专利名称：图案化的细胞片层和其生产方法
图案化的细胞片层和其生产方法
背景技术：
本发明涉及组织工程领域。更具体地，本发明涉及图案化的(patterned)细胞片 层(cell sheets)和它们的生产方法。再生医学是医学领域内即将出现的新学科。在再生医学中使用了许多方法和手 段。它们可以粗略地分为四个领域，包括体外和体内组织工程在体外组织工程中，利用支架和细胞组织在身体外生长。工程化的组织随后被植 入患者中以替换损伤的或失去的组织。在体内组织工程中，支架被置于损伤的组织区域中，目的是诱导来自周围健康组 织的细胞的生长以恢复损伤的组织。然而，支架的使用遭受了许多不利之处和缺点的困扰。在具体的应用中，细胞片层 工程化可以避免基于支架的组织重建和细胞疗法的局限性。细胞片层已经用于眼表组织、 牙周韧带、心脏补片(cardiac patches)的重建和膀胱扩大术。对于更复杂的应用，需要细 胞被置于特定位置或预定的图案，因此图案化的细胞片层是期望的。对于甚至更复杂的组 织的重建，需要使用非均质的多细胞片层。对于这种目的，不同的细胞类型必须以图案化的 方式共同培养，以获得其中不同的细胞类型被以期望的图案微图案化的细胞片层。获得图案化的细胞片层的现有技术的方法是基于使表面图案化，在所述表面上培 养细胞。这些方法需要利用(软)平版印刷(lithography)单独图案化每个基底。此外， 这些方法不能促成自立(freestanding)图案化细胞片层的生产。
背景技术：
在US6939378中，公开了用于膜性组织(membranous tissue)的处理的方法，其提 供了蛋白水解酶在所述膜性组织上的沉积，有效地生物蚀刻所述膜性组织的表面和内部来 向所述组织提供期望的拓扑和表面粘附性质。然而，如此产生的细胞片层的释放可能是麻烦的，因为剩余的细胞通过细胞外基 质蛋白，例如胶原，尤其是纤维蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白(nidogen) 和整联蛋白，以及由于纯粹的粘附和静电力，紧紧地附着于基底上。在Tsuda 等.，Biomaterials 26 (2005)，1885-1893 中，公开了自立的非均质的图 案化细胞片层以及生产这样的细胞片层的方法。然而，所述方法具有一些严重的缺点，例 如，尤其是，(i)它涉及使用一种基底，其制造非常复杂，涉及多个(图案化的)电子束照射 步骤，(ii)它仅展现了具有两种不同细胞类型的细胞片层，而包含超过两种细胞类型的细 胞片层难以用所述方法获得，和(iii)在所述方法中，一种细胞类型需要在27°C培养，对于 细胞生长、细胞增殖、细胞分化等等，这与最理想的条件相距很远。发明目的因而，本发明的目的是提供避免了这些局限性、用于生产包含至少两种不同细胞 类型的细胞片层的方法。根据独立权利要求的生产图案化细胞片层的方法满足了这个目的。从属权利要求
4提供了优选的实施方式。发明概述在详细地描述本发明之前，要理解的是，本发明不限于所描述的设备的特定组成 部件或所描述的方法的过程步骤，因为这样的设备和方法可以变化。还要理解的是，在此使 用的术语仅用于描述特定实施方式，而不是意味着是限制性的。必需指出的是，如在本说明 书和附随的权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括单数和/或复数的所指 对象，除非上下文明显地另有指示。此外要理解的是，在给出由数值划定的参数范围的情况 下，所述范围被认为包括这些界限值。本发明的所述目的的其他细节、特征、特性和优点在从属权利要求、附图、和后面 的相应附图以及实施例的描述中公开，其以示范性的方式显示了根据本发明的优选的实施 方式。然而，这些图绝不能被理解为限制本发明的范围。为了提供详尽的公开而不过度地延长说明书，申请人在此通过引用来合并上文提 及的每一个专利和专利申请。上文详述的实施方式中要素和特征的特定组合仅是示范性的；同样明确地考虑了 这些教导与本文中以及通过引用合并的专利/申请中的其他教导的互换和替换。