专利名称：核酸扩增方法以及在该方法中使用的试剂和试剂套件的制作方法
技术领域：
本发明涉及样品中核酸的扩增方法和在该方法中使用的试剂。更具体而言，本发 明涉及使用内标物的扩增方法。
背景技术：
作为能够检测样品中的微量核酸的方法，多种核酸扩增方法得到了开发。在此之 中能够在等温条件下高效率地进行扩增的方法(LAMP法等)，作为使用没有温度控制功能 的低成本装置就能够简易而迅速地进行检测的技术，在广范围的检测现场中得到应用。本发明人等报导了不使用内标物的LAMP法的检测系统，能够对于在IO3 IO9拷 贝/测试的浓度范围的核酸进行定量(非专利文献1)。但是因为该方法中不使用内标物， 所以得到的结果是靶核酸的相对量。一方面，在LAMP法中使用内标物的定量法得到了报导(非专利文献2)。这个方法 是使用与靶核酸具有类似序列的内标物，将靶核酸和内标物同时进行扩增的方法。该方法 能够进行定量的浓度范围窄，为IO4 IO8拷贝/测试，因此为了对广泛浓度范围的核酸进 行测定，需要将样品稀释进行多次测定。非专禾U 文献 1 :Y. Mori, et al. , Journal of Biochemical and BiophysicalMethods,59,145—157，2004非专利文献2 :H. Tani，et al. , Analytical Chemistry, 79 (15), 5608-5613, 2007
发明内容
在使用内标物的检测系统中，因内标物的扩增产物影响靶核酸的扩增反应而无法 精确地测定靶核酸，这是在扩增效率高的等温核酸扩增方法中存在的共性问题。本发明的 课题是提供解决了所述问题的、在能够确保对靶核酸的精确测定值的同时对内标物稳定进 行扩增的方法，以及在该方法中使用的试剂。本发明人等为了解决所述课题进行了深入探讨的结果，发现了不在相同时期进行 内标物和靶核酸的扩增反应，也就是说，提前或滞后于靶核酸扩增反应而进行内标物的扩 增反应，能够防止内标物的扩增产物对靶核酸扩增反应的影响，从而完成了本发明。也就是说，本发明提供了以下的(1) (9)。(1) 一种核酸扩增方法，其特征在于使内标物提前于靶核酸进行扩增。(2)所述(1)所记载的核酸扩增方法，其特征在于包括以下工序(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的 内标物，(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的 寡核苷酸引物(以下称为“内标引物”)和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物(以下称为“靶 核酸引物”)，所述内标引物能够在一定条件下，使所述内标物在早于靶核酸扩增的时期进 行扩增，
(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行 测定的工序。(3)所述(1)或(2)所记载的核酸扩增方法，其特征在于进行靶核酸的定量。(4)所述(1)所记载的核酸扩增方法，其特征在于包括以下工序(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的 内标物，(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的 寡核苷酸引物(以下称为“内标引物”)和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物(以下称为“靶 核酸引物”)，所述内标引物能够在一定条件下，使所述内标物在早于靶核酸扩增的时期进 行扩增，(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行 实时测定，根据其结果和内标物的添加量，计算样品中的初始靶核酸浓度或拷贝数的工序。(5)所述(1)至(4)中任意一项所记载的核酸扩增方法，其特征在于内标物至少在 弓I物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列。(6)所述(5)所记载的核酸扩增方法，其特征在于内标引物设计为在一定条件下 与内标物进行特异性杂交而不与靶核酸杂交；并且，靶核酸引物设计为在所述一定条件下 与靶核酸进行特异性杂交而不与内标物杂交。(7)所述(5)或(6)所记载的核酸扩增方法，其特征在于扩增反应使用LAMP法。(8) 一种测试试剂或试剂套件，其特征在于是用于实施根据(1)至(7)中任意一项 所述的核酸扩增方法的。(9)所述(8)所记载的测试试剂或试剂套件，其特征在于至少含有以下的试剂(a)至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列，并且浓度或拷贝数已 知的内标物，(b)在一定条件下能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增的内标引物，(c)靶核酸引物。根据本发明，通过提前于靶核酸的反应而进行内标物的扩增反应，能够在确保对 靶核酸的精确测定值的同时稳定地进行内标物的扩增。也就是说，在定性方法中，使得监测 从各样品中的提取纯化效率和样品中的成分对扩增反应的影响成为可能。此外，在定量方 法中，能够在7个数量级以上的广范围内对核酸的绝对量进行测定。
