多个核酸平行定量分析用设备及方法

专利名称：多个核酸平行定量分析用设备及方法
技术领域：
本发明涉及进行实时PCR的方法和执行本发明的方法的设备。本发明尤其适用于 样品(如生物样品)中存在的核酸的同时鉴定和定量。另外，本发明涉及应用组合高表面特异性读取设备的集成核酸微阵列同时定量分 析一个区室中的多个核酸序列的方法。本发明涉及设备，其中，是室表面的一部分的表面或者构建在反应室内的表面 (如珠表面)包被了捕获探针，且PCR反应就在同一室中进行。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一种扩增特定核酸序列的方法。PCR是发生在溶液中 的酶反应。当扩增过程被实时监控时，PCR可用于定量分析。实时PCR通常使用荧光报告 子，如嵌入染料、Taqman探针，蝎形引物，分子信标。当分析不只一个核酸靶序列时，可采取 两种方法。第一种方法是平行反应，即令各反应分别在不同区室进行。第二种方法是复行 (multiplex)反应，即反应在同一区室中进行且使用用于各反应的不同荧光团报告子。此方 法受可被有效区分的荧光团数目的限制。当前现有技术可复行6个反应。

发明内容
本发明的主题是扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个 区室内扩增和检测的所述同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大于7，更优选大于10。本发明的主题是扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中固定于表面的与所述多个核酸序列互补的寡核苷酸探针起到所述多个经扩 增核酸序列的捕获探针的作用；且其中被捕获到捕获位点的所述多个经扩增核酸序列的检测使用检测接近所述表 面的信号的表面特异性检测法进行。根据本发明，表面特异性检测由表面特异性检测系统和/或待检测信号的表面特 异性产生来得到。本发明的一个实施方式是本发明的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方 法，其中引物经标记，且用表面特异性检测系统检测杂交的经标记的扩增子，所述表面特异 性检测系统检测结合到所述表面的那些标记物，但基本上不检测溶液中的标记物。本发明的另一实施方式是本发明的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所 述捕获探针是具有荧光标记物和淬灭剂的捕获探针，所述荧光标记物和淬灭剂由于所述探 针结构而比邻，且当扩增子与所述捕获探针杂交时可检测到信号。本发明的另一特定实施方式是同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕 获探针是具有荧光标记物和淬灭物的探针，且当靶核酸序列与所述捕获探针杂交而导致所 述捕获探针酶解，从而从所述荧光团释放所述猝灭剂时可检测到信号。本发明的又一实施方式是同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕获探
4针被固定在可个别鉴定的珠上。此外，本发明的主题是实施本发明的方法的设备，其包含 区室，其内表面包被了多个靶核酸序列捕获探针，和 表面特异性检测系统，其检测结合到所述表面的那些标记物，但基本上不检测 溶液中的标记物。本发明的另一实施方式是实施本发明的方法的设备，其包含内表面包被了针对多 个靶核酸序列的捕获探针的区室，且其中所述捕获探针经标记，且当扩增子与所述捕获探 针杂交时可检测到信号。本发明的另一实施方式是实施本发明的方法的设备，其中所述捕获探针是具有荧 光标记物和淬灭剂的探针，且当靶核酸序列与所述捕获探针杂交而导致捕获探针酶解，从 而从所述荧光团释放所述淬灭剂时可检测到信号。本发明的又一实施方式是实施本发明的方法的设备，其包含具有可个别鉴定的珠 的区室，其中针对多个靶核酸序列的捕获探针被固定在所述可个别鉴定的珠上。附图简述

图1 (A)具有捕获探针(DNA寡核苷酸)的容器中填充含靶模板DNA、PCR引物(其 中1个经标记)和PCR标准混合物的混合物。(B)由于引物之一含荧光团，在PCR热循环过 程中产生的扩增子会被荧光标记。(C)捕获探针的序列与扩增子的经标记链互补。从而扩 增子可在热循环的退火期与捕获探针杂交。图2 能监控同一流体中的多个不同扩增子的扩增的捕获斑阵列的示意图。所述 阵列上的空间填充均勻的PCR混合物。该阵列的使用允许了高的PCR复行等级。图3:测量与捕获探针杂交的荧光分子的量的共聚焦读取仪的示意图。尽管捕获 表面上的流体载有荧光团，但只有接近捕获表面的荧光团可被检测到。图4 具有非均勻冷却速度的PCR热循环的示意图。可见2步循环(Td =变性温 度；Tm =退火温度)(也有可能是具有额外保持在延伸温度的3步循环)。可以更低速度进 行从Td到Tm的冷却阶段的最后部分(用蓝色圆圈指示)。这使得当使用退火温度高于引 物的退火温度的捕获探针时，扩增出的链可在引物退火前与捕获探针杂交，延伸得以进行。图5 珠阵列的示意图。除引物、模板DNA、酶和dNTPs (未显示)外，反应混合物中 还包含包被了捕获探针的珠。在本图中显示了3种不同的捕获珠。