如本领域 技术人员将认识到的那样，本领域技术人员可以想到在此描述的内容的改变、修改和其他 实施，而不背离所要求保护的本发明的精神和范围。因此，上述描述仅是作为实例，而不是 意图作为限制。本发明的范围在以下的权利要求和它的等同方式中来限定。此外，在说明 书和权利要求中使用的附图标记不限制所要求保护的本发明的范围。根据本发明，提供了用于生产包含至少两种不同细胞类型的细胞片层的方法，所 述方法包括以下步骤a)提供布置在基底上的连续的细胞片层，所述基底包含可诱导的形状转变性 质(inducible shape transition properties)禾口 / 或可改$白勺特t生(alterable surface characteristics)；b)使所述连续的细胞片层以图案化方式暴露于释放剂；c)在暴露于所述释放剂之后洗涤所述细胞片层，以除去已被所述释放剂影响的细 胞，和d)使用第二细胞类型重新填充(!^populating)在被所述释放剂影响的细胞已被 除去之后留下的缺口(gaps)。出人意料地，结果这样的方法避免了上文阐述的、根据先有技术的方法所涉及的缺点。此外，发明人出乎他们意料地发现，在US 6939378中描述的生物蚀刻方法也可以 应用于单层细胞片层，而之后蚀刻的区域可以用第二细胞类型重新填充。根据本发明的方 法因而实质上促成了自立的非均质的图案化细胞片层的制造。术语“以图案化的方式”，包括规则图案，例如格栅，或不规则图案。这个定义此外 包括不均勻的图案。如在此使用的，术语“包含可诱导的形状转变性质的基底”应该涉及这样的基底， 其在给与刺激时，改变它的形状、它的体积、它的水含量和/或它的比重。包含在这样的基 底中的潜在的材料，以及可用于引发所述转变的潜在刺激在下文中讨论。
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如在此使用的，术语“包含可改变的表面特性的基底”应该涉及这样的基底，其在 给与刺激时，改变它的表面特性的至少一种，所述表面特性选自由表面张力、表面亲水性、 表面净电荷、表面接触角、表面粗糙度和表面粘附力构成的组。如在此使用的，术语“释放剂”应该涉及这样的试剂，其支持在细胞与所述试剂接 触时单独的细胞的释放。因而，在相应的细胞与基底或邻近细胞之间的附着性连接，直接和 间接地被分别破坏、分离、消化等等。这样的附着性连接可以例如是细胞外基质的一部分， 例如锚定蛋白质，潜在的释放剂在下文讨论。在一个优选的实施方式中，上述方法进一步包括步骤b)_d)的至少一次重复。优 选地，在第二(以及任选的后续的)循环中所述细胞片层所暴露于的释放剂图案，优选地不 同于在前一循环，例如第一循环中的图案。在本发明的又一个优选的实施方式中，提供了生产自立的细胞片层的方法，所 述方法包括至少两种不同的细胞类型，所述方法除了包括在前述权利要求中列出的步骤 a)-d)之外，还包括步骤e)通过在所述基底中诱导形状转变释放如此获得的细胞片层。出人意料地，结果是，包含可诱导的形状转变性质和/或可改变的表面特性的基 底的使用解决了与细胞片层的释放相关的上述难题。发明人发现，在很多情况下，在基底 形状转变或它的表面特性改变之后，通常由于所产生的缺口而相当脆弱的图案化的细胞层 可以容易地从基底上释放而不需要另外使用释放剂。如此释放的细胞层可以容易地移位 到另一个基底，结果细胞是非常有生命力的，即，它们可以用于异形组织(heterogeneous tissues)的生产。这对于它们在组织工程中的使用是重要的要求。在一个优选的实施方式中，提供的是所述释放剂是化学试剂。这样的化学释放剂 可以是例如，EDTA，已知其结合二价阳离子如Ca2+，Ca2+是整联蛋白的辅因子，并且涉及胶原 合成。因而单独使用EDTA可以引起细胞外基质的破坏，因而引起细胞释放。这同样适合于 EGTA,然而其优先地结合Ca2+。本领域技术人员将从该教导发现其他的化学试剂，所述化学试剂的应用引起细胞 外基质的破坏，并因而引起细胞释放。因此这些实施方式被认为落入了本发明的范围。其他化学释放剂包括细胞毒性试剂(cytotoxic agents) 0在这种情况下，相应的 细胞被灭活或杀死，这导致它们的解体(disintegration)，和随后导致它们的释放。