专利名称:培养胞内劳森氏菌的方法
技术领域:
本发明总体而言涉及胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)在非哺乳动物细胞中的生长以及所述细菌的大规模生产。
背景技术:
猪增生性回肠炎(有时称为猪增生性肠炎(PPE))是美国(US)猪产业中的主要问 题。增生性回肠炎是猪的肠疾病复合征,其特征为隐窝增生和细胞内弯曲杆菌样生物的存 在。随着发病率幅度高达20%以及仅在美国每年的损失估计为5千万美元,对于该疾病的 认识在过去十年里已显著增加。尤其令人担忧的是在种畜产业中发病率的明显提高。该疾 病已在世界范围内被发现,并且常常影响6至20周龄的断奶后的猪。患有增生性回肠炎的 猪的临床征候包括间歇性腹泻,食欲缺乏,显著的迟钝和情感淡漠,以及消耗综合征。死亡 并不罕见且常与肠的出血效应相关。已描述了该疾病的四种不同形式,但大多数文献将损 害分为两种形式,即急性的和慢性的(有时称为坏死的)。有效的增生性回肠炎防治措施已 受到限制。基本的试错法(trial-and-error)治疗方案(包括使用口服和肠胃外的广谱抗 生素、抗组胺剂、皮质类固醇、硝基咪唑和B维生素)常常变得相当昂贵并且通常证实是有 效的。在患病动物的上皮的隐窝中细胞内细菌的存在证实了所述疾病的细菌病因学。 虽然从此类动物中分离出的细菌在形态学上类似于弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp),使用各种弯曲杆菌菌株的杂交研究和再现试验已证明该生物不是病原体。Joens 和Glock(美国专利号5,610,059)描述了并且要求保护PPE生物的分离和表征以及使用 所述生物来进行的该疾病的再现,所述生物之前被称为致PPE剂、回肠炎剂、IL-A、ATCC No. 55370,现在称为胞内劳森氏菌。起初的分离物显示再现出增生性结肠炎疾病。自该最 初的报道起,已获得了至少四种另外的分离物,并且它们显示表现出与ATCC 55370相同的 生长特征,从而证实了 ATCC 55370是原型生物。国际专利申请PCT/US01/30284描述了通过在组织培养物中使胞内劳森氏菌生长 来制备的增生性回肠炎疫苗,所述组织培养物选自猿猴细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、犬细胞、 猫细胞、仓鼠细胞、人细胞、马细胞、鱼细胞、牛细胞和猪细胞。胞内劳森氏菌是脱硫弧菌家 族中的革兰氏阴性专性细胞内细菌,其难以从野外样品中分离并且在动物细胞中生长。因 此,有需要在非哺乳动物细胞中生长大量的胞内劳森氏菌以用于疫苗开发和生产。发明概述本发明的发明者开发出了用于在非哺乳动物细胞(尤其是昆虫细胞和禽类细胞) 中大规模使胞内劳森氏菌生长的方法,其可用于疫苗的商业生产。根据本发明,将非哺乳动物细胞种植入含有合适的培养基的容器中,然后用胞内 劳森氏菌进行接种。在本文中被鉴定为适于胞内劳森氏菌生长和繁殖的条件下培养所述细 胞。在收获后,使所述细胞破裂以释放出胞内劳森氏菌。适合于在本方法中使用的细胞包括昆虫细胞、Schneider细胞和禽类细胞。在一 个优选的实施方案中,所述细胞为昆虫细胞,例如Sf9细胞、SF21细胞、SF+细胞、Hi-Five细胞和昆虫幼虫细胞。在另一个优选的实施方案中,所述细胞为禽类细胞,特别是CEV-I细 胞。本发明鉴定了合适的在接种前播种的细胞的密度,在接种物中胞内劳森氏菌的数 量,和感染复数。经接种的细胞可以在固着系统中或者在悬浮液中进行培养。取决于所述 细胞在固着系统中还是在悬浮液中进行培养,本发明还鉴定了合乎需要的细胞密度。还描 述了合适的培养基、温度、气氛条件和培育期。本发明的方法使得能够在非哺乳动物细胞中繁殖胞内劳森氏菌,以及大规模生产 所述细菌以用于疫苗的商业制造。
附图简述本专利的文件包括至少一幅以彩色制作的附图。带有彩色附图的本专利的副本将 在提出请求并支付必要的费用后由专利和商标局(Patent and Trademark Office)提供。
图1显示了免疫过氧化物酶染色,该染色显示了在SF21昆虫细胞中处于细胞内的 胞内劳森氏菌。发明详述本发明提供了用于在非哺乳动物细胞中生长有毒力的和/或无毒力的胞内劳森 氏菌以及大规模生产所述细菌的方法。本发明的方法一般地包括下列步骤1)利用含有培 养基的容器并且使用用于组织附着的基质在易感组织培养物中使胞内劳森氏菌生物生长, 或者在组织培养物细胞的悬浮液中使胞内劳森氏菌生长;2)通过将经生长的胞内劳森氏 菌生物从组织培养容器中移出来收获胞内劳森氏菌;和3)纯化所述胞内劳森氏菌生物。胞内劳森氏菌在非哺乳动物细胞(特别是昆虫细胞)中生长的重要阻碍是,此类 细胞是此类生物的非天然宿主,因此将不会预期到可实现任何生长,至少不会预期到可实 现大规模生长。本发明所面对的进一步的阻碍是,胞内劳森氏菌通常在哺乳动物宿主中在 350C _39°C范围内生长。然而,昆虫细胞于25°C _29°C生长,并且在35°C -39°C时迅速死亡。 本发明首次提供了用于在非哺乳动物细胞中生长有毒力的和/或无毒力的胞内劳森氏菌 以及大规模生产所述细菌的方法。此外,尽管一般使用动物血清来繁殖哺乳动物细胞以及 为病毒和/或细菌提供稳定因子,但是在一个实施方案中,本发明令人惊讶地在无血清存 在时实现了胞内劳森氏菌在昆虫细胞中非常高的表达。胞内劳森氏菌的生长和高水平表达 的实现是出乎意料的,也是本发明的显著成就。在进一步的实施方案中,本发明提供了在禽类细胞系中劳森氏菌(Lawsonia)的 生长。定义在描述本发明时,使用下列定义术语“需氧生物”、“好氧生物”和“好气生物”是指具有基于氧的代谢的生物。术 语“好气条件”是指其中氧浓度与大气中存在的氧浓度(即大约20% )大致相同的条件。术语“厌氧生物”和“不需氧生物”是指不需要氧用于进行生长的生物。术语“固着系统(anchorage system) ”及其类似用语表示用于培养细胞的系统, 在所述系统中细胞形成固着至容器壁或基质的片层,或者细胞形成附着至容器或基质的单 层。术语“连续细胞系”表示可在体外以有限次数(直至大约30次)的细胞分裂或无限地进行维持的细胞系。术语“培养”表示促进胞内劳森氏菌生物生长、复制和/或增殖的过程。术语“新鲜的”或“新鲜”,当涉及细胞时,表示未用胞内劳森氏菌感染的细胞;和当涉及培养基时,表示其中未含有细胞的培养基。术语“生长”表示在合适的温度和时间条件下在非哺乳动物细胞中胞内劳森氏菌 的抗原量(antigenic mass)或细胞密度的所产生的增加。可以通过许多本领域认可的方式 来测量生长,所述方式包括但不限于PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光抗体染色(FA) 和间接荧光抗体染色(IFA)。术语“大规模培养”和“商业生产”表示大于大约2至3升(L)的胞内劳森氏菌培 养水平,并且包括在至少100升,优选地400升,或更优选地1000升的规模上的生产。术语“矩阵条件(matrix conditions) ”表示对各种条件的评价,包括但不限于用 以阐明最佳方法而施行的全析因实验,或者方格板滴定法(checkboard titration),其中 一项滴定在y轴上而一项滴定在χ轴上以揭示变化的影响。术语“微需氧生物”是指在低的(低于大气的)氧张力下生长的生物。它们需要 氧以生存,但是要求或者可以耐受包含比大气中存在的氧水平更低的氧水平的环境。术语 “微需氧条件”是指其中氧浓度低于大气中存在的氧浓度(大约20%)的条件。术语“微载体”表示珠样结构,在其上附着易感细胞。它们一般可以保持于在搅拌 的反应器中的均质悬浮液之中。术语“感染复数”(MOI)是指每个细胞中生物体数目的比率,其详述了在给定的感 染中将要使用多少接种物。术语“传代”及类似用语表示将一部分细胞培养物转移到新鲜培养基的过程。术语“原代细胞系”表示可在体外维持有限时间段的细胞系。术语“悬浮液”表示用于培养细胞的系统,其中所述细胞以单个细胞或以细胞团在
