同本文中所呈现核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，本文的变体核酸序列可 以与能够同本文中所呈现核苷酸序列在严格条件(例如50°C和0. 2XSSC(1X SSC = 0. 15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，ρΗ 7.0))下杂交的序列互补。更优选地，术语“变体”包括与能够 在高度严格条件(例如65°C和0. 1XSSC)下同本文中所呈现核苷酸序列杂交的序列互补的 序列。当用来描述酶时，“热稳定的”意指该酶比参考酶更为热稳定。在本申请中，如果 α -淀粉酶变体在相同实验条件(例如相同的温度、底物浓度等)下特定时间间隔后具有相 对更高的酶活性，则该变体比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶更为热稳定。备选地，与参考 酶相比，更为热稳定的酶具有由差示扫描量热法确定的更高热容量。多肽的“熔融温度”(Tm)是该多肽的构象发生可测量的温度依赖性变化的温度。蛋 白质构象和Tm可以例如通过圆二色谱法(一种最通用和最基础的研究蛋白质折叠的工具) 分析。圆二色谱测量圆偏振光的吸收。在蛋白质中，结构如α螺旋和β折叠通常具有手 性并且因而吸收圆偏振光。光吸收作用提供了蛋白质折叠程度的度量。这种吸收作用的变 化作为温度或变性剂浓度的函数可以用来研究蛋白质的平衡解折叠过程。这种类型的光谱学也可以与装置如截流混合仪(stopped flow mixer)组合来测量蛋白质折叠/解折叠的 动力学。“钙依赖的”意指特定酶需要钙以实质地展示出催化活性。一般如本文中所用，”韩 依赖的”包括严格要求双价金属离子以展示催化活性的任何酶的特性并且也包括在钙或另 一种双价阳离子存在下实质(例如超过20% )提高其催化活性的酶。如本文中所用，”pH稳定的”就酶而言可以涉及酶活性或酶的蛋白质构象。在第一 种意义下，“PH稳定的”意指酶在特定pH或在特定pH范围内保留催化活性。在第二种意义 下，酶可以视为在该蛋白质没有不可逆变性的PH处是“稳定的”。在这种情况下，该酶在回 转至能够支持催化活性的PH时会变得有催化活性。pH稳定性也可以以相对或比较性方式 使用，如相对于参考酶。在本申请中，α-淀粉酶变体可以比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉 酶更为PH稳定，当该变体比野生型具有相对更高的活性时，例如当维持在给定的pH处或在 包括PH在内的相同条件下分析时。最感兴趣的pH—般是实际使用的条件或是处在或接近 该酶保持催化活性的天然能力的界限或极限处的ΡΗ。“pH范围”意指pH值的范围，例如，从更酸至更碱或反之亦然。就酶活性而言，pH 范围表明该酶展示特定活性水平(例如最小活性、特定百分数的最大活性或特定水平的底 物转化或产物形成)的PH值上限和下限。当涉及细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，“重组”是导入异源序列或改变天然序列 的结果或已经因导入异源序列或改变天然序列而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或细 胞从如此修饰或改变的细胞衍生。因而，例如，重组细胞可以表达在该细胞的天然(非重 组)形式中不存在的基因或可以表达本来差异性表达(例如不足表达或过量表达)、异常表 达或根本不表达的天然基因。如本文中所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指两个或更多个核苷酸、核糖核苷酸 等或其衍生物的任意序列。核苷酸序列包括寡核苷酸和多核苷酸序列，以及其变体、片段、 同源物和衍生物。核苷酸序列可以是单链、双链或多链的。核苷酸序列可以来自任何来源 或起源，例如是基因组的、合成的或重组的，并且包括基因组DNA，cDNA、合成DNA和RNA等 以及其杂合体。核苷酸序列可以包含一个或多个密码子并且可以编码一种或多种多肽。核 苷酸序列可以偏好地采取一种或多种能量优选的三维结构。“载体”指经常用于体外实验用途或用于将核酸导入一种或多种细胞类型的核苷 酸序列。载体包括克隆载体、体内或体外表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体颗
粒、盒等ο如本文中所用的“表达载体”意指包含与适宜调控序列有效连接的DNA序列的DNA 构建体，其中所述的调控序列能够引起该DNA在合适宿主中的表达。此类调控序列可以包 括实施转录的启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点 的序列、增强子和控制转录及翻译终止的序列。多核苷酸或多肽与另一个序列具有某个序列同一性百分数(例如至少约80%、 85%、90%、95%或99% )意指当比对时，在比较的这两个序列中碱基或氨基酸残基是相 同的时的百分数。可以使用本领域已知的任意合适软件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. Μ.等人(编著)1987，附录30，第7. 7. 18部分)中描述的那些软 件程序确定这种比对结果和同源性或同一性百分数。此类程序可以包括GCGPileup程序、FASTA(Pearson 等人(1988)Proc. Natl，Acad. Sci USA 85 2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda，Md.和 Altschul 等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另一种比对程序是使用默认 参数的 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一种序列 软件程序是在序列软件包6. O版(Sequence Software PackageVersion 6. 0)(威斯康星州 麦迪逊威斯康辛大学Genetics Computer Group)中可获得的TFASTA数据搜索程序。本领域技术人员会认识到由本公开包括的序列也可以通过严格条件下与所例举 的amyS序列(例如WO 06/002643的SEQ ID NO 5)杂交的能力进行定义。当单链形式的 核酸可以在适宜的温度和溶液离子强度条件下与另一种核酸复性时，则该核酸可与另一种 核酸序列杂交。杂交和洗涤条件是本领域熟知的(见，例如上文的Sambrook (1989)，尤其第 9和11章)。在一些实施方案中，严格条件对应于65°C的Tm和0. 1XSSC，0. 1% SDS0“基因”指参与产生多肽并包括在编码区之前及之后的区域以及各个编码区段(外 显子)之间间插序列(内含子)的DNA区段。就多核苷酸或蛋白质而言，“异源的”指不天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋 白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业重要的工业用蛋白质。该术语意图包括由天然存 在基因、突变基因和编码异源蛋白质如融合蛋白质的核酸和/或合成基因编码的蛋白质。就多核苷酸或蛋白质而言，“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白 质。如本文中所用，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”就细胞而言使用时， 意指该细胞包含至少一种非天然(例如异源的)核酸序列。稳定转化的细胞包含至少一种 这样的核酸序列，所述核酸序列整合到细胞的基因组或整合在经多个世代仍保留的附加型 质粒中。如本文中所用，“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录 和翻译。“信号序列”意指与蛋白质的氨基端部分共价结合的氨基酸序列，所述氨基酸序列 促进该蛋白质的运输，例如促进该蛋白质的成熟形式分泌到细胞外。信号序列的定义是功 能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少(例如在分泌过程期间)被切除的信号序列。如本文中所用，术语“衍生的”包括术语“源自”、“从......获得”或“从......可