这意味 着，与导致直接破坏、分离或消化的那些处理相反，在相应的细胞与基底或邻近细胞之间的 附着性连接分别被间接地破坏、分离或消化。在又一个优选的实施方式中，提供的是，所述释放剂是酶。所述酶优选是蛋白水解 酶，如胰蛋白酶、胶原酶或链霉蛋白酶(pronase)。这些酶消化大部分细胞外基质蛋白，例如 纤连蛋白，还有胶原，尤其是纤维蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白和整联蛋白，并因此 将导致细胞释放。其他潜在的酶是分裂酶(splitase)，其是一种甲壳动物酶，其在由于污染 的风险(BSA、病毒等等)而不能使用通常为牛来源的前述酶的某些应用中是有用的。在这些酶中，胰蛋白酶由于对所有主要的细胞外基质蛋白的广泛活性、以及它对 细胞的活性和生存力的低影响是特别优选的。在一个优选的实施方式中，所述酶与EDTA或EGTA组合使用。EDTA或EGTA的添加 产生了上文描述的效果。此外，二价阳离子(尤其是Ca2+)倾向于抑制蛋白酶，特别是胰蛋 白酶。使用EDTA将这些阳离子从培养基中去除因而将提高所述酶的活性。
本领域技术人员将从这种教导发现其他酶，所述酶的应用引起至少部分细胞外基 质的消化，并因而引起细胞释放。因而这些实施方式被认为落入了本发明的范围。在又一个优选的实施方式中，提供的是，所述释放剂是物理刺激。这样的物理刺 激可以是例如任何类型的电磁或粒子辐射，如激光照射、X-射线、α-、β-或γ-辐射。 这些刺激可以通过扫描设备与所述细胞片层接触，所述扫描设备即提供了辐射的小斑点 的设备，所述斑点然后以图案化方式在细胞层上扫描，或可以通过投影装置与所述细胞片 层接触，所述投影装置在细胞片层上提供图案化的辐射方案，类似于根据照相平板印刷术 (photolithography)所知的过程。再一次，相应的细胞被灭活或杀死，这导致它们的解体， 和随后导致它们的释放。这意味着，与导致直接破坏、分离或消化的那些处理相反，在相应 的细胞与基底或邻近细胞之间的附着性连接分别被间接地破坏、分离或消化。其他物理刺激可以包括电的施加。这些刺激可以通过图案化的电极阵列、或在所 述细胞层的表面扫描的至少一个电极与所述细胞片层接触。在这些情况中，以这样的方式 选择电参数，从而与电极接触的细胞被灭活或杀死，这导致它们的解体，并随后导致它们的 释放。这意味着，与导致直接破坏、分离或消化的那些处理相反，在相应的细胞与基底或邻 近细胞之间的附着性连接分别被间接地破坏、分离或消化。其他物理刺激可以包括热刺激，即加热和/或冷却的施用。这样的刺激可以通 过图案化的印模(stamp)，例如在接触细胞的一侧具有格栅化图案的压电元件(piezo element)，或通过在细胞层的表面上扫描的至少一个热探针施加给细胞。以这样的方式选 择热参数，从而与电极接触的细胞被灭活或杀死，这导致它们的解体，并随后导致它们的释 放。这意味着，与导致直接破坏、分离或消化的那些处理相反，在相应的细胞与基底或邻近 细胞之间的附着性连接分别被间接地破坏、分离或消化。再其他的物理刺激可以包括物理力的应用，即，压力或真空的应用。再一次，所述 施用必须以图案化方式发生，例如，通过图案化的印模或图案化的真空元件，或通过在细胞 层的表面扫描的扫描压力探针或扫描真空元件。以这样的方式选择物理参数，从而与电极 接触的细胞被灭活或杀死，这导致它们的解体，并随后导致它们的释放。这意味着，与导致 直接破坏、分离或消化的那些处理相反，在相应的细胞与基底或邻近细胞之间的附着性连 接分别被间接地破坏、分离或消化。优选地，所述释放剂被加载到印模上，所述印模具有对应于要产生的细胞图案的 浮雕结构(relief structure)。当使用化学或酶释放剂时这种方法是特别有用的。在一个优选的实施方式中，所 述浮雕可以提供图案化的微腔，其容纳小体积的释放剂，如酶或螯合剂。所述印模然后与细 胞片层接触，在此它保持给定的时间以使相应的试剂与细胞接触。在另一个优选的实施方式中，所述释放剂(也称为“生物墨水(biological ink)”)在第一步骤(称为“上墨步骤(inking step)")中扩散到印模材料中，即使所述印 模浸透释放剂，在第二步骤(称为“印刷步骤”)中当与细胞层接触时，所述释放剂从印模材 料中扩散出来，或由于压力的施加而从印模材料中被挤出。仅在细胞片层和印模之间的接触区域中，细胞才暴露于所述释放剂，即胰蛋白酶， 并仅在那些区域中，相应的细胞与基底或邻近细胞之间附着性连接才被所述释放剂断开， 和细胞被从基底释放。换句话说，通过释放剂的微接触印刷(microcontactprinting)，实现