捕获珠1包被有捕获探 针1并含可个别鉴定的码1 (优先为色码，但其它码，如尺码，无线电码或者条形码也可以)。 捕获探针1可捕获扩增子1，因为其具有与此扩增子之部分互补的序列。同样，捕获珠η则 包含可个别鉴定的码η，并包被了与扩增子η之部分互补的捕获探针η。使全部捕获珠自由 散布在反应流体中，以提高扩增子捕获速度。随后将珠带到表面(如在(顺)磁性珠时是 通过磁驱动，而在非磁性珠时是通过双向电泳驱动)，在所述表面各珠可被鉴定，并且可定 量被捕获的扩增子量。实施方式本发明主题是扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个区 室内扩增和检测的同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大于7，更优选大于10。扩增可使用各种酶法实现，包括PCR (聚合酶链式反应)，NASBA (基于核酸序列的 扩增)，TMA(转录介导的扩增)，以及滚环扩增。适用于本发明的酶扩增法为所属领域的专业技术人员所熟知。本发明主题是扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中固定于表面的与所述多个核酸序列互补的寡核苷酸探针起到针对所述多个 经扩增核酸序列的捕获探针的作用；且其中被捕获到捕获位点的所述多个经扩增核酸序列的检测使用检测接近所述表 面的信号的表面特异性检测法进行。根据本发明，表面特异性检测由表面特异性检测系统和/或待检测信号的表面特 异性产生来得到。本发明的扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法可包括以下步骤 提供具有反应区室的设备，其中所述反应区室包含用所述多个核酸序列的多个 捕获探针包被的表面； 将多个靶核酸和含扩增所述多个靶核酸的扩增引物的扩增混合物加入所述区 室内； 开始扩增热循环，期间所述靶核酸的特定区段被扩增而产生扩增子，其中在扩增反应的退火期，部分扩增子与所述捕获探针杂交，且其中与所述捕获探针杂交的扩增子被特异性且定量检测到，其中被检测到的相应 信号指示初始相应靶核酸浓度，及由此定量检测所述多个靶核酸序列。下列定义应用于本发明的本实施方式及其它实施方式表面特异性检测是指由未被捕获的(例如漂浮在带捕获探针的表面上方流体中 的)扩增子贡献的检测信号基本上被抑制，意即优选被抑制至少50倍，更优选被抑制至少 100倍，再更优选被抑制至少1000倍，但由被捕获的扩增子贡献的检测信号(基本上)未被 抑制。作为例子，考虑了高度500 μ m，且含Iymol浓度的经标记引物的流体细胞(1)不用表面特异性检测，经标记的引物产生相当于 300000个标记物/ μ m2的 检测信号。以10000个捕获探针/ μ m2的捕获探针密度，最好的情况下会产生1/30的信号 背景比。对于一般的杂交实验而言，不是所有的捕获探针都与经标记的扩增子结合，信号背 景比甚至会更小；例如，对于1000个捕获的扩增子/y m2而言为1/300。(2)用表面特异性检测，溶液中经标记的引物可产生基本上更低的检测信号；如， 背景抑制倍数为1000的相当于 300个经标记的引物/μ m2的检测信号。用表面特异性 检测，对于1000个捕获的经标记扩增子/y m2而言，信号背景比基本上升高到约3。描述表面特异性检测的另一方法是描述检测结合到所述表面的那些标记物而基 本上不检测溶液中的标记物的表面特异性检测器。这意味着给予表面特异性检测的上述定 义同样应用于术语“检测结合到所述表面的那些标记物而不检测溶液中的标记物的表面特 异性检测器”。捕获探针分子可以是DNA、RNA、PNA (肽核酸)、LNA (锁核酸)、ANA (阿糖核酸)或 HNA(己糖醇核酸)寡核苷酸。RNA、PNA、LNA和HNA能与DNA形成异源双链体，其比DNA:DNA 同源双链体更稳定。这确保提高对序列错配(更特异性杂交)的识别能力。异源双链体 的更高稳定性还允许在给定的降低非特异性结合机会的温度使用更短的寡核苷酸探针。 PNAiDNA双链体在不依赖于杂交缓冲液的离子强度的情况下形成。这可增强在低盐PCR缓
6冲液中的杂交效率。根据本发明可优选使用比PCR引物解链温度更高的捕获探针，及降低温度下坡速 率(如图4所示)。这意味着在高于引物的退火温度的温度下，捕获探针将与扩增子退火。 从而，在引物延伸前使变性的扩增子与捕获探针杂交，及随后发生延伸。部分扩增子的杂交意味着可从由扩增子与捕获探针杂交而测量到的信号强度直 接计算出扩增子的浓度。如果测量到的信号和扩增子浓度之间的关系不是线性的，可应用 校正算法或标准曲线来推算扩增子浓度。该捕获探针的捕获部分可含10 200个，优选15 50个，更优选20 35个特异 于扩增反应过程中产生的扩增子的核苷酸。所述捕获探针也可包含附加核苷酸序列，所述 附加核苷酸序列可为在捕获部分和表面之间的间隔子，或者可具有可在0 200个核苷酸， 优选0 50个核苷酸变动的稳定功能。这些非捕获核苷酸序列可包含普通核苷酸或碱 基核苷酸。所述捕获分子可以其5’端或其3’端固定。对于复行(multiplexing)，将捕获分子固定于至少4个捕获分子/ μ m2，优选至少 1000个捕获分子/ μ m2，更优选至少10000个捕获分子/ μ m2更优，再更优选100000个捕获 分子/ μ m2的微阵列形式的固体支持物的特异定位区。