培养基中自由飘浮。术语“转瓶(spinner flask) ”表示烧瓶或其他容器,其使用桨、螺旋桨、搅拌棒或 其他工具来搅动培养物并使其中所包含的细胞保持处于悬浮中。术语“易感培养物”表示,所述组织培养物经特别地选择、克隆或建立以生长胞内 劳森氏菌生物并表达所述生物的免疫原,从而使得所述免疫原不经修饰或改变,并且产生 出所述生物的抗原量。可用于生长胞内劳森氏菌的易感组织培养物可以是原代细胞系或连续细胞系, 并且可使用各种非哺乳动物细胞类型来建立,所述非哺乳动物细胞类型包括但不限于 Schneider (果蝇(Drosophila))细胞、昆虫细胞、昆虫幼虫细胞、禽类细胞、禽类胚胎细胞 和禽类卵。在一个实施方案中,所述易感组织培养物为昆虫细胞(例如Sf9、SF21、SF+和 Hi-Five细胞)的培养物。在一个特别的实施方案中,所述易感组织培养物为Sf9细胞的培 养物。在另一个实施方案中,所述易感组织培养物为禽类细胞(例如CEV-I禽类细胞系的 细胞)的培养物。可以使用各种矩阵条件来在易感组织培养物中使胞内劳森氏菌生物生长。在形态 学上,所述易感组织培养物可以作为悬浮液、作为固着至容器壁或基质的细胞片层、作为附 着至容器或基质(微载体)的汇合单层、或者作为半贴壁细胞(其中存在有附着的和悬浮的细胞的混合群体)进行生长。所述固着系统可以是固定床、微流化床、Wave反应器、堆叠 式组件(stacked module)或空气升液器(air-lift)。用于生长易感组织培养物的容器可 以是,但不限于,烧瓶、方瓶(Tflask)、转瓶、滚瓶、穴盘(cell tray)和生物反应器,其含有 培养基并且使用容器表面、珠或其他基质用于组织培养物附着。当使所述易感细胞在悬浮液中进行生长时,所述容器可以是,但不限于,含有培养 基的烧瓶、方瓶、转瓶、Wave反应器、发酵罐和生物反应器。可使用可以在其中混合培养基 的任何尺寸的容器,尽管容器的尺寸一般为大约50ml至大约900L。优选地,容器体积的大 约三分之一(50%)含有培养基,尽管也可使用其他的“培养基与液面上空间”的比例。易 感细胞可以以小规模(例如,含有大约50ml至大约10L培养基的容器)、大规模(例如,含 有大约1,000L至大约10,000L培养基的容器)或中等规模(例如,含有大约10L至大约 1,000L培养基的容器)进行生长。在一个实施方案中,使用含有大约100L至大约600L培 养基的容器。在另一个实施方案中,使用含有大约100L至大约400L培养基的容器。在另 外一个实施方案中,使用含有大约150L至大约250L培养基的容器。当使所述细胞在悬浮液中进行生长时,细胞密度一般在大约100,000至大约 10,000, 000个细胞/ml的范围内。在一个实施方案中,细胞密度在大约200,000至大约 5,000, 000个细胞/ml的范围内。在另一个实施方案中,细胞密度在大约500,000至大约 1,500, 000个细胞/ml的范围内。在悬浮液系统中,细胞可以以大约25至大约250转/分 钟的速度进行混合。在一个实施方案中,细胞以大约50至大约150转/分钟的速度进行混 合。在另一个实施方案中,它们以大约80至大约120转/分钟的速度进行混合。当使所述细胞在固着系统中进行生长时,用于培养所述细胞系和繁殖胞内劳森 氏菌的容器的一种形式为堆叠式组件系统。所述堆叠式组件可具有大约21,000cm2至大 约340,000cm2的表面积。备选地,适合于使用的容器的其他形式包括烧瓶,其可具有大约 150cm2至大约420cm2的表面积;以及滚瓶,其可具有大约1760cm2,但可以在大约850cm2至 大约4250cm2范围内的表面积。当使所述细胞在固着系统中进行生长时,细胞密度一般在大约10,000至大约 1,000, 000个细胞/cm2的范围内。在一个实施方案中,细胞密度在大约20,000至大约 500,000个细胞/cm2的范围内。在另一个实施方案中,细胞密度在大约60,000至大约 250,000个细胞/cm2的范围内。在固着系统中,可以以大约0. 1至大约100转/小时的速 度转动滚瓶,而在穴盘和固定床反应器中,培养基循环通过所述容器。适合于培养所述细胞系和繁殖胞内劳森氏菌的培养基制剂可以是任何典型的组 织培养培养基,所述典型的组织培养培养基对于本领域技术人员来说一般已知用于所使用 的细胞类型。所述培养基将一般包含氮源,对于所选择的培养细胞来说必需的生长因子,和 碳源(例如葡萄糖或乳糖)。用于培养所述细胞系的培养基制剂的一些非限制性实例包括, 但不限于,Ex-Cell 405, M-FH 昆虫培养基(GentaurMolecular Products,bvba),IPL-41 昆虫培养基(Sigma-AldrichCo.), Cellgro 无血清细胞培养基(Mediatech, Inc.),和 具有L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM F12 1 1) (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen)。在一个实施方案中,所述细胞培养基制剂为具有L_谷氨酰 胺的Ex-Cell 420用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH Biosciences)。在另一个实施方案 中,所述细胞培养基制剂为具有L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM F121 1) (Gibco (S) Cell Culture Systems,Invitrogen)。可以在源于动物的组分存在或不存在下使用细胞培养基。可以使用的源于动物的 组分为终浓度在0.5-10%范围内的经γ辐射的血清。此类组分的实例为通过SER-TAIN 过程经、辐射的来源于美国的胎牛血清(JRH Biosciences) 0 一般地,不含动物蛋白质的 培养基对于在悬浮液中生长的昆虫细胞培养物来说是优选的,而含有动物蛋白质的培养基 对于在固着系统中生长的昆虫细胞培养物来说是优选的。用于培养昆虫细胞系和繁殖胞内劳森氏菌的温度一般在大约20至大约39摄氏度 的范围内。在另一个实施方案中,所述温度在大约23至大约34摄氏度的范围内;和在另外 一个实施方案中,所述范围为大约25至大约29摄氏度。用于培养禽类细胞系和繁殖胞内 劳森氏菌的温度一般在大约25至大约45摄氏度的范围内。在另一个实施方案中,所述温 度在大约30至大约40摄氏度的范围内;和在另外一个实施方案中,所述范围为大约35至 大约39摄氏度。用于培养所述细胞系和繁殖胞内劳森氏菌的气氛条件可以是需氧的或微需氧的。在一个实施方案中,在微需氧条件下培养所述细胞系,所述微需氧条件包含大约10 %氢气、 大约10% CO2和大约80%氮气的混和物。为了繁殖胞内劳森氏菌,将所述细胞播种到所选择的容器中。一般以大约100,000 至大约10,000,000个细胞/ml对所述容器进行播种。在另一个实施方案中,一般以大约 200,000至大约5,000,000个细胞/ml对所述容器进行播种。已传代了 0至大约20次的细 胞可以用于繁殖胞内劳森氏菌生物。在一个实施方案中,将已传代了大约10至20次的细 胞用于进行繁殖。最初,用包含胞内劳森氏菌细菌的接种物对细胞培养物进行接种,以便用所述细 菌感染所述细胞。所述胞内劳森氏菌的接种物可以是纯的培养物,其例如获自美国典型培 养物保藏中心(American TypeCulture Collection) (ATCC,Rockville,Md.)保藏号55672, 国立典型培养物保藏中心(National Collection of Types Culture) (NCTC, Colindale, London)保藏号12656或12657 (参见美国专利5,885,823);或者通过使用本领域技术人员 已知的分离和纯化技术而获自经感染的猪或其他动物。接种物的量可以在大约100至大约 1,000, 000个劳森氏菌拷贝/ml的范围内。