7了细胞的图案化的释放。优选地，这样的印模由弹性体制成，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。这样的具有图案化 的浮雕结构的弹性体印模根据微接触印刷领域已知的标准过程来生产。在另一个优选的实施方式中，所述释放剂通过绘图仪(plotter)以图案化方式施 用给细胞。再一次地，当使用化学或酶释放剂时这种方法是特别有用的。这种绘图仪例如可 以类似于喷泡式打印机(bubble jet printer)或针式打印机来工作。此外，所述包含可诱导的形状转变性质和/或可改变的表面特性的基底是水凝 胶。在此使用的术语“水凝胶”是指，相应材料的至少一部分包含在水中形成水溶胀网络和 /或水溶性聚合物链的网络的聚合物。优选地，水凝胶渗透层在溶胀状态包含> 50%的水 和/或溶剂，更优选> 70%，最优选的> 80%。响应性的(responsive)水凝胶是特别优选的。在本发明的意义上，术语“响应性 的”特别是指和/或包括所述水凝胶是以这样的方式是响应性的，在特定参数发生改变或应 用特定刺激时，它经历形状和总体积的改变，其性质在上文中有进一步描述(例如，诱导的 PH改变、诱导的温度改变、对电磁波的诱导的暴露、对特定盐或有机化合物或对它们的给定 浓度的诱导的暴露、电场的施加、磁场的施加、声音的施加、振动的施加)。其他刺激包括，专 用的被分析物例如酶或其他生物分子的存在或浓度。(参见上述说明)。已知水凝胶对pH、离子浓度、温度、溶剂组成和/或电势是形状敏感的。这些参数 可以导致相、形状、机械结构(mechanics)、折射率、识别或渗透率的改变，其随后可以逆转 来使所述材料返回它的初始状态。此外，在pH、离子浓度、温度、溶剂组成和/或电势改变时，这些水凝胶可以经历它 的表面特性的改变，如表面张力、表面亲水性、表面净表面接触角、表面粗糙度和表面粘附 力。刺激敏感性水凝胶还已经与酶、蛋白质模拟物和抗体整合，来设计可控制的致动 器(actuators)。这些水凝胶已经显示在添加目标分子时发生溶胀。这些水凝胶的溶胀量 归因于聚合物网络内非共价相互作用的改变。水凝胶还可以被设计为在存在目标分子时溶 胀；甚至它们可以以这样的方式构建溶胀的大小可以与存在的配体的浓度成比例。根据本发明的一个实施方式，所述水凝胶材料包括选自包含聚(甲基)丙烯酸类 材料、取代的乙烯基材料或其混合物的材料，以及包括环氧化物(印oxydes)、氧杂环丁烷类 (oxetanes)禾口硫醇烯(thiolenes)。根据本发明的另一个实施方式，所述水凝胶材料包括由至少一种(甲基)丙烯酸 类单体和至少一种多官能的(甲基)丙烯酸类单体的聚合而制得的聚(甲基)丙烯酸类材 料。根据本发明的又一个实施方式，所述(甲基)丙烯酸类单体选自包括N-异丙基 (甲基)丙烯酰胺(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羟乙基酯、(甲基)丙烯酸乙氧基乙 氧基乙基酯或其混合物的组。根据本发明的再另一个实施方式，所述多官能的(甲基)丙烯酸类单体是二 _(甲 基)丙烯酰基和/或三_(甲基)丙烯酰基和/或四_(甲基)丙烯酰基和/或五_(甲基) 丙烯酰基单体。