在特殊实施方式中，捕获分子包含与扩增子的特异序列互补的10 100个核苷酸 的捕获部分(以便所述捕获部分定义扩增子的两个非互补的末端)和至少20个核苷酸的 间隔部分，其中扩增子的两个非互补的末端包含分别间隔子末端和非间隔子末端，以便间 隔子末端与捕获分子的间隔部分非互补，且所述间隔子末端超出所述非间隔子末端至少50 个碱基。术语“核酸、寡核苷酸、阵列、核苷酸序列、靶核酸、基本上结合、特异性杂交、背景、 定量”描述于国际专利申请WO 97/27317，其通过引用并入本文。术语多核苷酸指通常由 DNA或RNA序列组成的核苷酸或核苷酸样序列。术语“三磷酸核苷酸、核苷酸、引物序列”进一步描述于文件W000/72018和WO 01/31055，其通过引用并入本文。说到核苷酸、多核苷酸等包括糖磷酸骨架经修饰和/或取代的类似物，前提是其 杂交性质未被破坏。例如，骨架可被等效的合成肽取代，称之为肽核酸(PNA)。根据优选实施方式，该捕获探针被固定在图案化阵列的杂交表面。根据优选实施 方式，捕获探针被固定于微阵列表面。“微阵列”是指以能够结合给定的特异性靶分子形式固定有多个探针分子的支持 物。该微阵列优选由存在于表面上或支持物内或者覆盖支持物的基质上的特异性定位区的 捕获分子组成。特异性定位区是含结合的特异于规定靶分子的捕获分子的表面区。该特异 性定位区通过建立微阵列的方法知晓，或者在检测期间或检测后定义。斑是特异性靶分子 被固定于它们的捕获分子且可被检测器所显示的区域。本发明的一个特殊应用中，只要不 同的支持物含特异性捕获分子，且可彼此区分，以能够定量特异性靶分子，则捕获分子的微 阵列也被提供于不同或分开的支持物上。这可通过使用具有特定性质，且可彼此区分，以能 够定量结合的分子的珠混合物来实现。从而一个珠或珠群被人为是具有特异于一种靶分子 的捕获分子的斑。
微阵列优选通过将捕获分子沉积在基质上来得到，这通过物理装置(如针或“针 和环”)碰触表面来进行，或者通过方法(压力分注器或纳级分注器(nanodispenser))释 放溶液微滴来进行。另外，在本发明的实施方式的基质上捕获分子的原位合成伴随预定位置中寡核苷 酸或多核苷酸合成的光空间分辨率，如见于US5，744，305和US6，346，413。可优选通过不对称PCR(或LATE PCR 指数后线性)方法富集PCR混合物中的单 链扩增子。在不对称PCR中，使用不等浓度的正向和反向PCR引物。当经标记的引物浓度 高于未标记的引物时，经标记的链将被扩增而未标记链则以更低速度扩增。这不仅可导致 经标记链的积聚，还直接促使经标记链与捕获探针的杂交。术语“实时PCR”是指在PCR循环期间允许检测和/或定量扩增子的存在的方法。 在实时PCR中，在至少一个扩增循环中检测和/或定量扩增子的存在。可将PCR循环期间 扩增子的增加或关系到扩增子形成量的信号用于检测和/或定量PCR溶液中的给定的核苷 酸序列。在优选实施方式中，在每个循环中检测和/或定量扩增子的存在。本发明中的术语“扩增子”与靶核苷酸序列的复制有关，是酶法核酸扩增的产物。除经标记的PCR弓I物外，也可使用用标记的dNTPs的内标标记。标记相关的检测方法有多种。不同标记分子的综述见于W097/27317。它们可在 复制或扩增期间使用已标记的引物或者经标记的核苷酸的酶法掺入来获得(W0 97/27329) [嵌入剂在本发明中不优选]。可能的标记物是荧光染料，其可用荧光检测器以高灵敏度检测到。荧光染料包括 但不限于花青染料(Cy3、Cy5和Cy7)适宜于使用商用的阵列扫描仪(如可从General Scanning、Genetic Microsystem得到)分析阵列。FAM(羧基荧光素)也是可能的标记物 替代物。本领域技术人员知晓可在本发明中使用的适宜标记物。在本发明的优选实施方式中，相比溶液中的荧光，检测有关捕获分子上扩增子存 在的阵列荧光信号的信号增大。在特定实施方式中，存在于阵列上的荧光团检测的差异基于与作为DNA双螺旋与 捕获分子杂交的结合分子有关的荧光相比与溶液中自由运动的分子相关的荧光的各向异 性的差异。各向异性取决于与待检测荧光团相关的荧光团的运动性和荧光寿命。测定阵 列上各向异性的方法可由 Blueshift Biotechnologies Inc, 238 East Caribbean Drive, Sunnyvale, CA 94089 (http: //www. blueshiftbiotech. com/dynamicf 1. html)提供。在特定实施方式中，优选以时间分辨方式实现荧光团分子的检测。荧光分子具有 与发射过程相关的荧光寿命。小荧光团(如荧光素和若丹明)的寿命一般是2 10纳秒 范围。时间分辨荧光(TRF)分析法使用长寿命(> 1000ns)荧光团，以从短寿命干扰(如 矩阵自发荧光或荧光样品，其寿命几乎总是远少于10ns)区分分析信号。寿命优选由附近 存在的另一荧光团或与之发生共振能量转移的猝灭剂调控。TRF用仪器简单延迟发射测量， 直到短寿命荧光消失，长寿命报告子荧光仍然持续。荧光寿命可用两种基本方法测定。时 域技术使用非常短的激发脉冲(皮秒)然后实时监控纳秒寿命期间的发射。用衰变曲线拟 合指数得寿命。频域技术调制兆赫频率的激发，随即观察应答的发射强度波动。相位延迟 和振幅调制随后可用于测定寿命。BlueshifiBiotechnologies Inc可提供快速、经济的寿 命成像频率技术。如上所述，这些定义应用于所叙述的所有实施方式。