在特别的实施方案中,接种物的量在大约200至 大约500,000个劳森氏菌拷贝/ml的范围内。在另一个实施方案中,所述量在大约400至 大约250,000个劳森氏菌拷贝/ml的范围内。可以在将所述细胞种植入容器中时或者直至在种植后五天,用胞内劳森氏菌生物 接种所述细胞培养物。在另一个实施方案中,直至在种植后大约2天,对所述细胞培养物进 行接种。感染复数(M0 I)可以通过使用本领域技术人员已知的标准技术来进行测量,包括 荧光抗体染色(FA)、间接荧光抗体染色(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。此类技术的两个非限制性实例包括qRT-PCR和TCID5(I。通过使用定量反转录聚合 酶链式反应(qRT-PCR),用于繁殖胞内劳森氏菌的MOI —般在大约0. 000001至大约10的范 围内。在另一个实施方案中,通过使用qRT-PCR,MOI在大约0. 00001至大约10的范围内。 在另外一个实施方案中,通过使用qRT-PCR,MOI在大约0. 0001至大约10的范围内。在用胞内劳森氏菌生物进行感染后,让所述细胞培养物培育一段时间(培育期),直至出现所需量的胞内劳森氏菌生长。所述培育期一般可以在用胞内劳森氏菌生物接种所 述细胞培养物后大约5和大约25天之间变化。所述培育期的范围也可以为大约5至大约 15天。在关于昆虫细胞的特定实施方案中,所述培育期的范围为大约9至大约13天。在关 于禽类细胞的另一个实施方案中,所述培育期的范围为大约3至大约13天。可以使用本领 域技术人员已知的标准技术来测量生长量。可用于评估生长量的定量测定法的两个实例包 括定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和半数组织培养感染剂量(TCID5tl)。在培育期期间,如果需要,可以给所述细胞培养物补充新鲜培养基。这一般可以在 感染后大约5至大约9天,优选地在感染后大约6至大约8天进行。在培育期期间,可以给 所述细胞培养物补充超过一次,其中在各次补充之间为大约3至大约9天。所述培育期还可包括将该过程按比例放大的步骤。例如,可以将所述细胞培养物 播种入小的感染容器(例如,大小为大约5L)中,并让其生长一段时间(例如,大约一周)。 然后,可以将所述培养物转移到更大的容器(例如,大小为大约30L)中,并补充以新鲜培养 基。可以继续该过程,直至达到所需的细胞培养物量。在培育期之后,收获部分或全部的培养物。所述收获过程需要从容器中去除流体。 除了胞内劳森氏菌之外,所述流体可包含细胞碎片或完整的组织培养细胞。通过使用本领 域技术人员已知的标准技术来完成收获,包括但不限于冻融步骤,用酶或去污剂进行处理, 或者用高压进行处理,以便破开组织培养细胞从而释放出胞内劳森氏菌生物。另外,收获可 包括使用本领域已知的技术进行浓缩,例如离心、连续流离心、柱色谱法、超滤、死端深度过 滤(deadend depth filtration)、或过滤(在批量产物中有或没有细胞碎片)。例如,在一 个实施方案中,从容器中收获细胞,并使用PCR来定量胞内劳森氏菌细菌的产率。在一个实例中,通过下述方式来收获胞内劳森氏菌细菌离心全部或部分悬浮液 的内容物以使所述培养细胞形成粒状沉淀,重悬浮所得的细胞粒状沉淀,并裂解经感染的 细胞。如果所述细胞在固着系统中进行生长,那么首先使所述细胞破裂以形成悬浮液。通 常,将至少一部分内容物在大约3000X重力(g)下离心大约20分钟,以便使所述细胞和细 菌形成粒状沉淀。然后,将所述粒状沉淀重悬浮在例如新鲜培养基或蔗糖_磷酸盐_谷氨 酸盐(SPG)溶液中,并通过25号针头大约4次以便裂解所述细胞。如果需要进一步纯化, 可以将所述样品在大约145Xg下离心大约5分钟以去除细胞核和碎片。然后,可将上清液 在大约3000Xg下离心大约20分钟,并将所得的粒状沉淀重悬浮在合适的稀释剂,例如含 或不含胎牛血清的新鲜培养基或SPG(以制备适合于冷冻或作为接种物使用的经收获的细 菌)或者生长培养基(以制备更适合于向新鲜细胞进行传代的经收获的细菌)中。在另一个实施例中,可使用连续流离心来收集所述培养细胞,所述培养细胞随后 经历勻浆步骤以释放出细胞内的细菌。在一个实施方案中,本发明旨在针对增生性回肠炎提供保护的疫苗,所述增生性 回肠炎由胞内劳森氏菌物种例如ATCC 55370以及具有类似的免疫原性特征的所有其菌株 和突变体引起。“免疫原性特征”是指保护动物(例如猪)免 于患增生性回肠炎的能力。 所考虑的疫苗包括但不限于,减毒疫苗、灭活疫苗、经修饰的活疫苗、亚单位疫苗和重组疫 苗。本发明的疫苗是保护性的和/或治疗性的(如果其产生足够高水平的免疫原),并且 可包含佐剂、稳定剂和/或赋形剂。胞内劳森氏菌的灭活可常规地通过用BEI ( 二元吖丙啶 (binaryethyleneimine)), BPL(i3 -丙内酯)、福尔马林、甲醛、热或任何其他本领域已知的试剂处理所述生物来完成。所考虑的佐剂包括Amphigen 、Polygen (R)Xarbopul 、氢氧 化铝、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Iscoms等等。减毒疫苗例如可以通过在组织培养物 中进行系列传代来生产。所述疫苗可以例如肌内、皮下、鼻内、口服、皮内或局部进行施用。本发明还考虑了用于检测动物中增生性回肠炎的存在的诊断性测试。因此,本发 明提供了可用于诊断或检测增生性回肠炎的单克隆抗体。可以相信,使用前述的描述,本领域技术人员能够以最全面的程度实施本发明。通 过下面的详细实施例来进一步阐明本发明,所述实施例被提供仅用于举例说明目的,而不 应解释为以任何方式限制了前述的公开内容。在下列实施例中所使用的胞内劳森氏菌可以 是无毒力的或有毒力的。
实施例实施例1. PPE繁殖实验,其中改变温度和气氛条件。目的。该实验的目的是在27°C (自然昆虫温度)下相比于在37°C下,以及在CO2 下相比于在特种气体气氛条件下,通过使用Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细 胞系来评价胞内劳森氏菌的生长。材料和方法。 Jna =不适用细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen,Carlsbad,California,USA)。生长培养基为具有L-谷氨酰胺的Ex-Cell 420 用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目录号14420,项 目号14420-1000M)。种子培养物包含经修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏菌细菌。细胞数目和种植信息。使用300-ml储备悬浮液,其包含4. 54 X IO6个Sf9细胞/ ml。将4日龄的细胞移至1000-ml转瓶。将总共222ml的新鲜培养基放入每个转瓶中,并 且将1.25 X IO8个细胞(27. 5ml的储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导致形成大约 250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。变量描述。