根据本发明的一个实施方式，所述多官能的(甲基)丙烯酸类单体选自包括二 (甲基)丙烯酰胺、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇 二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、聚乙 二醇二(甲基)丙烯酸酯、乙氧基化的双酚-A-二(甲基)丙烯酸酯、己二醇二(甲基)丙 烯酸酯或其混合物的组。在发明人所进行的测试中结果适合于上述目的的其他材料包括(甲基) 丙烯酸乙基己基酯、(甲基)丙烯酸羟乙基酯、PNIPAA-co-(甲基)丙烯酸异丁基 酯(80 20)、PMMA、PMMA-CO-三羟甲基丙烧三丙烯酸酯、TMPTA、DEGDA、DE⑶MA、聚 苯乙烯、PMMA-co-DEGDA(2 1)、PMMA-co-DE⑶MA (2 1)、PS-co-TMPTA (2 1)、 PS-co-DEGDA (2 1)、PS-co-DE⑶MA (2 1)和三2-羟乙基异氰脲酸酯三丙烯酸酯。根据本发明的一个实施方式，所述水凝胶材料包括阴离子聚(甲基)丙烯酸类材 料，优选选自包括(甲基)丙烯酸、2-乙基丙烯酸、2-丙基丙烯酸、芳基磺酸特别是苯乙烯 磺酸、衣康酸、巴豆酸、磺酰胺类(sulfonamides)或其混合物的组，和/或阳离子聚(甲基) 丙烯酸类材料，优选选自包括乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、(甲基)丙烯酸氨基乙基酯或其混 合物的组，与至少一种选自中性单体的单体共聚，所述中性单体优选选自醋酸乙烯酯、(甲 基)丙烯酸羟乙酯、(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯或其混合物，或它 们的混合物。已知的是，对于宽范围这些共聚合物作为pH的函数或响应于施加的电场和/或电 流改变它们的形状。因而，这些材料可能对本发明内宽范围的应用是有用的。根据本发明的一个实施方式，所述水凝胶材料包括取代的乙烯基材料，优选乙烯 基己内酰胺和/或取代的乙烯基己内酰胺。根据本发明的一个实施方式，所述水凝胶材料基于热响应性的单体，选自N-异丙 基酰胺、二乙基丙烯酰胺、羧基异丙基丙烯酰胺、羟基甲基丙基甲基丙烯酰胺、丙烯酰基烷 基哌嗪，以及其与选自亲水性单体的单体的共聚物，所述亲水性单体包括(甲基)丙烯酸羟 乙酯、(甲基)丙烯酸、丙烯酰胺、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或其混合物，和/或与选自疏 水性单体的单体共聚，所述疏水性单体包括(甲基)丙烯酸(异)丁基酯、甲基丙烯酸甲 酯、(甲基)丙烯酸异冰片基酯或其混合物。这些共聚物已知是热响应性的，因而可能对本 发明内宽范围的应用是有用的。这些响应性水凝胶的一个优选的实例是聚-η-异丙基丙烯酰胺(PNIPAA)。此外，在根据本发明的方法的一个优选的实施方式中，提供的是，在包含形状转变 性质的基底中形状转变的诱导和/或在包含可改变的表面特性的基底中表面特性的改变， 包括选自由以下构成的组的至少一个步骤 提高和/或降低培养基(medium)的温度 提高和/或降低培养基的渗透压(osmolarity) 提高和/或降低培养基的pH 向培养基提供电刺激·向培养基提供光刺激，特别是IR或UV光 磁场，或其组合。
此外，提供了用于生产包含至少两个不同的片层的堆叠的细胞片层的方法，其至 少一个各自包含至少两种不同的细胞类型，除了包含前述权利要求中列出的步骤a)_e)之 外，所述方法还包括步骤f)重叠至少两个细胞片层，所述至少两个细胞片层中的至少一个片层是用根据前 述权利要求获得的方法获得的。根据上文的不同的细胞类型可以是(i)在生物学含义上不同的细胞类型，或(ii)它 们可以具有相同的来源，其中至少一个类型已经经历了选自以下构成的组的至少一种处理。 酶和/或药学处理， 基因操作处理， 暴露于电磁辐射或粒子辐射， 暴露于加热和/或冷却， 暴露于磁场， 在表型和/或遗传型表征之后的选择，等等。在又一个实施方式中，用任何前述方法产生细胞片层和/或细胞片层的叠层，其 中所述细胞片层和/或细胞片层的叠层具有图案化的形状，其中所述细胞片层和/或细胞 片层的叠层包含至少两种不同的细胞类型和/或至少两种不同的细胞片层。