在本发明的一个实施方式中，本发明主题是扩增期间同时定量检测多个靶核酸序 列的方法，其中所述引物经标记，且杂交的经标记扩增子由表面特异性检测系统检测，该系 统检测与表面结合的那些标记物。表面特异性意即如上所述，溶液中的标记物基本上不被 检测到。在优选实施方式中，待检测标记物的信号不随所述多个核酸序列的结合状态而变 化。再优选实施方式中，待检测的信号是荧光信号。它优选为“永久标记物”，其 优选为小分子有机荧光团，但也可为粒子标记物(荧光或非荧光的)(例如纳米发光体 (nano-phosphores)，量子点)。对于多个核酸的检测，可使用多个标记物，在优选实施方式中，使用相同的标记物 检测各所述多个靶核酸序列。本发明还描述了使用组合高表面特异性读取设备的集成核酸微阵列同时定量分 析一个区室中的多个核酸序列的方法，后者将在下文详述。本发明还涉及设备，其中，是室表面的一部分的表面或者构建在反应室内的表面 (如珠表面)包被了捕获探针，且PCR反应在同一个室中进行。图1描绘了用管内微阵列监控PCR反应的原理。将含模板DNA和引物的PCR混合 物填充于(部分)内表面包被DNA捕获探针的区室中(图1A)。当PCR热循环开始时，模板 DNA的特异性区段将被扩增。因为PCR引物中的一条(或两条)是被荧光团标记的，产生的 PCR产物(扩增子)将被荧光标记(图1B)。如上所述，可使用经标记的dNTPs替代经标记 的引物。因为区室的(部分)内表面包被了序列与扩增子的一部分互补的DNA捕获探针， 因此扩增子可与捕获探针杂交。与捕获探针的杂交只发生于PCR循环的退火期。在PCR循 环的变性期，杂交的扩增子将从捕获探针解离。在各循环期只有一部分扩增子会杂交。大 部分扩增子将在扩散到捕获位点之前被延伸。另外，因为优选使用非_置换DNA聚合酶，杂 交的扩增子将不在该循环中被扩增。杂交的扩增子可被具有高表面特异性的光学设备检测到。因为整个PCR体积装载 有经荧光标记的引物(或经荧光标记的dNTPs)，所以使用仅检测接近杂交表面的荧光的表 面特异性光学测量方法是重要的(图1C)。检测器的表面特异性应非常高，以达到好的信号 背景比(且从而好的信噪比)。在各PCR循环的退火期，应进行荧光测量，以测量与捕获表面杂交的经荧光标记 的扩增子量。杂交的(从而可检测的)扩增子量代表PCR混合物中扩增子的浓度。信号-循 环坐标图将呈S-曲线。类似于标准实时PCR，信号达到某一强度阈值时的循环数即指示初 始的靶模板浓度。此方法从而可用于定量检测样品中的核酸靶。表面特异性检测系统优选选自共聚焦测量设备，等离子体测量设备和瞬息检测 测量设备。如上所述，为了区分杂交的扩增子与引物或溶液中的扩增子，重要的是进行表面 特异性测量。表面特异性测量只检测非常接近捕获表面的标记物。因为杂交仅可在捕获探 针已沉积且PCR反应混合物均一处发生，因而有可能减去背景(点和点之间的荧光强度) 及测定杂交的扩增子量。可能的标记物是可通过光学方法检测折射率或光吸收的差的荧光标记物或非荧光的(如粒子)。本领域技术人员明晰适宜的荧光或非荧光标记物。对于抑制背景至少50倍的高表面特异性测量，以下可区分三个不同方法1.共聚焦一般沿1 2μπι的光轴的测量高度。2.等离子体约激发光波长或更小的测量高度。3.瞬息100nm或更小的测量高度。1.共聚共聚焦测量可用各种类型的成像设备来进行。图3示标准的基于针孔的系 统。这种系统可制作得非常紧凑(PCT/IB2007/052499, PCT/IB2007/052634,和PCT/ IB2007/052800)。沿系统光轴的不同位置引起标记物被最接近阵列表面的物镜成像的不同 位置。使用针孔和适当位置调整(在阵列表面有标准物的清晰影响的位置)，可在传感器表 面附近选择小测量体积(深度沿仅1 2 μ m的光轴)。2.等离子体基质包被金属(如Au，Ag)。捕获探针在金属层上，或间隔层沉积在金属顶部并随 后被捕获探针覆盖。杂交的DNA的标记物荧光可与金属介质/流体界面处的表面等离子体 偶联。流体中的标记物不能或以基本上更小的效率与表面等离子体偶联。通过表面等离子 体的偶联(其将表面等离子体模式转变为传导波)和测量偶联力，可基本上只检测杂交的 DNA的标记物荧光。结果，荧光测量具有高表面特异性。3.瞬息作为另一替代性的增强表面特异性的方法，可使用瞬息激发法，瞬息波在基质表 面激发，并激发荧光团。作为第一种方法，可使用基质_流体界面处的全内反射(TIR)，其产生阵列表面的 一般在100 200nm以内的测量(激发)体积。但TIR要求使用连接到基质的玻璃棱镜， 或使用楔形基质，以便具有大于基质-流体界面的临界角的角的激发光与基质偶联。另外(如PCT/IB2006/051942，PCT/IB2006/054940 中所述)，可用非透明介质(如 金属)覆盖基质，并以平面中的至少一维与低于流体中光衍射限的基质-流体界面平行的 方式用[阵列]孔图饰所述金属。例如，可用具有一个上述平面中的维和低于流体中光衍 射限的其他维的线栅图饰基质。