获得”和“从......分离”。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换地使用。本文中使用氨基酸残基的常规单 字母或三字母代码。“启动子”是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调节序列。启动子可以是诱导 型启动子或组成型启动子。例如，可以在本文中使用来自里氏木霉(Trichoderma reesei) 的一种诱导型启动子cbhl。“有效连接的”指这样的接近，其中诸元件处在允许它们功能性地联系的排列中， 甚至没有紧密的物理靠近。例如，如果一个启动子能够控制编码序列并且在对于该序列为 允许或诱导的条件下控制该序列转录，则该启动子与此编码序列有效连接。“选择标记”指这样的基因，该基因能够在宿主中表达并允许选择表达该标记基因 的那些宿主。选择标记的例子包括但不限于提供对抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)抗性改变的基因和/或赋予宿主细胞代谢选择性如营养优势(如在作为唯一碳 水化合物来源的特定底物上生长)的基因。在核酸序列插入细胞的上下文中，“导入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包 括对核酸序列掺入真核或原核细胞的谈及，其中所述核酸序列可以掺入该细胞的基因组 (例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的 mRNA)ο“宿主”、“宿主菌株”或“宿主细胞”意指在其中安置包含多核苷酸(例如编码变 体α-淀粉酶的多核苷酸)的表达载体或DNA构建体的合适细胞。宿主菌株优选地是细菌 细胞。在一个优选的实施方案中，“宿主细胞”意指从微生物株(例如芽孢杆菌属的某些物 种)的细胞产生的细胞和/或原生质体。术语“培养”指在合适的条件下在能够支持这种生长的培养基中培育微生物细胞 群体。在一个实施方案中，培养指将含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵性生物转化成终产物 (一般在容器或反应器中)。“发酵”由微生物分解有机物质以产生更简单的有机化合物。尽管发酵一般在主要 厌氧的条件下进行，然而意图该术语应当不限于严格厌氧条件，因为发酵也在氧存在下发 生。术语“酶转化”一般指通过酶作用修饰底物。如本文中所用的该术语也指通过酶 的作用修饰淀粉底物。如本文中所用，术语“糖化”指淀粉经酶转化成葡萄糖。术语“凝胶化”意指至少部分地增溶淀粉颗粒或分子，例如通过蒸煮以形成粘性混悬液。术语“液化”通常指淀粉转化期间淀粉至少部分地水解以产生低分子量产物例如 可溶性糊精的阶段。术语“聚合程度(DP) ”指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DPI的例子是 单糖类，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖类，如麦芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的 聚合程度的聚合物。技术人员会理解具有更大DE的化合物是更为聚合的。“终产物”或“所需终产物”指酶反应的任意预期产物，例如从淀粉底物以酶方式转 化而来的淀粉衍生分子。如本文中所用，“干固体含量” (ds)指基于干重量的以％表示的浆液总固体。术语 “浆液”指含有不溶性固体的含水混合物。术语“残余淀粉”指含淀粉的底物发酵后组合物中留下的任何残留(可溶性或不 可溶性)淀粉。“再循环步骤”指糖化醪组分的再循环，所述的糖化醪组分可以包括残余淀粉、发 酵包含淀粉的酶和/或微生物。术语“糖化醪(mash) ”指水中用来产生发酵产物如醇的可发酵碳源(碳水化合物) 的混合物。在一些实施方案中，术语“发酵醪(beer)”和“糖化醪”可互换地使用。“釜馏物”意指未发酵的固体与水的混合物，如从发酵的糖化醪去除醇后的残余 物。术语“蒸馏器干酒糟(DDG) ”和“具有可溶物的蒸馏器干酒糟(DDGS) ”指谷物发酵的有用副产物。如本文中所用，“产乙醇微生物”指具有将糖(例如单糖、二糖、低聚糖或多糖)转 化成乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物因其表达单独地或共同将糖转化成乙醇的一种或 多种酶的能力而具有产乙醇性。如本文中所用，“乙醇生产者”或“产乙醇生微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇 的任何生物或细胞。通常，产乙醇细胞含有醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的例 子包括真菌性微生物如酵母。如本文中所用，“比活性”意指一种酶单位，其定义为在特定条件下每单位时间由 酶制剂转换成产物的底物的摩尔数。比活性表示为单位(U)/单位重量的蛋白质，一般是U/ mg蛋白质。“产量”指使用本公开的方法所产生的终产物或所需终产物的量。在一些实施方案 中，该产量大于使用本领域已知方法所产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终产物的 体积，并且在其他实施方案中，该术语指终产物的浓度。如本文中所用，“生物学活性的”指对生物系统例如细胞、器官或生物具有可测量 的影响的化合物或序列。“ATCC”指位于弗吉尼亚州Manassas 20108的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。“NRRL”指美国伊利诺伊州皮奥里亚县，国家农业应用研究中心，农业研究培养物 保藏中心(并且以前称为USDA北部地区研究实验室)。本文中所用，“食物”意指向包括人在内的动物提供营养价值的任意成分、组分或 组合物。如本文中所用，按惯例，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语一 般用斜体(例如，编码amyL(地衣芽孢杆菌AA)的基因可以表示为amyL)。用于蛋白质的术 语一般不用斜体并且首字母通常大写(例如，由amyL基因编码的蛋白质可以表示为AmyL 或amyL)。除非另外说明，分别将核酸序列从左至右以5’至3’方向显示并将氨基酸序列从 左至右以氨基至羧基方向显示。如本文中所用术语“包含”及其关联词以其包含......在内的意义使用；即，等同