容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 (two-port) SST组件(配置有0. 1 μ m无菌滤器)。工艺参数。对于容器1和2,温度维持于27°C。对于容器3和4,温度维持于37°C。 所有的容器以IOOrpm进行搅动。氧(O2)水平是可变的。未监测或控制pH水平。当在容器 1和3中建立特种气体气氛时,向所述容器喷射包含10%氢气、10% CO2和80%氮气的特种 气体,其经过0. 1 μ m滤器进行过滤以防止污染。对于250ml的培养基,喷射速率为5_10cc/ 秒,并持续1分钟。对于500ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续2分钟。为了防 止扩散,在充气后用止血器将容器封闭。维持在5% CO2环境中的容器2和4具有未用止血 器封闭的0.1 ym滤器壳(housing)。因此,可经由该滤器壳发生与5% CO2环境的自由气 体交换。感染。在将它们种植入容器中后1天(第1天),Sf9细胞被感染。按照1 20 的容器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器中(即12. 5ml种子/250ml体积)。未测 定感染复数(MOI)。培养基补充。在将Sf9细胞种植入容器中后第8天,给所有容器补充250ml的 Ex-Cell 420。收获。在将3€9细胞种植入容器中后第0、1、4、7、8(补充前)、9、10、11、14、15和 17天获取样品。在种植后第11天,从容器3和4中获得样品。因为细胞生存力和细胞密度 非常低,所以没有取出进一步的样品,并且将其余的容器内容物分配到大的塑料容器中并 冷冻于-80°C。在种植后第17天,从容器1和2中获得样品,并且将其余的容器内容物分配 到大的塑料容器中并冷冻于-80°C。结果。Sf9细胞在27°C下比在37°C下生长得更好(参见表1)。胞内劳森氏菌在 27°C和特种气体(微需氧的)条件的环境中以及在CO2条件下生长。(但是微需氧的条件 是较好的)(参见表2)。表 1 *以科学计数法显示的数据(例如,5· 0E+05 = 5. O X IO5)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数***na =未分析表2 *以科学计数法显示的数据(例如,7· 00E+08 = 7. OOXlO8)**在将Sf9细胞种植入容器中后的时间(小时)***na =未分析实施例2. PPE繁殖实验,其中改变温度、血清的存在、感染复数(MOI)、和胞内劳森氏菌的传代。目的。该实验的目的是在27°C下相比于在32°C下,通过使用Sf9(草地夜蛾)细 胞系来评价胞内劳森氏菌的生长。所述目的还是评价在27°C下相比于在32°C下,添加5% 血清的效应。所述目的还是评价在27°C下相比于在32°C下,提高感染复数(MOI)的效应。 最后,所述目的是评价在27°C下在Sf9细胞中胞内劳森氏菌的第二次传代。材料和方法。 Jna =不适用2IFBS =经辐射的胎牛血清细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)。生长和维持培养基为具有L-谷氨酰胺的 Ex-Cell 420 用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目 录号14420,项目号14420-1000M)。用于含有血清的容器的生长和维持培养基为具有L-谷 氨酰胺的Ex-Cell 420用于昆虫细胞的无血清培养基,其含有5%的通过SER-TAIN 过程 经Y辐射的来源于美国的胎牛血清(JRHBiosciences,Lenexa,Kansas,USA ;目录号12107, 项目号12107-1000M)。种子培养物包含经修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏菌细菌。细胞数目和种植信息。使用300-ml储备悬浮液,其包含5. 20 X IO6个Sf9细胞/ ml。将3日龄的细胞移至1000-ml转瓶。将总共226ml的新鲜培养基放入每个转瓶中,并 且将1.25 X IO8个细胞(24. Oml的储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导致形成大约 250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。变量描述。
容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 SST 组件(配置有0. Iym无菌滤器)。工艺参数。对于容器1、3、5和7,温度维持于27°C。对于容器2、4和6,温度维持 于32°C。所有的容器以IOOrpm进行搅动。氧(O2)水平是可变的。未监测或控制pH水平。 在所有容器中培养基上方的气氛为特种气体。当在容器中建立所述气氛时,向所述容器喷 射包含10%氢气、10% CO2和80%氮气的特种气体,其经过0. 1 μ m滤器进行过滤以防止污 染。对于250ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续1分钟。对于500ml的培养基, 喷射速率为5-lOcc/秒,并持续2分钟。为了防止扩散,在充气后用止血器将容器封闭。感染。在将它们种植入容器中时(第0天),Sf9细胞被感染。按照1 40的容器 种植体积的比例,将种子培养物引入到容器1、2、3和4中(即6. 25ml种子/250ml体积)。 按照大约1 11.4的容器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器5和6中(即22ml种 子/250ml体积)。没有将种子培养物引入到容器7中。而是将35. 7ml在种植后第17天从 上述实施例1的容器1中收获的样品引入到容器7中(1 7的“接种物容器种植体积” 的比例)。没有测定感染复数(MOI)。培养基补充。在将Sf9细胞种植入容器中后第6天,给所有容器酌情补充250ml 的Ex-Cell 420或者250ml的加有胎牛血清的Ex-Cell 420。收获。在将3€9细胞种植入容器中后第0、1、4、6(补充前)、8、11、13、15、18和20 天获取样品。在从容器2、4、6和7中获得第20天样品后,将其余的容器内容物分配到大的 塑料容器中并冷冻于_80°C。在第25天从容器1、3和5(其被维持在27°C)中获取样品, 并且将其余的容器内容物分配到大的塑料容器中并冷冻于-80°C。结果。Sf9细胞在27°C下比在32°C下生长得更好(参见表3)。如表4中所示的, 劳森氏菌在每种条件下生长,除了容器7(其接种了来自实施例1的接种物(即第二次传 代))。这可能是由于来自实施例1的不能存活的接种物。一般地,当在27°C和无血清的情 况下生长时,劳森氏菌达到更高的生长水平。虽然当使用高MOI时观察到最高的劳森氏菌 拷贝数/ml,但是看来存在逐渐减少的回报(即在较低的MO I时看到100倍的投资回报,而 相比之下在较高的MOI时看到46倍的回报——参见表5)。当维持于32°C时,劳森氏菌生 长;但是,这些感染的特征为快速产生劳森氏菌,而不是维持强劲的生长。表3
*以科学计数法显示的数据(例如,5. 0E+05 = 5.0X 105)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数***na =未分析表4 *以科学计数法显示的数据(例如,1. 30E+09 = 1. 30X 109)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数