这导致激发体积在阵列表面的50nm以内(20 30nm的测 量体积已经被实验证明)。此方法超过第一种方法瞬息激发的优势是更简单(不需要棱 镜或楔形表面，且对入射角和激发点的形状没有特殊要求，另可使用简单的荧光成像用CCD 照相机)且能够允许基本上更小的激发体积。本发明主题还是实施本发明的方法的设备，其包含 区室，其内表面包被了针对多个靶核酸序列的捕获探针，和 表面特异性检测系统，其检测结合到所述表面的那些标记物，但基本上不检测 溶液中的标记物。可将多个不同捕获探针包被在图案化阵列的杂交表面上，以同时监控同一流体区 室中的多个不同扩增子的扩增。图2示具有16个不同捕获斑的阵列例的示意图。所有捕 获斑监控同一 PCR混合物中的不同扩增子的扩增。这允许了远高于目前可能的复行等级。 这允许了大于6且至100或更多的复行等级。本发明的实施方式的其他优势是只需要一种 荧光团(一类)，这使得多个昂贵的滤色器和/或分开的光电检器非必需。
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因此，本发明的设备可以是微阵列。本发明的另一实施方式中，PCR区室中固体表面上的捕获探针是具有荧光标记物 和猝灭剂的折叠探针(如分子信标)或其它探针(如Taqman探针)，所述荧光标记物和淬 灭剂由于所述探针的结构而彼此比邻。在本实施方式中，PCR反应在反应中的无任何标记 物或标记物与扩增引物连接的情况下进行。在PCR反应期间形成的特异性扩增子可与固体 表面上的经标记的捕获探针杂交，从而分开淬灭剂和标记物(在分子信标型折叠探针的情 况下)或使聚合酶水解探针(在TaqMan类捕获探针的情况下)。一般而言，用于本发明的分子信标是形成茎-环结构的单链寡核苷酸杂交探针。 这些分子可被固定于PCR区室的固体表面，且可用作捕获探针。举例来说，待用于本发明的 分子信标环可含与靶序列互补的探针序列，且茎由位于探针序列两侧的互补臂序列的退火 形成。荧光团可共价链接在一个臂的末端，而淬灭剂可被共价链接在另一个臂的末端。分 子信标在溶液中游离时可优选不发荧光。当与含靶序列的核酸链杂交后，其经历能使其发 荧光的构象变化。在无靶的情况下，探针通常是暗的，因为茎使荧光团太接近淬灭剂分子， 从而它们瞬时共享电子，消除了荧光团发荧光的能力。当探针遇到靶分子时，其可形成比茎 杂交物更长且更稳定的探针_靶标杂交物。探针_靶标杂交物的刚性和长度可阻碍茎杂交 物的同时存在。因此，分子信标可经历推动茎杂交物解离，且荧光团与淬灭剂彼此分开，恢 复荧光的自发的构象重组。分子信标优选由四种成分构成环，茎，5’荧光团，和3’淬灭剂。通常，环由靶序 列的互补序列构成。可优选使用介于约15和35核苷酸之间的长度，更优选可使用约18 25的长度，最优选可使用约21个核苷酸的长度。茎可通过将3 7个核苷酸添加到环结 构的5’末端来形成，与其3’末端反向互补。典型茎序列可为6核苷酸长，由5个C/G对和 一个A/T对构成。茎的解链温度优选设为高于PCR退火温度约7°C 10°C，确保未杂交的 探针保持环结构(并且不发荧光)。再一优选实施方式中，分子信标/靶复合物的解链温 度也可为高于PCR退火温度7。C 10°C。当茎的解链温度设为高于PCR退火温度约7。C 10°C,且分子信标/靶复合物的解链温度也设为高于PCR退火温度7°C 10°C时，完全互补 的靶序列的存在通常引起分子信标的结合，胜过环结构并允许荧光发生。待用于本发明的分子信标可非常特异。它们优选可区分差别不多于3个核苷酸置 换的靶序列，更优选可区分差别2个核苷酸置换的靶序列，最优选可区分差别一个核苷酸 置换的靶序列。例如，通过增加环序列长度(如至22 35个核苷酸长度)，探针/靶标相 互作用的严格性可被降低，容许测定中错配的发生。分子信标的解链温度可使用本领域技术人员已知的适宜方法(如Michael Zuker 设计的计算机程序)测定。分子信标可包含不同颜色的荧光团。作为分子信标的荧光团，可使用本领域技术 人员已知的任何适合的荧光团。可优选使用荧光素(FAM)、若丹明(ROX)、四氯-6-羧基荧 光素(TET)，或四甲基若丹明(TAMRA)。作为分子信标的淬灭剂，可使用本领域技术人员已 知的任何适合的淬灭剂。例如可使用dabcyl，由于其是中性的和疏水性的，这两个特征使之 适宜与许多荧光团配对。优选使用允许FRET(如猝灭)的染料和淬灭剂。本文上述术语“TaqMan”或“TaqMan类”涉及Taq聚合酶(“Taq” )或本领域技术 人员已知的类似DNA聚合酶在DNA合成过程中担当5，一 3，核酸外切酶(就如“PacMan”)(即在DNA合成过程中沿5，一3，方向水解DNA)的能力。从而随着DNA合成开始，Taq聚 合酶或类似的DNA聚合酶的5’ 一 3’核酸外切酶活性可例如降解或水解已经退火到模板的 部分探针。可如使用双重标记的荧光探针或序列段(TaqMan探针)(如作为一部分捕获探 针)在定量或实时PCR方法过程中使用该能力。TaqMan PCR—般经荧光团测量PCR指数 期(而非如常规PCR中的在端点)的产物积累。产物的指数增长可用于测定阈值循环，CT， 即检测到荧光的显著指数增加的PCR循环数，且其直接与反应中存在的DNA模板的拷贝数 相关。捕获探针一般可含与靶DNA模板或扩增子内的区段互补的区段，优选大小约为20 60个核苷酸。