于术语“包括”及其对应的关联词。数字范围包括定义该范围的数字在内。本文中提供的标题不限制所公开的多个方面或实施方案。尽管可以在实施或检验所公开的内容中使用与本文中所述的那些方法和材料相 似或等同的任意方法和材料，然而描述了某些当前优选的方法和材料而不意图使实施者限 于所描述的任何具体方法、方案和试剂，因而这些可以变动。通过引用的方式明确并入本文 中所参考的全部专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的全部序列。2.命名在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。出于 引用方便，α-淀粉酶变体通常地由以下命名描述原始氨基酸位置替换的氨基酸根据这种命名，例如将第242位置处用丙氨酸替换丝氨酸显示为Ser242Ala 或 S242A将第30位置处的丙氨酸缺失显示为
Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且将额外氨基酸残基如赖氨酸的插入显示为
Ala30AlaLys 或 A30AK。氨基酸残基连续区段(如氨基酸残基30-33)的缺失显示为(30-33) *或 Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶与其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在该位置内产生插入 的情况下，对于在第36位置插入天冬氨酸而言，这表示为* 36Asp 或 * 36D多个突变由加号隔开，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中将丙氨酸和谷氨酸分别替换为天冬氨酸和丝氨酸的突变。当可以在给定位置插入一个或多个备选氨基酸残基时，它表示为A30N, E 或备选地，A30N 或 A30E。另外，当本文中鉴定到适合修饰的位置而不指出任何具体的修饰时，应当理解任 意氨基酸残基可以替换该位置内存在的氨基酸残基。因而，例如，当提到修饰在第30位置 处的丙氨酸，但不具体说明时，应当理解该丙氨酸可以缺失或替换为任何其他氨基酸，即， 以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另夕卜，“Α30Χ”意指以下的任一替换A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或简写为A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于编号的亲本酶已经在该位置处具有建议替换的所讨论氨基酸残基，则在 例如N或V之一存在于野生型中的情况下使用以下命名“X30N”或“X30N，V”。这表明其他相应的亲本酶在位置30被替换成“Asn”或“Val”。3.氨基酸残基的特征带电荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His带负电荷的氨基酸(负电荷最多的残基排在首位)Asp、Glu带正电荷的氨基酸(正荷最多的残基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸残基(疏水性最强的残基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，亲水性氨基酸(亲水性最强的残基排在最后)Thr、Ser、Cys、Gin、Asn04. α-淀粉酶和AmyS样淀粉酶4. 1多种α -淀粉酶的氨基酸同一性
由芽孢杆菌属某些物种产生的多种α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的并且可以用作本文中的亲本酶。可以在下表A中找到多种已知芽孢杆菌α-淀粉酶相互 之间的同一性百分数(基于氨基酸序列)。表A 几种已知芽孢杆菌α -淀粉酶的氨基酸序列同一性 技术人员将理解可以从文献或通过本文中公开的或本领域已知的任意方法确定 同一性百分数。例如，已经发现地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT) (SEQ ID NO 7)与解淀 粉芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 9)约81 %同源并且与嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀 粉酶(BSG) (SEQ ID NO :1)约65%同源。其他同源α -淀粉酶包括WO 95/26397中公开 的 SP690 禾口 SP722，以及由 Tsukamoto 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988)，第25-31页描述的从芽孢杆菌属某些物种衍生的#707 α -淀 粉酶(SEQ ID NO 6)。KSM ΑΡ1378 α -淀粉酶在W 97/00324中公开(来自KAO公司)。4. 2亲本α -淀粉酶如上文定义的AmyS样α -淀粉酶可以作为亲本α -淀粉酶使用。在一个优选的实 施方案中，亲本α -淀粉酶从嗜热脂肪土芽孢杆菌(例如上文引用的那些嗜热脂肪土芽孢 杆菌之一)衍生，如具有SEQ ID NO :1或2中所示氨基酸序列的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀 粉酶。4. 3亲本杂合α -淀粉酶亲本α -淀粉酶(即主链α -淀粉酶)也可以是杂合α -淀粉酶，即包含从至少 两种α-淀粉酶衍生的部分氨基酸序列的组合的α-淀粉酶。亲本杂合α-淀粉酶可以是一种这样的α-淀粉酶，其中可以基于(如上文所定 义的)氨基酸同源性(同一性)和/或DNA杂交确定所述α -淀粉酶属于上文描述的AmyS 样α-淀粉酶家族。在这种情况下，杂合α-淀粉酶一般由AmyS样α-淀粉酶的至少一个 部分和选自微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的AmyS样α -淀粉酶或非AmyS样α-淀粉酶的一种或多种其他α-淀粉酶的部分组成。因而，亲本杂合α -淀粉酶可以包含从至少两种AmyS样α -淀粉酶或从至少一种 AmyS样和至少一种非AmyS样细菌α -淀粉酶或从至少一种AmyS样和至少一种真菌α-淀 粉酶衍生的部分氨基酸序列的组合。衍生部分氨基酸序列的AmyS样α-淀粉酶可以是本 文中所引用的任意的特定AmyS样α-淀粉酶。例如，亲本α-淀粉酶可以包含从地衣芽孢杆菌菌株衍生的α-淀粉酶的羧基端 部分和从嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株或从嗜热脂肪土芽孢杆菌(BSG)菌株衍生的α _淀粉酶 的氨基端部分。5.同源性(同一性)同源性可以作为两个序列之间的同一性程度确定，表示彼此之间的关系，例如，第 一序列从第二序列衍生或反之亦然。同源性可以通过视检或手工计算确定，不过更便利地 借助本领域已知的计算机程序如在(上文描述的)GCG程序包中提供的一种程序GAP确定。 因而，可以使用Gap GCGvS，例如采用同一性的默认评分矩阵和以下默认参数对于核酸序 列比较而言，空位创建罚分5. 0和空位延伸罚分0. 3，并且对于蛋白质序列比较而言，空位 创建罚分 3.0 和空位延伸罚分 0. 1。