***na=未分析表5 *na=不适用实施例3. PPE繁殖实验,其中改变温度、感染复数(MOI)和用培养基进行的补充, 评估温度适应,并且在各种收获时间点产生Sf9细菌种子。目的。该实验的目的是在27摄氏度(°C )、29. 5°C和32°C下,通过使用Sf9 (草地夜 蛾)细胞系来评价胞内劳森氏菌的生长。所述目的还是评价在27°C下改变感染复数(MOI) 的效应。所述目的还是评价在27°C下在各种时间点处的重复补充。所述目的还包括评价 从27°C到29.5°C,然后再到32°C,Sf9细胞的温度适应。所述目的还包括评价胞内劳森氏 菌于32°C在第0-6天期间的生长,随后为于29. 5°C在第6天至完成期间的生长。最后,所 述目的是在各种收获时间点产生用于稍后的接种的胞内劳森氏菌细菌种子,以确认传代可 行性。材料和方法。 1Iia=不适用细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)。生长和维持培养基为具有L-谷氨酰胺的 Ex-Cell 420 用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目 录号14420,项目号14420-1000M)。种子培养物包含经修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏 菌细菌。
细胞数目和种植信息。使用了三种储备溶液。第一种是维持于27°C的300-ml储 备悬浮液,其包含3. 99 X IO6个Sf9细胞/ml (87. 3%的生存力)。第二种是维持于29. 5°C 的300-ml储备悬浮液,其包含1. 96 X IO6个Sf9细胞/ml (77. 6%的生存力)。第三种是维 持于32°C的300-ml储备悬浮液,其包含0. 9 X IO6个Sf9细胞/ml (52. 8%的生存力)。将 3日龄的细胞移至1000-ml转瓶。将总共219ml的新鲜培养基放入第1_4号转瓶中,并且将 1. 25 X IO8个细胞(31. Oml的27°C储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导致形成250ml 的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。将总共186ml的新鲜培养基放入第5和6号转瓶 中,并且将1. 25 X IO8个细胞(64. Oml的29. 5°C储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导 致形成250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。将总共112ml的新鲜培养基放入第7 号转瓶中,并且将1.25X 108个细胞(138. Oml的32°C储备悬浮液)种植入所述培养基中, 从而导致形成250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。 容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 SST 组件(配置有0. Iym无菌滤器)。工艺参数。对于容器1、2、3和4,温度维持于27°C。对于容器5,温度维持于 29. 50C。对于容器6,亲本培养基的温度为29. 50C。在第0天将温度升至32°C并且在第0_6 天维持在此温度下,然后在第6-24天降至29. 5°C。对于容器7,温度维持于32°C。将容器 以IOOrpm进行搅动。氧(O2)水平是可变的。未监测或控制pH水平。在所有容器中培养基 上方的气氛为特种气体。当在容器中建立所述气氛时,向所述容器喷射包含10%氢气、10% CO2和80%氮气的特种气体,其经过0. 1 μ m滤器进行过滤以防止污染。对于250ml的培养 基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续1分钟。对于500ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒, 并持续2分钟。为了防止扩散,在充气后用止血器将容器封闭。感染。在将它们种植入容器中时(第0天),Sf9细胞被感染。按照1 40的容 器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器1、4、5、6和7中(即6. 25ml种子/250ml体 积)。按照大约1 160的容器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器2中(即1.56ml种子/250ml体积)。按照大约1 640的容器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器 3中(即0. 4ml种子/250ml体积)。没有测定感染复数(MOI)。培养基补充。在将Sf9细胞种植入容器中后第6天,给容器1、2、3、4、5、6和7补 充250ml的Ex-Cell 420。对于容器4,在将Sf9细胞种植入该容器中后第13和19天,将 250ml的细胞培养物转移至空的IOOOml容器,并且补充以额外的250ml的Ex-Cell 420。收获。在将3€9细胞种植入容器中后第0、3、5、6(补充前)、7、10、13、17、19、20、 24和27天获取样品。但是,在第20、24和27天,未从容器7中获取样品。对于容器4,在 第6、13、19和24天(在第6、13和19天,在补充培养基之前),收获25ml的培养基和细胞 并进行冷冻。在从容器7中获得第19天样品以及从容器1-6中获得第27天样品后,将其 余的容器内容物分配到大的塑料容器中并冷冻于-80°C。结果。对于容器1和容器4的条件是相似的,除了在第13和19天额外对容器4 进行补充之外。该额外的补充导致形成更健康的Sf9细胞,如通过细胞密度和生存力所测 定的(参见表6和7);以及导致劳森氏菌产率的更高的总体增加(参见表8)。在容器1-4 中实现了劳森氏菌产率的增加,这些容器维持于27°C。对于容器1、5、6和7的条件是相似的,除了亲本细胞的温度和/或在劳森氏菌生 长期间的温度之外。当在32°C下进行时,在早期感染期(第0-6天)期间,劳森氏菌繁殖加 速(容器6)。这一点没有在容器7中重现,很可能是由于在感染时差的Sf9生存力(50% )。 因此,虽然在27°C下劳森氏菌的繁殖花费更长时间来达到最大生长,但却实现了更大的总产率。表6 *以科学计数法显示的数据(例如,5. 0E+05 = 5. OX IO5)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数***na=未分析
表 7 *在将Sf9细胞种植入容器中后的天数**na=未分析表8 *以科学计数法显示的数据(例如,1. 20E+09 = 1. 20X 109)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数***na =未分析表 9 *在将Sf9细胞种植入容器中后的天数**na =未分析实施例4. PPE繁殖实验,其评价了关于通过改变收获日期而获得的样品的胞内劳 森氏菌细菌生长,以及胞内劳森氏菌的温度适应。目的。该实验的目的是评价在27摄氏度(°C)下,在感染Sf9(草地夜蛾)细胞 系后的四个不同时间点收获的胞内劳森氏菌细菌的生长;以及确保在Sf9细胞中繁殖的劳 森氏菌能够再感染新的Sf9细胞培养物。所述目的还是评价胞内劳森氏菌于32°C在第0-6 天期间的生长,随后为于27°C在第6天至完成期间的生长。材料和方法。