在这个实施方式中，提供的是，所述至少两个细胞片层的图案优选地以互补的方 式相互适应，以在细胞层被重叠时产生异形组织。在这个实施方式中，释放步骤e)可以在 步骤ii)之前或之后发生。落入该实施方式的范围内的一种选项是提供三个或更多个图案 化的细胞片层，其具有互补的图案，并且重叠它们以产生具有三种或更多种不同细胞类型 的组织。在本发明的又一个实施方式中，提供了细胞片层和/或细胞片层的叠层，所述细 胞片层和/或细胞片层的叠层包含图案化的形状，其中所述细胞片层和/或细胞片层的叠 层包含至少两种不同的细胞类型和/或至少两种不同的细胞片层。此外，提供了根据本发明的细胞片层和/或堆叠的细胞片层用于生产眼表组织、 牙周韧带、心脏补片、膀胱组织、二维组织、三维组织、骨骼材料、皮肤和/或软骨材料的用 途。在另一个实施方式中，提供了根据本发明的细胞片层用于生产堆叠的非均质的细 胞片层的用途。此外，提供了根据本发明的细胞片层、堆叠的细胞片层和/或产物用于生产人工 组织和/或器官的用途。此外，提供了根据本发明的细胞片层、堆叠的细胞片层、根据本发明的产物和/或 人工组织和/或器官用于人类或动物的治疗的用途。要提及的是，术语“图案化的形状”可以是例如，网格、细胞的成线条的布置、或用 于特定组织类型或组织补片的生产的与不同细胞类型的期望分布相应的任何图案。
实施例在下面，通过实施例展现本发明，其决不应该被理解为限制本发明的范围。
实施例1将具有图案化的浮雕结构的弹性印模部分地浸入包含胰蛋白酶作为释放剂的溶 液中。3T3小鼠成纤维细胞利用本领域已知的标准方法在6孔板中培养。当细胞达到> 90%汇合时，将孔板从培育器中取出，并且从孔中小心地吸出培养基。将装载了胰蛋白酶的 印模随后置于3T3小鼠成纤维细胞的连续片层上。将孔板放回培育器中培育5分钟，此后 小心地移除印模，用PBS小心地洗涤细胞片层。洗涤导致已经与释放剂接触的那些细胞的 释放，产生如附
图1所示的图案化的细胞片层，图1显示了具有网格图案(附图1A)或成线 条的图案(附图1B)的细胞片层。所述图案具有大约Imm的缺口大小。利用合适的印模可 以获得具有低至50 μ m的缺口大小的更小图案。实施例2通过在包含可诱导的形状转变性质和/或可改变的表面特性的基底上生长细胞， 可以在微接触印刷步骤之后通过诱导所述基底的形状转变来释放图案化的细胞片层。这样 的基底可以是例如用聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAA)的薄层覆盖的琼脂。所述形状转变 通过将温度降低到低于32°C来诱导。在这个温度，聚(N-异丙基丙烯酰胺)显示了从坍塌 的疏水性状态向亲水性溶胀水凝胶状态的转变，影响细胞对基底的亲和力。作为这种转变 的结果，图案化的细胞片层将从基底释放，而不破坏细胞之间的相互作用。任选地，图案化 的细胞片层可以在形状转变之前用释放剂处理以促进释放。用于诱导所述形状转变的刺激是热刺激。在室温，所述响应性水凝胶显示了在 水中的强溶胀。然而，在用于细胞培养的培育器中，维持约37°C的温度，其引起水凝胶坍 塌(PNIPAA 具有在 33°C 的最低临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST))。附图简述本发明的目的的其他细节、特征、特性和优点在从属权利要求、附图、和之后的相 应附图以及实施例的描述中公开，其以示范性的方式显示了根据本发明的方法和薄片的优 选实施方式。附图Ia和Ib显示了具有单细胞层的图案化的细胞片层的显微照片，其形成了包 含至少两种不同的细胞类型的自立的细胞片层的一部分。显微照片中的特征尺寸是大约 Imm0在附图Ia中，获得的图案是网格图案。为此，用于印刷步骤的印模具有方块的图 案，在不同的方块之间具有网格样凹槽。在附图Ib中，获得的图案是线条图案。为此，用于 印刷步骤的印模具有线条图案，在它们之间具有线条形的凹槽。附图2显示了用单细胞层制备图案化的细胞片层的方法，细分成三个子步骤 A( “上墨步骤”)、B( “印刷步骤”)和C( “洗涤步骤”)。在步骤A中，提供了由弹性材料制 成的、具有浮雕图案(带有凸出物22)的印模21，其之前已经用根据本发明的释放剂浸泡 (“上墨步骤”)。在步骤B中，将印模然后置于同源的(homologous)细胞片层23上，所述 细胞片层23在陪替氏培养皿24中在包含可诱导的形状转变性质和/或可改变的表面特性 的基底25上生长。一旦与细胞片层接触，所述释放剂扩散到细胞片层中，或由于施加压力 而被挤出印模材料。在给定的培育时间之后，印模被除去，与释放剂接触的细胞26在步骤 C中被洗去。如此产生的图案化的细胞片层然后可以根据描述从包含可诱导的形状转变性