该捕获探针可优选短于结合的DNA模板或扩增子，从而允许引物在DNA模板 或扩增子的3’端结合。荧光染料或荧光团可共价连接在与靶DNA模板互补的捕获探针区 段的5’端。淬灭剂分子可因此被定位于朝向捕获探针的3’端距荧光团或荧光染料介于约 20 60个核苷酸之间的位置。另外，淬灭剂分子可定位在捕获探针区段的5’端，且荧光团 可定位于朝向捕获探针的3’端距离淬灭剂分子介于约20 60个核苷酸的位置。连接到 探针的荧光团和淬灭剂的紧密接近可抑制荧光团发出荧光。由Taq聚合酶或类似的DNA聚 合酶降解或水解捕获探针可从捕获探针释放荧光团，且破坏与淬灭剂的紧密接近，或反之 亦然，从而解除淬灭作用，并允许荧光团发出荧光。因此，用该方法检测的荧光一般与释放 的荧光团和PCR中存在的DNA模板量成正比。TaqMan捕获探针可包含不同颜色的荧光团。 可将本领域技术人员已知的任何适宜的荧光团用作TaqMan捕获探针的荧光团。可优选使 用荧光素(FAM)，若丹明x(ROX)，四氯-6-羧基荧光素(ΤΕΤ)。可将本领域技术人员已知的 任何适宜的淬灭剂用作分子信标的猝灭剂。例如，可使用TAMRA。优选使用允许FRET (如猝 灭)的染料和淬灭剂。本文中的术语“FRET”指荧光共振能量转移，即激发态能量从初始的激发供体(D) 向受体(A)的转移。供体分子一般发射与受体的光吸收相重叠的更短波长。该过程是两个 分子的电子激发态之间的无光子发射的距离_依赖性相互作用。FRET是供体和受体之间的 远程偶极-偶极交互作用的结果。激发的供体分子有多个途径释放其捕获的能量恢复到基 态。激发态能量可分散到环境中(如光或热)或直接转移到第二个受体分子，使该受体分 子经由FRET过程到达激发态。作为分子信标或TaqMan/类TaqMan法的结果，可在捕获探针所处的斑处测量到荧
光信号。在本实施方式中，使用高表面特异性读取仪不是必需的，因为信号只在扩增子与 捕获探针杂交后产生。所有前面的其它阐述也可以应用于本发明的这一实施方式。这样，本发明的主题是本发明的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述 捕获探针是具有荧光标记物和淬灭剂的探针，所述荧光标记物和淬灭剂由于所述探针结构 而彼此比邻，且当扩增子与所述捕获探针杂交时可检测到信号。本发明的再一主题是实施本发明的方法的设备，其包含内表面包被了针对多个靶 核酸序列的捕获探针的区室，且其中所述捕获探针经标记，且当扩增子与所述捕获探针杂 交时可检测到信号。根据本设备的实施方式，所述标记物优选选自如前面阐述的分子信标、嵌入染料、 TaqMan 探针。本发明的另一实施方式是同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕获探针被固定在可个别鉴定的珠上。在优选实施方式中，不同珠具有不同的捕获探针。特别优 选使用经光学标记的(如经荧光标记的)引物，以产生能够与固定于珠上的捕获探针杂交 的经光学标记的扩增子。还优选使用如上所述的分子信标或TaqMan捕获探针，以用固定在 珠上的捕获探针同时定量检测多个靶核酸序列。例如，珠可含有包含荧光团和淬灭剂的捕 获探针，或者分子信标。本发明的特别优选的实施方式涉及同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所 述捕获探针被固定在珠(如可个别鉴定的珠)上，并且其中所述核酸用经光学标记的引物 (优选用荧光引物或含荧光团的引物)扩增。可优选将所述珠带到区室表面，并通过表面特异性检测测量捕获的扩增子。可例 如通过磁驱动将珠带到表面。优选实施方式中检测标记物的荧光。如前略述，本领域技术人员知道更多荧光标 记物和非荧光标记物。当捕获探针被固定于珠上，即允许进行准均质测定，因为珠自由地散布于反应溶 液中。准均质测定比非均质测定允许更快的动力学。珠可有介于50nm 3μπι之间的直 径，且可个别鉴定(如通过色码、条码或尺寸)。多个含不同捕获探针的珠可存在于同一反 应溶液中(图5)。与其上有捕获到的扩增子的珠可通过磁驱动(当使用(顺)磁性珠时) 或通过双向电泳(当使用非磁性珠时)带到表面。在表面上，珠可被鉴定，且被捕获的扩增 子可被表面特异性光学测量方法检测到。区分不同珠的另一方法基于尺寸差异所致的沿珠周长传播的共振器模式的共振 波长差异。此情况中，珠充当支持沿珠周长传播的共振器模式(对于球形珠，这些共振器模 式是所谓的回音廊模式)的共振器。该共振器以沿周长一个往返后的相位偏移是2 * pi的 倍数的波长共振。这些共振器模式也有延伸到珠的环境中(流体)的瞬息场。在珠的场区 (通常< IOOnm)附近的荧光团可将一部分其荧光偶联到所述珠支持的共振器模式。偶联到 共振器模式的部分的共振波长比其它波长强，且这导致用对应于共振器模式或回音廊模式 的共振峰调至荧光光谱。珠的通常直径是大于Iym直到50μπι。可对全部体积进行检测， 因为未与珠结合的荧光团发出的荧光具有荧光团的内在光谱，故不需要表面特异性光学测 量。因而，本发明的主题是实施本发明的方法的设备，其包含具有可个别鉴定的珠的 区室，其中针对多个靶核酸序列的捕获探针被固定在所述可个别鉴定的珠上。