1Iia=不适用细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)。生长和维持培养基为具有L-谷氨酰胺的 Ex-Cell 420 用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目 录号14420,项目号14420-1000M)。包含经修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏菌细菌的种 子培养物是在实施例3过程中获得的。如上所述,在第6、13、19和24天从容器4中收获 25ml样品,并且冷冻于_80°C。细胞数目和种植信息。使用了于27°C维持在1000L转瓶中的300_ml储备悬浮 液。在种植后第6天,所述容器包含在Ex-Cell 420培养基中的6.4X106个SF9细胞/ ml (99. 7%的生存力)。将6日龄的细胞移至5个新的500_ml转瓶中。将总共230. 5ml的 新鲜培养基放入每个转瓶中,并且将1.25 X IO8个细胞(19. 5ml的所述储备悬浮液)种植 入所述培养基中,从而导致形成250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。变量描述。 容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 SST 组件(配置有0. Iym无菌滤器)。工艺参数。对于容器1、2、3和4,温度维持于27°C。对于容器5,温度在第0_6天 维持于32°C,然后在第6-29天降至27°C。所有的容器以IOOrpm进行搅动。氧(O2)水平是 可变的。未监测或控制PH水平。在所有容器中培养基上方的气氛为特种气体。当在容器 中建立所述气氛时,向所述容器喷射包含10%氢气、10% CO2和80%氮气的特种气体,其经 过0. 1 μ m滤器进行过滤以防止污染。对于250ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持 续1分钟。对于500ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续2分钟。为了防止扩散, 在充气后用止血器将容器封闭。感染。在将它们种植入容器中时(第0天),Sf9细胞被感染。在感染时,使用来 自实施例3的qRT-PCR结果来计算胞内劳森氏菌细菌的感染复数(MOI)。 目标感染量为3. 15X108拷贝的胞内劳森氏菌/容器。使用25. Oml的第6天种 子来感染容器1 (3. 15 X IO8拷贝/1. 26 X IO7拷贝/ml)。使用3. 3ml的第13天种子来感染 容器2和5(3. 15 X IO8拷贝/9. 6 X IO7拷贝/ml)。使用6. 3ml的第19天种子来感染容器 3 (3. 15 X IO8拷贝/5. 0 X IO7拷贝/ml)。使用12. Iml的第24天种子来感染容器4 (3. 15 X IO8 拷贝/2. 6 X IO7 拷贝/ml)。培养基补充。在将Sf9细胞种植入容器中后第6天,给所有容器补充250ml的 Ex-Cell 420。收获。在将Sf9细胞种植入容器中后第0、3、6(补充前)、8、10、14、17、21、25和29
天获取样品。但是,由于细胞计数低,在第29天未从容器5中获取样品。在从容器5中获 得第25天样品以及从容器1-4中获得第29天样品后,将其余的容器内容物分配到大的塑 料容器中并冷冻于-80°C。
结果。结果证明,可以收获先前在昆虫细胞中进行传代的劳森氏菌,并将其用于感 染新的昆虫细胞(参见表10、11和12)。第24天种子的67倍增加与对于在早先的实施例 中使用的新鲜种子所观察到的80-100倍产率相当。在于32°C开始并转换至27°C的培养物 中观察到早期的劳森氏菌繁殖爆发,但是对于整个实验而言,这些培养物没有保持住在维 持于27°C的培养物中所观察到的生长水平。最后,不清楚为什么第6、13、19和24天种子的 经标准化的感染没有达到“一致的”产率增加。表 10 *以科学计数法显示的数据(例如,5. 0E+05 = 5. OX IO5)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数***na=未分析表11 *以科学计数法显示的数据(例如,6. 50E+07 = 6. 50 X IO7)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数
表12 *在将Sf9细胞种植入容器中后的天数实施例5. PPE繁殖实验,其中比较了培养基的类型、感染复数(MOI)、以及感染的 对未感染的Sf9细胞(用于分析)。目的。该实验的目的是通过使用Sf9(草地夜蛾)细胞系来比较胞内劳森氏菌在 Ex-Cell 420培养基中或在IPL-41培养基中的生长。所述目的还是评价在大约31剂量 时在Sf9细胞中胞内劳森氏菌的感染复数(MOI)。最后,所述目的是在生物化学和质谱法分 析过程中比较Sf9阴性对照(未感染的细胞)与用胞内劳森氏菌感染的Sf9细胞。材料和方法。 1Iia=不适用细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)。生长和维持培养基为具有L-谷氨酰胺的 Ex-Cell 420 用于昆虫细胞的无血清培养基(JRH biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目 录号14420,项目号14420-1000M)。比较用生长和维持培养基为IPL-41昆虫培养基(来自 Sigma-Aldrich Co.,St. Louis,MO, USA ;目录号 17760 ;批号 75K2370)。种子培养物包含经 修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏菌细菌。细胞数目和种植信息。使用了两种储备溶液。第一种是维持于27°C的300-ml储 备悬浮液,其在IPL-41培养基中包含3. 18\106个3€9细胞/!111(91.4%的生存力)。第二种是维持于27°C的300-ml储备悬浮液,其在Ex-Cell 420培养基中包含1. 78X IO6个 3伪细胞/1111(97.8%的生存力)。将6日龄的细胞移至500-ml转瓶。将总共179. 8ml的 新鲜Ex-Cell 420培养基放入第1和2号转瓶中,并且将1.25X 108个细胞(70.2ml的 Ex-Cell 420储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导致形成大约250ml的总体积,其 具有0. 5X IO6个细胞/ml。将总共210. 7ml的新鲜IPL-41培养基放入第3和4号转瓶中, 并且将1. 25 X IO8个细胞(39. 3ml的IPL-41储备悬浮液)种植入所述培养基中,从而导致 形成大约250ml的总体积,其具有0. 5X IO6个细胞/ml。变量描述。 容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 SST 组件(配置有0. Iym无菌滤器)。工艺参数。对于所有容器,温度维持于27°C。将容器以IOOrpm进行搅动。氧(O2) 水平是可变的。未监测或控制PH水平。当在容器1和3中建立所述气氛时,向所述容器喷 射包含10%氢气、10% CO2和80%氮气的特种气体,其经过0. 1 μ m滤器进行过滤以防止污 染。对于250ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续1分钟。对于500ml的培养基, 喷射速率为5-lOcc/秒,并持续2分钟。为了防止扩散,在充气后用止血器将容器封闭。置 于环境条件下的容器2和4具有未用止血器封闭的0. 1 μ m滤器壳。因此,可在正常气氛条 件下经由该滤器壳发生自由气体交换。感染。对于容器1和3,在将它们种植入容器中时(第0天,第0小时),Sf9细胞 被感染。按照1 40的容器种植体积的比例,引入种子培养物(即6. 25ml种子/250ml体 积)。未测定感染复数(MOI)。培养基补充。在将Sf9细胞种植入容器中后第7天,给容器1和2补充250ml的 Ex-Cell 420,并且给容器3和4补充IPL-41。收获。在将Sf9细胞种植入容器中后第0、3、4、7 (补充前)、9、11和14天获取样品。在从容器中获得第14天样品后,将其余的容器内容物分配到大的塑料容器中并冷冻 在-80"C。结果。SF9细胞在Ex-Cell 420培养基中相比于在IPL-41培养基中而言生长得 显著更好(参见表13)。在这两种培养基中都能够培养胞内劳森氏菌(参见表14和15), 但是在Ex-Cell 420培养基中相对于在IPL-41培养基中而言获得了更高的产率(212倍 对4. 4倍)。表13 *以科学计数法显示的数据(例如,1. 30E+08 = 1. 