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch，(1970), J. Mol. Biol. 48 443-453的方法以产生比对结果并计算同一性。在Spezyme Xtra(SEQ ID NO 2)与例如另一种α -淀粉酶之间的结构性比对结果 可以用来鉴定其他AmyS样α-淀粉酶中的等同/对应位置。获得所述结构性比对结果的 一种方法将是使用来自GCG软件包的Pile Up程序，利用空位罚分的默认值，S卩，空位创建 罚分3. 0和空位延伸罚分0. 1。其他结构性比对方法包括疏水簇分析法(Gaboriaud等人， FEBS Lett. 224 149-155，1987)和反向穿线法(reverse threading) (Huber,T ；Torda,AE, Protein Sci. 7(1) 142-149，1998)。6.杂交在表征以上AmyS样α -淀粉酶中使用的寡核苷酸探针可以基于所讨论α -淀粉 酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列适宜地制备。评估杂交的合适条件涉及在5Χ SSC中预浸泡并在40°C于20%甲酰胺，5Χ Denhardt溶液，50mM磷酸钠，pH 6. 8和50mg超声处理的变性小牛胸腺DNA的溶液中预杂 交1小时，随后在40°C于补充有IOOmMATP的相同溶液中杂交18小时，随后在40°C (低 严格性)、优选地在50°C (中等严格性)、更优选地在65°C (高严格性)、甚至更优选地在 750C (非常高严格性)于2X SSC，0.2% SDS中洗涤滤膜3次，30分钟。关于杂交方法的 更多细节可以在 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory ManuaL，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 中找到。在本上下文中，“从......衍生”不仅意图指由所讨论的生物菌株产生或可产生
的α "淀粉酶，还指由分离自该菌株的DNA序列编码并在用所述DNA序列转化的宿主生物 中产生的α-淀粉酶。最后，该术语意图指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有 所讨论α-淀粉酶的鉴别性特征的α-淀粉酶。该术语意图表明亲本α-淀粉酶可以是天 然存在α-淀粉酶的变体，即这样的变体，它是修饰(插入、替换、缺失)天然存在α-淀粉 酶的一个或多个氨基酸残基的结果。7.变体α -淀粉酶中的一般突变
在一个实施方案中，除了上文概述的那些修饰之外，本文中所述的变体还可以包 含一个或多个修饰。因而，可能有利的是将被修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个 或多个脯氨酸残基(Pro)替换为非脯氨酸残基，其中所述的非脯氨酸残基可以是可能的、 天然存在的非脯氨酸残基中的任一氨基酸残基，并且优选地是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或亮氨酸。类似地，在一个实施方案中，可以将亲本α-淀粉酶中存在的一个或多个半胱氨 酸残基替换为非半胱氨酸残基，如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸。应当理解所述变体可以掺入两个或更多个上文所概述的修饰。另外，可能有利的是在一个或多个以下位置(使用SEQ ID NO 7用于编号)导入 突变M15、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下 的单一、二重、三重或多重突变M15X，尤其 M15T，L ；V128X，尤其 V128E ；H133X，尤其 H133Y ；N188X，尤其 N188S，T，P ；M197X,尤其 M197T, L ；A209X，尤其 A209V ；M197T/W138F ；M197T/138Y ；M15T/H133Y/N188S ；M15N128E/H133Y/N188S ；E119C/S130C ；D124C/R127C ；H133Y/T149I ；G475R, H133Y/S187D ；H133Y/A209V。在亲本α-淀粉酶具有SEQ ID No. 7中所示氨基酸序列的情况下，可以被缺失 或替换以改善氧化稳定性的相关氨基酸残基包括SEQ ID NO :2中的单一半胱氨酸残基 (C363)和位于] 8、]\19、]\196、]\1200、]\1206、]\1284、]\007、]\011、]\016 和 Μ438 位置内的甲硫氨酸残基。就提高α -淀粉酶变体相对于其亲本α _淀粉酶的热稳定性而言，似乎特别希望 在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列中缺失至少一个并且优选地缺失2个或甚至3个以下 氨基酸残基F178、R179、G180、1181、G182 和 K183。特别感兴趣地，这种类型的成对缺失是R179 * +G180 * ；和1181 * +G182 * (分别是 SEQ ID No. 16或15)(或在满足本公开上下文中亲本α -淀粉酶要求的另一个α -淀粉酶 中这些成对缺失的等同物)。其他目的残基包括SEQ ID No. 2中所示氨基酸序列的N193F和V416G。8.变体的改变特性8. 1 概述以下部分描述突变之间的关系，其中所述突变存在于本文中所述的变体中并且是 可以从其产生(相对于亲本AmyS样α-淀粉酶的那些特性而言)想要的特性改变。本文中描述了具有改变特性的AmyS样α -淀粉酶。本文中具体构思的亲本α -淀 粉酶是AmyS样α -淀粉酶和亲本杂合AmyS样α -淀粉酶。在一个实施方案中，使用嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 2)作为起点，但是在其他实施方案中，可以使用SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSM AP1378、#707和 其他芽孢杆菌属α-淀粉酶。据此轻易地确定与SEQ ID NO :2中的位置相对应的氨基酸位置。技术人员会了解尽管出于编号/鉴定特定变体中已修饰及待修饰的氨基酸残基 的目的，可能使用任意亲本α-淀粉酶作为参考淀粉酶，然而SEQID Ν0:1是目前为此目的 优选序列，因为它是本文目前可获得的最长嗜热脂肪芽孢杆菌序列。在一个方面，本公开涉及了具有改变特性(例如，如上所述特性)的变体。在其几个方面之一，本公开提供了亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的变体， 该变体在选自(使用例如SEQ ID Ν0:1用于氨基酸编号的)以下位置的一个或多个位置处 包含改变P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、 S124、D125、N127、I130、G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、 P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474、R483，其中(a)所述改变独立地是在占据该位置的氨基酸下游插入氨基酸；(ii)缺失占据该 位置的氨基酸；或(iii)用不同的氨基酸替换占据该位置的氨基酸，(b)该变体具有α -淀粉酶活性，并且(c)每个位置对应于亲本淀粉酶(例如嗜热脂肪土芽孢杆菌α -淀粉酶(例如具 有SEQ ID Ν0:2中所示的氨基酸序列))的氨基酸序列的位置，所述亲本淀粉酶例如是作为 来自Genencor的SPEZYME XTRA可商业获得的截短α -淀粉酶。