11质和/或可改变的表面的基底25释放。附图3显示了具有单细胞层的图案化细胞片层的释放，其在陪替氏培养皿31中在 包含可诱导的形状转变性质和/或可改变的表面特性的基底32上生长。给定的刺激导致 基底33的形状转变，其进而促成了细胞片层的释放，而没有另外使用释放剂。如此释放的 细胞层34可以容易地移位到另一个基底，并且细胞保持是非常有生命力的，S卩，它们可以 用于异形组织的生产。这对于它们在组织工程中的使用是重要的要求。例如，所述刺激可 以选自以下构成的组 提高和/或降低培养基的温度(Δ H) 提高和/或降低培养基的渗透压(Osm) 提高和/或降低培养基的PH值(ρΗ) 对培养基的电刺激(U) 对培养基的光刺激(h υ )例如，如果所述基底由被聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAA)的薄层覆盖的琼脂组 成，则所述形状转变通过降低温度到低于32°C来诱导。在这个温度，聚(N-异丙基丙烯酰 胺)显示了从坍塌的疏水性状态向亲水性溶胀水凝胶状态的转变，影响细胞对基底的亲和 力。作为这种转变的结果，图案化的细胞片层将从基底释放，而不破坏细胞之间的相互作 用。任选地，图案化的细胞片层可以在形状转变之前用释放剂处理以促进释放。用于诱导所述形状转变的刺激是热刺激。在室温，所述响应性水凝胶显示了在水 中的强溶胀。然而，在用于细胞培养的培育器中，维持约37°c的温度，其引起水凝胶坍塌 (PNIPAA具有在33°C的最低临界溶解温度(LCST))。还要注意的是，落入上述描述的进一步的实施方式在正文中有描述。附图4显示了用于生产包含至少两种不同的细胞类型的细胞片层的根据本发明 的一种方法，具有步骤41-45。步骤41展现了生长连续的细胞片层的步骤，优选在包含形 状转变性质和/或可改变的表面特性的基底上。步骤42展现了如附图2所示的图案化的 “印刷和释放步骤”。注意，在三个不同的列中，产生了不同的图案。步骤43展现了使用第 二细胞类型的重新填充步骤。步骤44展现了如此产生的非均质的细胞片层的释放步骤，如 附图3中所示。对于该步骤，基底的形状转变性质和/或可改变的表面特性是重要的(参 见说明书)。步骤45展现了堆叠如此产生的不同的非均质细胞片层的步骤，以形成异形组 织或补片。这样的补片例如可以用于眼表组织、牙周韧带、心脏补片、膀胱组织、二维组织、 三维组织、骨骼材料、皮肤和/或软骨材料的生产。注意，除了在附图4中显示的，所述补片也可以由两个或超过三个非均质的细胞 片层组成。在这方面，要提及的是，在本发明的优选的实施方式中， 包含形状转变性质和/或可改变的表面特性的基底的厚度，优选水凝胶层的厚 度，在彡5nm和彡50 μ m的范围内。 在包含形状转变性质和/或可改变的表面特性的基底是PNiPAA的情况下，基底 的厚度在彡5nm和彡50 μ m的范围内，更优选在彡5nm和彡50nm的范围内。 细胞片层的面积在彡Icm2和彡500cm2的范围内。 在用于诱导包含形状转变性质的基底中的形状转变和/或表面特性的改变的刺激是温度刺激(ΔΤ)的情况下，这样的刺激在彡0.05和彡5°C、优选彡2°C的范围内 产生的细胞图案具有宽度和/或距离在彡3μπι和彡20mm的范围内的间隔、细 胞缺口等等， 用于产生细胞图案的仪器，例如印模，包含蚀刻图案，所述蚀刻图案具有宽度和 /或距离在彡3μπι和彡20mm范围内的网格、间隔、缺口等等。
权利要求