30X IO8)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数表 14 *以科学计数法显示的数据(例如,1. 60E+08 = 1. 60X 108)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数表 15 *在将Sf9细胞种植入容器中后的天数实施例6.在烧瓶中的PPE繁殖实验,其中改变密度。目的。该实验的目的是通过使用在固着系统中以三种不同密度种植的Sf9 (草地 夜蛾)细胞系来评价胞内劳森氏菌的生长。材料和方法。 :na =不适用2IFBS =经辐射的胎牛血清细胞和培养基信息。细胞培养物为Sf9细胞(Gibco Cell CultureSystems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA)。生长和维持培养基为具有L_谷氨酰胺的 Ex-Cell 420用于昆虫细胞的无血清培养基,其含有5%的通过SER-TAIN 过程经、辐射 的来源于美国的胎牛血清(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA ;目录号12107,项目号 12107-1000M)。种子培养物包含经修饰的、活的、非毒力的胞内劳森氏菌细菌。种子培养物 是原始疫苗的亚等分试样。细胞数目和种植信息。
*以科学计数法显示的数据(例如,2E+07 = 2 X IO7)工艺参数。对于所有容器,温度维持于27°C。氧(O2)水平是可变的。未监测或 控制pH水平。当容器1-4中建立特种气体气氛时,将75cm2烧瓶置于BBL GasPak 系统 (Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)中,并且将所述容器密封。然 后,将所述容器抽成真空,并且再充入10% CO2UO % H2和80% N2。为了防止扩散,在充气 后用止血器将容器封闭。感染。在将它们种植入容器中后短于2小时,Sf9细胞被感染。按照1 40的容 器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器中(即1. 25ml种子/50ml体积)。未测定感 染复数(MOI)。培养基补充。在该实验过程中未补充培养基。收获。在将Sf9细胞种植入容器中后第0、7、10和13天获取样品。结果。每一种所评价的SF9细胞密度均产生了显著的胞内劳森氏菌生长(参见表 16)。以2E+7UE+7和5E+7个细胞的密度进行种植的容器分别产生了 15. 3,24. 5和27. 9 倍的增加。表16胞内劳森氏菌拷贝数/IOOOul (qRT-PCR) * *以科学计数法显示的数据(例如,1. 70E+06 = 1. 70X IO6)**在将Sf9细胞种植入容器中后的天数实施例7.在禽类细胞中的PPE繁殖实验,其中改变气氛条件。目的。该实验的目的是在37摄氏度(°C)下,在CO2下相比于在特种气体气氛条件下,通过使用CEV-1禽类细胞系来评价胞内劳森氏菌的生长。材料和方法。 :na =不适用2IFBS =经辐射的胎牛血清细胞和培养基信息。CEV-1细胞获得自在Pfizer,Inc.中维持的储备培养物。 生长和维持培养基为具有L-谷氨酰胺的DMEM F12 1 1 (Gibco Cell Culture Systems, Invitrogen, Carlsbad, California, USA ;目录号 21041-025),其含有 10% 的通过 SER-TAIN 过程经Y辐射的来源于美国的胎牛血清(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA;目录号12107,项目号12107-1000M)。种子培养物包含经修饰的、活的、非毒力的胞内 劳森氏菌细菌。细胞数目和种植信息。使用20-ml储备悬浮液,其包含2. 7e6个CEV-1细胞/ml。 亲代细胞(传代前)为4日龄的。将0日龄的细胞移至500-ml转瓶。将总共240ml的新 鲜培养基放入每个转瓶中,并且将2. 5e7个细胞(10ml的储备悬浮液)种植入所述培养基 中,从而导致形成大约250ml的总体积,其具有100,000个细胞/ml。变量描述。 容器构造。所有容器均装配有一个固定长度的滴管(至80%深度)以及双口 SST 组件(配置有0. lPm无菌滤器)。工艺参数。对于这两个容器,温度均维持于37°C。这两个容器均以lOOrpm进行搅 动。氧(02)水平是可变的。未监测或控制pH水平。当在容器1中建立特种气体气氛时,向 所述容器喷射包含10%氢气、10% C02和80%氮气的特种气体,其经过0. lym滤器进行过 滤以防止污染。对于250ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续1分钟。对于500ml的培养基,喷射速率为5-lOcc/秒,并持续2分钟。为了防止扩散,在充气后用止血器将容 器封闭。维持在5% CO2环境中的容器2具有未用止血器封闭的0. 1 μ m滤器壳(housing)。 因此,可经由该滤器壳发生与5% CO2环境的自由气体交换。感染。在将它们种植入容器中后24小时(第1天),CEV-I细胞被感染。按照 1 20的容器种植体积的比例,将种子培养物引入到容器中(即12.5ml种子/250ml体 积)。未测定感染复数(MOI)。 培养基补充。在将CEV-I细胞种植入容器中后第8天,给所有容器补充250ml的 DMEM F12 10% IFBS。收获。在将CEV-I细胞种植入容器中后第1、4、7、8(补充前和补充后)、9、10、11 和14天获取样品。结果。CEV-I细胞在该研究的条件下生长,如通过细胞密度和生存力所测定的(参 见表17和18)。在37°C和特种气体(微需氧的)条件的环境中,胞内劳森氏菌在CEV-I禽 类细胞中生长(参见表19)。从在将CEV-I细胞种植入容器中后第1天到第14天,维持在 特种气体中的CEV-I细胞产生了 7. 9倍的增加。在该相同的时间段期间,维持在CO2环境 中的培养物没有产生胞内劳森氏菌的增加。表 17活细胞计数/容器 *以科学计数法显示的数据(例如,1. 3Ε+8 = 1. 3X IO8)#感染的日期培养基补充的日期表18每个容器中的细胞生存力(百分比) *通过台盼蓝染料排除法所测定的#感染的日期***培养基补充的日期表19胞内劳森氏菌拷贝数/容器(qRT-PCR)* *以科学计数法显示的数据(例如,1. 90E+09 = 1.0X 109)**在将CEV-I细胞种植入容器中后的天数按照本公开内容,可以制定和施行本文所公开和要求保护的所有方法而无需过度 实验。虽然依照不同的实施方案描述了本发明的方法,但对本领域技术人员而言显然的是, 可对本文所描述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行改变,而不背离本发明的构 思、精神和范围。更具体地,显然的是,某些在化学上和生理学上均相关的试剂可以代替本 文所描述的试剂,而达到相同或相似的结果。所有此类对于本领域技术人员而言显而易见 的类似替换和修饰均被认为是在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和构思之 内。实施例8.在Sf-21昆虫细胞中培养胞内劳森氏菌材料和方法。在使用前,将一瓶Graces昆虫细胞培养基(Gibco目录号11605-094) 温热至27°C 30分钟。获得包含IO6个Sf-21细胞/ml的Iml冷冻管,并在37°C下解冻15 分钟,以确保所有冷冻的悬浮液均消失。将在Graces培养基中的10%胎牛血清(FBS JRH 目录号12103-500M)+1%L-谷氨酰胺(L-glut ;Gibco目录号25030-081)用于细胞悬浮液。一旦将具有细胞的该冷冻管解冻,就将内容物重悬浮在IOml的在Graces中的 10% FBSU % L-glut之中,并且以800rpm离心5分钟以便从细胞中除去DMSO冷冻溶液。 当完成时,除去并丢弃上层溶液,然后将细胞轻轻地重悬浮在IOml的在Graces中的10% FBSU % L-glut 之中。将全部IOml的重悬浮的细胞转移至Corning T_75cm2烧瓶(目录号430641 ;通气 盖),并添加额外的5ml的在Graces中的10% FBSU % L-glut以使得培养瓶中的体积达到 15ml。将所述烧瓶于27°C培育1小时,然后完全重新供以15ml的在Graces中的10% FBS、