本文中具体构思了 S242A、S242Q、S242N和S242E变体。额外地，选择残基R179、G180、1181、G182和Κ183以探索钙-钠结合区中突变的 作用并且因为在α -螺旋中央的脯氨酸是不寻常的，故选择Ρ245。可以通过如上所述的比对，例如，如与图4中比对结果中所示的那些序列比对找 到其他亲本AmyS样α-淀粉酶中的对应位置。因而，本文中构思了在以上列举的位置(使 用例如SEQ ID NO :1用于比较性氨基酸编号)处包含改变的亲本AmyS样α -淀粉酶的变 体。8. 2改变的特性稳定性在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的稳定性、尤其改善的稳定性(即更 高或更低)，在尤其高的温度(即约70-120°C )和/或极端pH(即低或高pH，即分别是pH 4-6或pH 8-11)，尤其在低于60ppm的游离(即未结合的，因而溶液中的)钙浓度而言，重 要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。可 以如下文“方法”部分中所述确定稳定性。8. 3改变的特性Ca2+稳定性改变的Ca2+稳定性意指已经相对于亲本酶而改善酶在Ca2+耗竭下的稳定性，S卩，更 高或更低的稳定性。在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的Ca2+稳定性、尤其改善的 Ca2+稳定性，S卩，更高或更低的稳定性，尤其在高pH(即pH 8-10.5)而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。8. 4改变的特性比活性在又一方面，就获得变体而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改 变的特性”部分中所列出的任意突变，其中所述的变体展示改变的比活性，尤其提高或降低 的比活性，尤其在10-60°C的温度、优选20-50°C、尤其30-40°C。可以如下文“方法”部分中 所述确定比活性。8. 5改变的特性氧化稳定性与亲本α-淀粉酶相比，所描述的变体可以具有改变的氧化稳定性，尤其是更高 的氧化稳定性。提高的氧化稳定性在例如洗涤剂组合物中是有利的，并且降低的氧化稳定 性可能在意图用于淀粉液化的组合物中是有利的。可以如下文“方法”部分中所述确定氧 化稳定性。8. 6改变的特性改变的ρΗ谱就获得变体而言，重要的位置和突变包括靠近活性中心残基存在的氨基酸残基的 突变，其中所述变体具有改变的PH谱，特别地在尤其高的ρΗ(即ρΗ 8-10. 5)或低的ρΗ(即 PH 4-6)时改善的活性。优选的特定突变/替换包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位置列出的那 些突变/替换。在下文“方法”部分中描述合适的测定法。8. 7改变的特性洗涤性能就获得变体而言，重要的位置和突变包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位 置列出的特定突变/替换，其中所述变体在尤其高的ΡΗ(即ρΗ8. 5-11)时具有改善的洗涤 性能。可以如下文“方法”部分中所述测试洗涤性能。9.制备α-淀粉酶变体的方法如用于α -淀粉酶编码性DNA序列的克隆方法那样，用于导入突变至基因中的方 法是本领域已知的。将在下文讨论此类方法，包括用于在α-淀粉酶编码序列内部特定位 点处产生突变的方法。9. 1克隆编码α -淀粉酶的DNA序列编码亲本α -淀粉酶的DNA序列可以使用本领域熟知的各种方法从产生所讨论 α-淀粉酶的任意细胞或微生物分离。首先，应当使用来自产生待研究α-淀粉酶的生物的 染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该α -淀粉酶的氨基酸序列 是已知的，则可以合成并使用同源的标记寡核苷酸探针以从基因组文库鉴定编码α-淀粉 酶的克隆，其中所述的基因组文库从所讨论生物制备。备选地，可以使用含有与已知α-淀 粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针作为探针来鉴定编码α-淀粉酶的克隆，例如使 用低严格性的杂交和洗涤条件。用于鉴定编码α _淀粉酶的克隆的另一种方法是基于将基因组DNA片段插入表达 载体如质粒，用所得基因组DNA文库转化α -淀粉酶阴性细菌并将转化的细菌涂布在含有 α -淀粉酶底物的琼脂上，因而允许轻易地鉴定表达α -淀粉酶的克隆。备选地，编码所述酶的DNA序列可以通过已建立的标准方法合成地制备，例如 S. L. Beaucage 禾口 Μ. H. Caruthers,Tetrahedron Letters 22 1859-1869 (1981)描述的亚磷 酰胺法或Matthes等人，EMBO J. 3 :801_895 (1984)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，将寡核苷酸合成，例如在自动DNA合成仪中，纯化、复性、连接和在适宜载体中克隆。最后，DNA序列可以是混合来源的，包含例如根据标准技术，通过连接合成的、基因 组的或cDNA来源的片段(根据需要，与整个DNA序列的多个部分相对应的片段)制备的基 因组序列和合成序列、合成序列和cDNA序列或基因组序列和cDNA序列。DNA序列也可以通 过使用特异性引物的聚合酶链反应(PCR)，例如在美国专利号4，683，202或R. K. Saiki等人 EMBO J. 3 =801-895(1988)中所述的 PCR 制备。9. 2位点定向诱变—旦已经分离编码α -淀粉酶的DNA序列并鉴定了用于突变的所需位点，则可以 使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有分布在所需突变位点侧翼的核苷酸序 列；将突变核苷酸在寡核苷酸合成期间插入。在一个具体方法中，在携带α-淀粉酶基因 的载体中产生跨接编码α-淀粉酶的序列的DNA单链缺口。随后，携带所需突变的合成性 核苷酸与单链DNA的同源部分复性。剩余缺口随后用DNA聚合酶1(克列诺片段)补平 并使用Τ4连接酶连接构建体。这种方法的具体例子在Morinaga等人Biotechnology 2 636-639(1984)中描述。美国专利号4，760，025公开了通过表达盒的微小改变而导入编码 多重突变的寡核苷酸。然而，可以通过Morinaga方法在任一时间导入甚至更多种类的突 变，原因在于可以导入长度各异的许多寡核苷酸。在Nelson 和 Long, AnalyticalBiochem.，180 147-151 (1989)中描述了将突变导 入编码α-淀粉酶的DNA序列的另一种方法。该方法涉及含有所需突变的PCR片段的3-步 骤生成，其中所需突变通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一导入。携带 突变的DNA片段可以从PCR生成的片段通过用限制性核酸内切酶切割进行分离并重新插入 表达质粒。技术人员会了解许多备选方法可用于提供或获得本文中的变体。