在优选实施方式中，所述设备还包含 将所述珠带到所述区室表面的装置、和 表面特异性检测器，其检测结合到所述表面的那些标记物，但基本上不检测溶 液中的标记物。本发明的其他实施方式项目1 扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个区室内扩增和检测的所述同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大 于7，更优选大于10。项目2 扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中固定于表面的与所述多个核酸序列互补的寡核苷酸探针起到针对所述多个经扩增核酸序列的捕获探针的作用；且其中被捕获到捕获位点的所述多个经扩增核酸序列的检测使用检测接近所述表 面的信号的表面特异性检测法进行。项目3 项目2的扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中表面特 异性检测通过表面特异性检测系统和/或待检测信号的表面特异性产生来得到。项目4 项目1或3的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，包括下列步 骤 提供具有反应区室的设备，其中所述反应区室包含用所述多个核酸序列的多个 捕获探针包被的表面； 将多个靶核酸和含扩增所述多个靶核酸的扩增引物的扩增混合物加入所述区 室内； 开始扩增热循环，期间所述靶核酸的特定区段被扩增而产生扩增子，其中在扩增反应的退火期，可再现部分的所述扩增子与所述捕获探针杂交，且其中与所述捕获探针杂交的扩增子被特异性且定量检测到，其中被检测到的相应 信号指示初始相应靶核酸浓度，及由此定量检测所述多个靶核酸序列。项目5 项目1 4的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中引物经 标记，且用表面特异性检测系统检测杂交的经标记的扩增子。项目6 项目5的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中待检测的标 记物信号不依赖于所述多核苷酸序列的结合状态而变化。项目7 项目2 6的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕 获探针被固定在图案化阵列中的杂交表面。项目8 项目1 7的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中相同标记物用于 各所述多个靶核酸序列的检测。项目9 项目1 4的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕获探针是 具有荧光标记物和淬灭剂的探针，所述荧光标记物和淬灭剂由于所述探针结构而比邻，且 当扩增子与所述捕获探针杂交时可检测到信号。项目10:项目1 4的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕获探针 是具有荧光标记物和淬灭剂的探针，且当靶核酸序列与所述捕获探针杂交而导致所述捕获 探针酶解，从而从所述荧光团释放所述淬灭剂时可检测到信号。项目11:项目1 4的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述捕获探针 被固定在可个别鉴定的珠上。项目12 项目11的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中不同珠具有不同的 捕获探针。项目13 项目11或12的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述珠被带 到所述区室表面，且被捕获的扩增子通过表面特异性检测来测量。项目14 实施项目1 9的方法的设备，其包含 区室，其内表面包被了针对多个靶核酸序列的捕获探针，和 表面特异性检测系统，其检测结合到所述表面的那些标记物，但基本上不检测 溶液中的标记物。
项目15 实施项目1 4、9和10的方法的设备，其包含内表面包被了针对多个靶 核酸序列的捕获探针的区室，且其中所述捕获探针经标记，且当扩增子与所述捕获探针杂 交时可检测到信号。项目16 项目15的设备，其中所述捕获探针是具有荧光标记物和淬灭剂的探针， 且当靶核酸序列与所述捕获探针杂交而导致捕获探针酶解，从而从所述荧光团释放所述淬 灭剂时可检测到信号。项目17:实施项目1 4和11 14的方法的设备，其包含具有可个别鉴定的珠 的区室，其中针对多个靶核酸序列的捕获探针被固定在所述可个别鉴定的珠上。项目18 项目17的设备，其中所述设备还包含 将所述珠带到所述区室表面的装置、和 表面特异性检测器，其检测那些结合到所述表面的标记物，但基本上不检测溶 液中的标记物。项目19 项目14 18的设备用于同时定量分析多个靶核酸序列的用途。项目20 检测接近表面的信号的表面特异性检测方法用于实时PCR的用途。项目21 项目20的表面特异性检测方法用于实时PCR的用途，其中表面特异性的 检测通过表面特异性检测系统和/或待检测信号的表面特异性产生来得到。
权利要求
扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个区室内扩增和检测的所述同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大于7，更优选大于10；且其中所述捕获探针是具有荧光标记物和猝灭剂的探针，所述荧光标记物和猝灭剂由于所述探针的结构而比邻，且当扩增子与所述捕获探针杂交时可检测到信号。
2.扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个区室内扩增和检测的所述同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大于7， 更优选大于10 ；且其中所述捕获探针是具有荧光标记物和猝灭剂的探针，且当靶核酸序列与所述捕获探 针杂交而导致所述捕获探针酶解，从而从所述荧光团释放所述猝灭剂时可检测到信号。
3.扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中在单个区室内扩增和检测的所述同时且定量检测的靶核酸数大于6，优选大于7， 更优选大于10 ；且其中所述捕获探针被固定在可个别鉴定的珠上。
4.权利要求3的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中不同珠具有不同的捕获探针。
5.权利要求3或4的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述核酸用经光学标 记的引物扩增，优选用荧光引物或含荧光团的引物扩增。
6.权利要求1 5中任一项的扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法， 其中固定于表面的与所述多个核酸序列互补的寡核苷酸探针起到所述多个经扩增核酸序列的捕获探针的作用；且其中被捕获到捕获位点的所述多个经扩增核酸序列的检测用检测接近所述表面的信 号的表面特异性检测法进行。
7.权利要求6的扩增期间同时实时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中表面特异性 检测通过表面特异性检测系统和/或待检测信号的表面特异性产生来得到。
8.权利要求4 7中任一项的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述珠被带 到所述区室表面，且被捕获的扩增子通过表面特异性检测来测量。
9.权利要求1或8中任一项的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，包括下 列步骤 提供具有反应区室的设备，其中所述反应区室包含用所述多个核酸序列的多个捕获 探针包被的表面； 将多个靶核酸和含扩增所述多个靶核酸的扩增引物的扩增混合物加入所述区室内；眷开始扩增热循环，期间所述靶核酸的特定区段被扩增而产生扩增子， 其中在扩增反应的退火期，可再现部分的所述扩增子与所述捕获探针杂交，且 其中与所述捕获探针杂交的扩增子被特异性且定量检测到，其中被检测到的相应信号 指示初始相应靶核酸浓度，及由此定量检测所述多个靶核酸序列。
10.权利要求1 9中任一项的扩增期间同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所 述捕获探针被排列在图案化阵列中的杂交表面上。
11.权利要求1 10中任一项的同时定量检测多个靶核酸序列的方法，其中所述相同 标记物用于检测各所述多个靶核酸序列。
12.实施权利要求1、2或6 11中任一项的方法的设备，其包含内表面包被了针对所 述多个靶核酸序列的捕获探针的区室，且其中所述捕获探针经标记，且当扩增子与所述捕 获探针杂交时可检测到信号。
13.权利要求12的设备，其中所述捕获探针是具有荧光标记物和猝灭剂的探针，且当 靶核酸序列与所述捕获探针杂交而导致所述捕获探针酶解，从而从所述荧光团释放所述猝 灭剂时可检测到信号。
14.实施权利要求3 11中任一项的方法的设备，其包含具有可个别鉴定的珠的区室， 其中针对多个靶核酸序列的捕获探针被固定在所述可个别鉴定的珠上。
15.权利要求14的设备，其中所述设备还包含 将所述珠带到所述区室表面的装置、和眷表面特异性检测器，其检测结合到所述表面的标记物，但基本上不检测溶液中的标 记物。
16.权利要求12 15中任一项的设备用于同时定量分析多个靶核酸序列的用途。
全文摘要
本发明涉及实时PCR的程序和操作本发明方法的设备。本发明尤其适用于对样品中存在的核酸进行同时辨别和定量，如生物样品。另外，本发明详述了使用完整的核酸微阵列结合高表面特异性解读装置在一个区室中同时定量分析多个核酸序列的方法。本发明涉及的设备表面是一部分区室的表面或建造于反应室中，如珠表面，其表面包被着捕获探针，且PCR反应在同一个区室中进行。
文档编号C12Q1/68GK101903536SQ200880121625
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月16日 优先权日2007年12月19日
发明者B·梵格曼, D·J·W·克伦德, E·M·H·P·梵迭克, E·R·沃森纳尔, H·R·斯达皮特, H·梵侯坦 申请人:比奥卡尔齐什股份有限公司