L-glut。该过程意在去除任何死亡的或未附着的Sf-21细胞。在第一次烧瓶重新供料 后一小时,再一次重复该过程。所得到的单层在日子结束时为大约40-45%。对于Sf-21细胞允许经过48小时以达到对数期生长(80_95%汇合的单层)。此 时,将细胞轻轻地洗入到上层培养基中。将培养基和细胞以1,OOOg离心5分钟,在这之后 丢弃上层培养基并且将细胞轻轻地重悬浮在5ml的在Graces中的10% FBS、1 % L-glut之 中以用于进一步繁殖。将所得到的细胞悬浮液稀释于25ml的在Graces培养基中的10% FBSU % L-glut 之中,并分开至2个T-75cm2培养瓶中。再次将所述烧瓶于27°C培育1小时,然后重新供以 与之前相同的培养基制备物,以再次去除任何不能活的或死亡的细胞。一小时后再次重复 该过程,并且在感染前允许细胞不受阻碍地培育至少4小时。对于每个待被感染的T-75cm2烧瓶,于37°C解冻一个包含上层胞内劳森氏菌 (IO5-IO6个胞内劳森氏菌/ml)的冷冻管。留一个烧瓶用于细胞繁殖,而另一个用于用胞内 劳森氏菌进行感染。
一旦将冷冻管完全解冻,就将其加至大约20-30%汇合的Sf-21细胞单层。优选的 感染点为在未感染的Sf-21细胞的第二次重新供料后4-6小时。将每个经感染的烧瓶抽空至500mmHg,并且在转移到27°C培养箱中之前用100% H2充气大约30秒。Sf-21昆虫细胞的分裂周期为大约48-60小时,因此,培养物在这样的 时刻进行繁殖或终止。在感染后大约40-42小时,刮下Sf-21细胞单层,并依照IPX(单克 隆的或多克隆的)染色技术进行染色以评价Sf-21细胞的感染百分比。实施例9.在适应于单层生长的Sf-21昆虫细胞中培养胞内劳森氏菌材料和方法。将大约106个Sf-21细胞添加至10ml的具有10%胎牛血清(FBS JRH 目录号 12103-500M)和 1% L-谷氨酰胺(L-glut ;Gibco 目录号 25030-081)的 Graces 昆 虫细胞培养基(Gibco目录号11605-094)中。将全部10ml的重悬浮的细胞转移至Corning T-75cm2烧瓶(目录号430641 ;通气盖),并添加额外的5ml的在Graces中的10%FBSU% L-glut以使得培养瓶中的体积达到15ml。将所述烧瓶于27°C培育1小时,然后完全重新供 以15ml的在Graces中的10% FBSU% L-glut,以便去除任何死亡的或未附着的Sf-21细 胞。对于Sf-21细胞允许经过48小时以达到对数期生长(80_95%汇合的单层)。此 时,将细胞轻轻地洗入到上层培养基中。将培养基和细胞以l,000g离心5分钟,在这之后 丢弃上层培养基并且将细胞轻轻地重悬浮在5ml的在Graces中的10%FBS、1% L-glut之 中以用于进一步繁殖。将所得到的细胞悬浮液稀释于25ml的在Graces培养基中的10% FBSU% L-glut 之中,并分开至2个T-75cm2培养瓶中。再次将所述烧瓶于27°C培育1小时,然后重新供以 与之前相同的培养基制备物,以再次去除任何不能活的或死亡的细胞。一小时后再次重复 该过程,并且在感染前允许细胞不受阻碍地培育至少4小时。对于每个待被感染的T-75cm2烧瓶,于37°C解冻一个包含上层胞内劳森氏菌(105 个胞内劳森氏菌/ml)的冷冻管。一旦将冷冻管完全解冻,就将其加至大约20-30%汇合的 Sf-21细胞单层。优选的感染点为在未感染的Sf-21细胞的第二次重新供料后4-6小时。将每个经感染的烧瓶抽空至500mmHg,并且在转移到27°C培养箱中之前用100% H2充气大约30秒。在感染后大约40-42小时,刮下Sf-21细胞单层,并依照IPX(单克隆的 或多克隆的)染色技术进行染色以评价Sf-21细胞的感染百分比。结果。大约10至15%的Sf-21单层被超过30个胞内劳森氏菌/细胞感染,从而 产生大约106至107个胞内劳森氏菌/T-75烧瓶。
权利要求
在非哺乳动物细胞中使胞内劳森氏菌生长的方法,其包括a.将所述细胞种植入含有合适的培养基的容器中;b.用胞内劳森氏菌接种所述细胞;c.使经接种的细胞生长;和d.收获胞内劳森氏菌。
2.权利要求1的方法,其中所述细胞选自昆虫细胞、Schneider细胞和禽类细胞。
3.权利要求2的方法,其中所述昆虫细胞选自Sf9细胞、SF21细胞、SF+细胞、Hi-Five 细胞或昆虫幼虫细胞。
4.权利要求3的方法,其中所述细胞为Sf9昆虫细胞。
5.权利要求2的方法,其中所述禽类细胞选自CEV-1细胞或禽类胚胎细胞。
6.权利要求1的方法,其中所述培养基不含动物蛋白质。
7.权利要求1的方法,其中所述培养基含有动物蛋白质。
8.权利要求1的方法,其中所述生长在大约20°C至大约39°C的温度下进行。
9.权利要求1的方法,其中所述细胞为昆虫细胞,并且所述生长在大约25°C至大约 29 °C的温度下进行。
10.权利要求1的方法,其中所述细胞为禽类细胞,并且所述生长在大约35°C至大约 39 °C的温度下进行。
11.权利要求1的方法,其中所述容器含有微需氧或需氧条件。
12.权利要求11的方法,其中所述微需氧条件包含大约10%氢气、大约10%C02和大 约80%氮气的气体混合物。
13.权利要求1的方法,其中感染复数(M0I)为大约0.000001至大约10,其通过定量 反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)来测量。
14.权利要求1的方法,其中使用qRT-PCR,M0I为大约0.0001至大约10。
15.权利要求1的方法,其中在用胞内劳森氏菌接种所述细胞后大约5至大约25天,收 获胞内劳森氏菌。
16.权利要求1的方法,其中在用胞内劳森氏菌接种所述细胞后大约9至大约15天,收 获胞内劳森氏菌。
17.权利要求16的方法,其中以大约100,000至大约10,000,000个细胞/ml的密度种植所述细胞。
18.权利要求16的方法,其中以大约500,000个细胞/ml至大约1,500,000个细胞/ml的密度种植所述细胞。
19.权利要求16的方法,其中所述培养基不含动物蛋白质。
20.权利要求19的方法,其中以大约10,000至大约1,000,000的密度种植所述细胞。
21.权利要求19的方法,其中以大约60,000至大约250,000个细胞/cm2的密度种植 所述细胞。
22.权利要求19的方法,其中所述培养基含有动物蛋白质。
23.权利要求22的方法,其中所述动物蛋白质以大约0.5%至大约10%的浓度存在。
24.权利要求1的方法,其中以至少2-3升的体积,使经接种的细胞在培养基中生长。
25.权利要求24的方法,其中以至少100升的体积,使经接种的细胞在培养基中生长。 全文摘要
本发明总体而言涉及胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)在非哺乳动物细胞中的生长以及所述细菌的大规模生产。
文档编号C12R1/01GK101874106SQ200880117512
公开日2010年10月27日 申请日期2008年10月14日 优先权日2007年10月12日
发明者乔纳森·埃文思, 凯瑟琳·J·斯特里采尔, 康妮·格布哈特, 拉珍德拉·克里什南, 格雷戈里·P·尼采尔, 沙拉斯·K·雷, 迈克尔·约翰·休特 申请人:辉瑞大药厂;康妮·格布哈特