例如，基因改 组，例如，如 WO 95/22625 (来自 Affymax Technologies N. V.)或 WO 96/00343 (来自 Novo Nordisk A/S)中所述，或产生包含所讨论突变例如替换和/或缺失的杂合酶的其他相应技 术。9.3α-淀粉酶变体的表达可以使用表达载体以酶形式表达编码由上文所述方法或由本领域已知的任意备 选方法产生的变体的DNA序列，其中所述表达载体一般包括编码启动子、操纵基因、核糖体 结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或多种激活基因的调控序列。携带编码用于本文中的α -淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以任意载 体，其可以便利地经历重组DNA过程，并且载体的选择经常取决于待导入该载体的宿主细 胞。因而，载体可以是自主复制型载体，即作为其复制不依赖染色体复制的染色体外实体存 在的载体，例如，质粒、噬菌体、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。备选地，载体可以 整合到宿主细胞基因组中并随已经整合有该载体的染色体一起复制。在载体中，所述DNA序列应当有效连接于合适的启动子序列。该启动子可以是在 所选宿主细胞中显示转录活性的任意DNA序列并可以从编码与该宿主细胞同源或异源的 蛋白质的基因衍生。用于指导编码用于本文中的α-淀粉酶变体的DNA序列转录、尤其在 细菌宿主中转录的合适启动子的例子是大肠杆菌Iac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂 糖酶基因dagA的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪土芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α -淀粉酶(amyQ)的启动子、 枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用启动子的例子 是从编码稻曲霉(A.oryZae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米 黑根毛霉脂肪酶、稻曲霉碱性蛋白酶、稻曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙 酰胺酶的基因衍生的那些启动子。用于本文中的表达载体也可以包含合适的转录终止子和在真核生物中与编码 α -淀粉酶变体的DNA序列有效连接的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可以 适宜地从与启动子相同的来源衍生。载体可以还包含能够使该载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列 的例子是质粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的复制起点。载体也可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞中缺陷的基因，如来自枯草 芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素 或四环素抗性的基因。另外，该载体可以包含曲霉属选择标记如amdS、argB、niaD和sC、产 生潮霉素抗性的标记，或可以通过共转化实现选择，例如，如WO 91/17243中所述。尽管胞内表达可以在一些方面是有利的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时， 然而通常优选表达是胞外的。通常，本文中提到的芽孢杆菌属α-淀粉酶包含允许所表达 的蛋白酶分泌到培养基中的前区域。根据需要，这种前区域可以被不同的前区域或信号序 列替换，便利地通过替换编码各自前区域的DNA序列实现。本领域技术人员熟知用来连接分别编码α -淀粉酶变体、启动子、终止子和其他 元件的DNA构建体并将这些DNA构建体插入含有复制必需信息的合适载体的方法(参参 见例如 Sambrook 等人，MOLECULARCLONING :A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor,1989)。用于本文中的细胞，例如包含如上文定义的DNA构建体或表达载体的细胞，可以 在α-淀粉酶变体的重组产生中用作宿主细胞。细胞可以用编码变体的DNA构建体转化， 便利地通过在宿主染色体中整合(一个或多个拷贝的)DNA构建体。通常认为这种整合是 有利的，因为DNA序列更有可能稳定地维持于细胞中。可以根据常规方法例如通过同源或 异源重组将DNA构建体整合到宿主染色体中。备选地，细胞可以用与不同类型宿主细胞有 关的如上所述表达载体转化。用于本文中的细胞可以是高等生物如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选地是微生物 细胞，例如细菌细胞或真菌(包括酵母)细胞。合适细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆 菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环 形芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌或变 铅青链霉菌或鼠灰色链霉菌；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。细菌的转化可以例如通过原 生质体转化或通过使用感受态细胞以本身已知的方式实施。在被用于表达的情况下，酵母可以有利地选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵 母属(Schizosaccharomyces)物种，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。丝状真菌 可以有利地选自曲霉属物种，例如稻曲霉或黑曲霉。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成和原生质体转化随后细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属宿主细胞 的合适方法在EP238023中描述。在又一方面，本公开涉及产生α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括在促进变体 产生的条件下培育如上文所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基回收该变体。用来培育细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞并获得α -淀粉酶变 体表达的任何常规培养基。合适的培养基是从商业供应商可获得的或可以根据公开(例 如，如ATCC目录中所述)的配方制备。从宿主细胞分泌的α -淀粉酶变体可以通过已知方法从培养基回收，所述的已知 方法包括通过离心或过滤将细胞与培养基分离并借助盐(如硫酸铵)析出培养基的蛋白质 组分，随后使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。