用于生产包含至少两种不同细胞类型的细胞片层的方法，所述方法包括以下步骤a)提供布置在基底上的连续的细胞片层，所述基底包含形状转变性质和/或可改变的表面特性；b)使所述连续的细胞片层以图案化方式暴露于释放剂；c)在暴露于所述释放剂之后洗涤所述细胞片层，以除去已被所述释放剂影响的细胞，和d)使用第二细胞类型重新填充在被所述释放剂影响的细胞已被除去之后留下的缺口。
2.根据权利要求1的方法，进一步包含步骤b)-d)的至少一次重复。
3.用于生产包含至少两种不同细胞类型的自立的细胞片层的方法，所述方法除了包括 前述权利要求中列出的步骤a) -d)之外，还包括以下步骤e)通过在所述基底中诱导形状转变释放如此获得的细胞片层。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述释放剂是化学试剂、酶、或物理刺 激、或这些的任何组合。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述释放剂被加载到具有浮雕结构的 印模上，其中所述浮雕结构对应于要产生的细胞图案。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于将所述释放剂通过绘图仪以图案化方 式施用给所述细胞。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述包含形状转变性质的基底是水凝胶。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于在包含形状转变性质的基底中形状转 变的诱导和/或在包含可改变的表面特性的基底中表面特性的改变，包括至少一个选自以 下的步骤 提高和/或降低培养基的温度 眷提高和/或降低培养基的渗透压 提高和/或降低培养基的PH值 向培养基提供电刺激。
9.用于生产包含至少两个不同片层的堆叠的细胞片层的方法，其中所述至少两个不同 片层的至少一个包含至少两种不同的细胞类型，所述方法除了包括前述权利要求中列出的 步骤a)_e)之外，还包括以下步骤f)重叠至少两个细胞片层，其中至少一个片层是用根据前述权利要求的方法获得的。
10.用任何前述的方法生产的细胞片层和/或细胞片层的叠层，其中所述细胞片层和/ 或细胞片层的叠层具有图案化的形状，其中所述细胞片层和/或细胞片层的叠层包含至少 两种不同的细胞类型和/或至少两种不同的细胞片层。
11.细胞片层和/或细胞片层的叠层，所述细胞片层和/或细胞片层的叠层包含图案化 的形状，其中所述细胞片层和/或细胞片层的叠层包含至少两种不同的细胞类型和/或至 少两种不同的细胞片层。
12.根据权利要求10或11的细胞片层用于生产堆叠的非均质细胞片层的用途。
13.根据权利要求10或11的细胞片层、和/或根据权利要求12的堆叠的细胞片层用 于以下的生产的用途 眼表组织 牙周韧带 心脏补片 膀胱组织 二维组织 三维组织 眷骨骼材料和/或 眷软骨材料。
14.根据权利要求10或11的细胞片层、根据权利要求14的堆叠的细胞片层、和/或根 据权利要求15的产物用于生产人工组织和/或器官的用途。
15.根据权利要求10或11的细胞片层、根据权利要求13的堆叠的细胞片层、根据权利 要求13的产物、和/或根据权利要求14的人工组织和/或器官用于人类或动物的治疗的用途。
全文摘要
本发明涉及用于生产包含至少两种不同细胞类型的细胞片层的方法，所述方法包括步骤提供布置在基底上的连续的细胞片层，所述基底包含形状转变性质和/或可改变的表面特性；使所述连续的细胞片层以图案化方式暴露于释放剂；在暴露于所述释放剂之后洗涤所述细胞片层，以除去已被所述释放剂影响的细胞，和使用第二细胞类型重新填充在被所述释放剂影响的细胞已被除去之后留下的缺口。
文档编号C12N5/00GK101896600SQ200880120101
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月10日
发明者D·J·布罗尔, E·皮特斯, H·德科宁, R·库尔特, R·彭特曼 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司