9. 4用于表征和筛选变体的方法9. 4. 1滤纸筛选测定法以下测定法可以用来筛选在高或低ρΗ和/或在Ca2+耗竭条件下与亲本酶和AmyS 样α-淀粉酶相比具有改变的稳定性的AmyS样α _淀粉酶变体。9. 4. 2高ρΗ滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含10yg/ml卡那霉素的TY琼脂平板上的乙酸纤维素 滤纸(OE 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德国)和硝化纤维素滤纸(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德国)的夹层上，在37°C持续至少21小时。乙酸纤维素层 位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上的 阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有PH 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH缓 冲液的容器并在室温(可以从10-60°C变化)温育15分钟。将带有菌落的乙酸纤维素滤纸 在室温贮存于TY-平板上，直至使用。温育后，在ρΗ 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH缓冲液中含有
琼脂糖，0. 2%淀粉的平板上检测残余活性。将带有硝化纤维素滤纸的测试平板以与滤 纸夹层相同的方式标记并在室温温育2小时。在取出滤纸后，测试平板用10%路戈尔碘液 染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背景上的白点并且随后在贮存平板上鉴定它们。阳 性变体在与第一次筛选相同的条件下重新筛选2次。9. 4. 3低钙滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含相关抗生素例如卡那霉素或氯霉素的TY琼脂平板 上的乙酸纤维素滤纸(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德国)和硝化纤维素滤纸 (Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)的夹层上，在 37°C持续至少 21 小时。 乙酸纤维素层位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上的 阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有PH 8. 5-10并具有不同EDTA浓 度(0. OOlmM-IOOmM)的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的容器。滤纸在室温温育1小时。将带有 菌落的乙酸纤维素滤纸在室温贮存于TY-平板上，直至使用。温育后，在ρΗ 8. 5-10碳酸盐 /碳酸氢盐缓冲液中含有琼脂糖，0.2%淀粉的平板上检测残余活性。将带有硝化纤维 素滤纸的测试平板以与滤纸夹层相同的方式标记并在室温温育2小时。在取出滤纸后，测 试平板用10 %路戈尔碘液染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背景上的白点并且随后在贮存平板上鉴定它们。阳性变体在与第一次筛选相同的条件下重新筛选2次。9. 4.4低pH滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含10微克/ml氯霉素的TY琼脂平板上的乙酸纤维素 滤纸(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德国)和硝化纤维素滤纸(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dasseli，德国)的夹层上，在37°C持续至少21小时。乙酸纤维素层 位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上的 阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有柠檬酸盐缓冲液，PH4. 5的容器 并在80°C温育20分钟(当筛选野生型主链中的变体时)或在85°C温育60分钟(当筛选 亲本α _淀粉酶的变体时)。将带有菌落的乙酸纤维素滤纸在室温贮存于TY-平板上，直至 使用。温育后，在PH 6.0柠檬酸盐中含有琼脂糖，0.2%淀粉的测试平板上检测残余活 性。将带有硝化纤维素滤纸的测试平板以与滤纸夹层相同的方式标记并在50°C温育2小 时。在取出滤纸后，测试平板用10%路戈尔碘液染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背 景上的白点并且随后在贮存平板上鉴定它们。阳性变体在与第一次筛选相同的条件下再筛 选2次。9. 4. 5 次筛选在重新筛选后，将阳性转化体从贮存平板挑出并在二次平板测定法中测试。阳性 转化体在37°C于5mL LB+氯霉素中生长22小时。在90°C于pH 4. 5柠檬酸盐缓冲液中温 育每个阳性转化体和作为对照的表达相应主链的克隆的芽孢杆菌培养物并且在0、10、20、 30,40,60和80分钟取得样品。将3 μ L样品滴在测试平板上。测试平板用10%路戈尔碘 液染色。改良变体视为比主链具有更高残余活性的变体(检测为测试平板上的晕圈)。通 过核苷酸测序确定改良的变体。9. 4. 6未纯化变体的稳定性测定法变体的稳定性可以如下测试将表达待分析变体的芽孢杆菌培养物在37°C于含 有氯霉素的IOmL LB中生长21小时。将800微升培养物与200微升pH 4. 5柠檬酸盐缓冲 液混合。在PCR管中制得与样品时间点编号相对应的许多70 μ L等份试样并在PCR仪中在 70°C或90°C温育多个时间段(一般5、10、15、20、25和30分钟)。0分钟样品不在高温上 温育。如下文“ α -淀粉酶活性测定法”中所述，通过转移20微升至200微升α -淀粉酶 PNP-G7底物MPR3((Boehringer Mannheim目录号1660730)测量样品中的活性。结果作为 活性(相对于0时间点)百分数对时间作图或表述为温育某段时间后的残余活性百分数。9.4.7α-淀粉酶变体的发酵和纯化携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株可以如下发酵和纯化将菌株从-80°C贮 藏物划线于含有 ο μ g/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上并在37°C过夜生长。将菌落转移至 500mL摇瓶中补充有10 μ g/ml氯霉素的IOOmLPS-I 培养基。PS-I培养基的组成珍珠糖100g/l大豆粕40g/lNa2HPO4,12H2010g/l
Pluronic PE 6100 0. lg/1CaCO35g/l培养物在37 °C以270转/分钟振摇5日。通过以4500转/分钟离心20-25分钟从发酵肉汤除去细胞和细胞碎片。此后，过 滤上清液以获得完全清亮的溶液。将滤液浓缩并在UF-滤器(10000截止值膜)上洗涤并 且将缓冲液换成20mM乙酸盐pH 5.5。在S-SEPHAR0SE F. F.上施加UF-滤液并通过逐步洗 脱法用相同缓冲液中的0. 2M NaCl实施洗脱。洗脱液对pH 9. 0的IOmM Tris透析并施加 在Q-SEPHAR0SE F. F.上并且用从0-0. 3M NaCl的线型梯度经6个柱体积洗脱。汇集含有 (由PHADEBAS测定法测量的)活性的级分，将pH调节至pH 7. 5并且通过用0. 5% w/v活 性碳处理5分钟除去剩余颜色。9. 4. 8比活性测定使用PHADEBAS 测定法(Magle Life Sciences)，测定比活性为活性/mg 酶。遵循制造商说明实施(也见下文“α-淀粉酶活性测定法”)。9. 4. 9等电点的确定pi 由等点聚焦法(例如，Pharmacia, Ampholine, pH 3. 5-9. 3)确定。9.4. 10稳定性的确定可以使用如下方法测量淀粉酶稳定性在相关条件下温育酶。样品在各个时间点取得，例如在0、5、10、15和30分钟后， 并在测试缓冲液(50mM Britton缓冲液，pH 7.3)中稀释25倍(相同稀释度用于全部取得 的样品)并使用PHADEBAS测定法(MagleLife Sciences)在标准条件pH 7. 3，37°C下测量活性。使用在温育前(0分钟)测量的活性作为参考(100% )。将下降百分数计算为温 育时间的函数。表显示了在例如温育30分钟后的残余活性。9. 4. Ila-淀粉酶活性测定法1. PHADEBAS 测定法a -淀粉酶活性由使用PHADEBAS 小片作为底物的方法确定。PHADEBAS小 片(PHADEBAS 淀粉酶试验，由Magle Life Sciences供应)含有交联的不溶性蓝 颜色淀粉聚合物，该聚合物已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并造片。对于每个单一测量，将一个小片悬浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson缓冲 液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0. ImMCaCl2,用NaOH调节pH至目的值)的管中。试 验在目的温度的水浴中进行。在50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释待测试的α -淀粉 酶。将1毫升这种α -淀粉酶溶液添加至5mL的50mM Britton-Robinson缓冲液。淀粉被 α -淀粉酶水解，产生可溶性蓝色片段。以分光光度方式在620nm测量的所得蓝色溶液的吸 光度是α-淀粉酶活性的函数。重要的是在温育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm处 的0. 2至2. 0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，活性与吸光度之间存在线性关系 (Lambert-Beer定律)。因而必须调整的酶的稀释度以符合这个标准。在指定的条件集合 (温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，Img给定的α-淀粉酶会水解某个量的底物，并且蓝 颜色会产生。在620nm测量颜色强度。测量的吸光度与给定条件集合下所讨论的α -淀粉酶的比活性(活性/mg纯α -淀粉酶蛋白)直接成比例。2.备选方法α -淀粉酶活性由使用PNP-G7底物的方法确定。作为对硝基苯基- α，D-麦芽 庚糖苷缩写的PNP-G7是可以被内切淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，该试剂盒中包含 的α-葡糖苷酶消化此底物以释放具有黄颜色并因而可以通过可见光分光光度法在λ = 405nm (400-420nm)测量的游离PNP分子。含有PNP-G7底物和α -葡糖苷酶的试剂盒由 Boehringer-Mannheim 制造(目录号 1054635)。为制备试剂溶液，如制造商推荐，将IOmL底物/缓冲液添加至50mL酶/缓冲液。 通过转移20微升样品至96孔微量滴定平板并在25°C温育实施该测定法。添加预平衡至 250C的200 μ L试剂溶液。将溶液混合并预温育1分钟并且在ELISA读数仪中在OD 405nm 在4分钟范围内每隔30秒测量吸收。时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件集合下所讨论的α -淀粉酶的活性直接 成比例。9. 4. 12LAS敏感性的确定变体在40°C与不同浓度的LAS (直链烷基苯磺酸盐；Nansa 1169/P)温育10分钟。使用PHADEBAS 测定法或利用PNP-G7底物的备选方法确定残余活性。在0. IM磷酸盐缓冲液pH 7. 5中稀释LAS。使用以下浓度500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm 和 IOppm 直至无 LAS。将变体在不同LAS缓冲液中稀释成IOmL总体积中的0. 01_5mg/l浓度并在温控水 浴中温育10分钟。通过转移小等份试样至冷的测试缓冲液中停止温育。重要的是在活性测 量期间，LAS浓度低于lppm，目的是不影响活性测量。使用上文提及的PHADEBAS 测 定法或备选方法一式两份确定残余活性。在扣除空白后测量活性。无LAS的活性是100%。10.使用淀粉酶变体的方法工业应用本文中呈现的α -淀粉酶变体具有允许多种工业应用的有价值特性。本文中所述 的一种或多种变体酶或组合物也可以如上所述在洗涤剂、尤其衣物洗涤剂组合物和餐具洗 涤剂组合物、硬表面清洁组合物中使用并在用于纺织品、织物或服装退浆的组合物、用于纸 浆和纸张生产、发酵醪制备、乙醇生产和淀粉转化工艺的组合物中使用。一种或多种具有改变特性的变体可以用于淀粉加工，尤其淀粉转化，尤其淀粉的 液化(参见例如美国专利号3，912，590,EP专利申请号252，730和63，909,WO 99/19467和 WO 96/28567，全部参考文献在此引入作为参考)。也构思了用于淀粉转化目的组合物，所述 组合物也可以包含葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和/或其他α -淀粉酶。另外，一种或多种变体特别用于从淀粉或完整谷物产生甜味料和乙醇(参见例如 在此引入作为参考的美国专利号5，231，017)，如燃料用、饮用和工业用乙醇。本文中的变体也可以用于纺织品、织物或服装退浆(参见例如在此引入作为参考 的TO 95/21247、美国专利号4，643，736、EP 119，920)、发酵醪制备或酿造、以及用于纸浆 和纸张生产或相关工艺中。10. 1天然淀粉的预处理天然淀粉由室温下在水中不溶解的微小颗粒组成。当加热含水淀粉浆液时，所述颗粒溶胀并最终破裂，淀粉分子分散在溶液中。在这个“凝胶化”过程期间，存在粘度的剧 烈增加。由于在常见工业过程中固体水平是30-40%，故不得不将淀粉稀薄化或“液化”，从 而可以适当地加工它。这种粘度降低在现行商业实践中主要由酶降解达到。10. 2淀粉转化例如在美国专利号3，912，590和EP专利
发明者A·肖, B·保尔森, D·沃德, J·K·舍蒂, J·T·凯利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉, S·D·鲍尔, S·拉默, V·夏尔马 申请人:丹尼斯科美国公司