图1是使用IO1至IO7拷贝/测试的各浓度的靶核酸(NG质粒)和内标核酸(CT质 粒)进行LAMP反应，对伴随靶核酸扩增的淬灭(Quenching)探针的荧光消光使用Mx3000P 进行实时测定时的结果曲线图。图2是使用了 NG质粒的标准曲线图。图3是使用IO1至IO7拷贝/测试的各浓度的靶核酸(NG质粒)和内标核酸(CT 质粒)进行LAMP反应，对伴随内标核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P进行实时 测定时的结果曲线图。图4是使用IO1至IO8拷贝/测试的各浓度的靶核酸(HBV质粒)和内标核酸
5(Arita2质粒)进行LAMP反应，对伴随靶核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P进 行实时测定时的结果曲线图。图5是使用了 HBV质粒的标准曲线图。图6是使用IO1至IO8拷贝/测试的各浓度的靶核酸(HBV质粒)和内标核酸 (Arita2质粒)进行LAMP反应，对伴随内标核酸扩增的淬灭探针的荧光消光使用Mx3000P 进行实时测定时的结果曲线图。图7是显示当内标物的模板浓度为ΙΟ2、104、IO6拷贝/测试时，靶核酸(HBV质粒) 以及内标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。图8是显示在内标引物浓度为Xl和在低浓度引物(X0. 25、X0. 3、X0. 5)条件 下靶核酸(HBV质粒)和内标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。图9是显示试剂成分AXl和高浓度试剂成分AX 1.2时，靶核酸(HBV质粒)和内 标核酸(Arita2质粒)的扩增时间变化的曲线图。图10是显示使内标核酸(CT质粒；I. C.)和NG质粒的高浓度模板(NG_H)在同一 反应液中进行扩增的曲线图。图11是显示使内标核酸(CT质粒；I. C.)和NG质粒的低浓度模板(NG_L)在同一 反应液中进行扩增的曲线图。本说明书包括在本申请的优先权基础文件日本专利申请2007-271902号说明书 中所记载的内容。
具体实施例方式本发明的核酸扩增方法，其特征在于使内标物提前或滞后于靶核酸而进行扩增。 提前进行扩增，指的是比靶核酸模板的扩增开始更早地，使来源于内标物的扩增反应开始 进行。因此，需要设计出在早的时期(提前)进行扩增的内标引物。内标引物，是指用于扩 增内标物的寡核苷酸引物。一般来讲，用于设计在早的时期进行扩增的引物的、特殊的设计 条件还没有被确立。因此，在使用专用软件等采用通常方法设计的引物中选择在早的时期 进行扩增的引物，作为内标引物。滞后进行扩增，指的是比靶核酸模板的扩增开始更晚地，使来源于内标物的扩增 反应开始进行。因此，需要设计在晚的时期(滞后)进行扩增的内标引物。为此，在使用专 用软件等采用常规方法设计的引物中选择在晚的时期进行扩增的引物，作为内标引物。此外，在等温核酸扩增方法中，一般来讲存在随着靶核酸浓度的升高扩增时期变 早的倾向。因此，为了使内标物在早的时期进行扩增，需要使内标物为高浓度。另一方面， 为了使内标物在晚的时期进行扩增，需要使内标物为低浓度。也就是说，在本发明中为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，和与靶核酸同 时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，将内标物浓度设定得高，优选设定为10倍以上， 进一步优选设定为100倍以上。另一方面，为了使内标物在晚的时期(滞后)进行扩增，和 与靶核酸同时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，将内标物浓度设定得低，优选设定为 0. 1倍以下，进一步优选设定为0. 01倍以下。在本发明中使用的内标物，只要是至少在引物设计区域内与靶核酸具有不同碱基 序列的核酸即可，没有特殊限制。作为这样的核酸，可以列举天然来源的核酸，以及部分地或完全由人工合成的核酸等。通过使本发明的内标引物浓度低于通常情况(单一核酸的检测系统)，能够抑制 内标物扩增产物量而提高靶核酸的检测精度。此外，通过使核酸合成的底物核苷酸浓度高 于通常情况，在内标物的扩增反应中消耗的底物得以补偿，靶核酸的扩增滞后得以消除，从 而能够更加高灵敏度地、在更短时间内进行检测。也就是说，在本发明中，为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，与使内标物 与靶核酸同时扩增而进行测定时的扩增反应液相比，内标引物浓度设定得低，优选设定为 不到1倍，进一步优选设定为0. 5倍以下。通过这样能够控制内标物的扩增产物量，提高靶 核酸的测定精度。此外，在本发明中，为了使内标物在早的时期(提前)进行扩增，和不使用内标物 而使相同的靶核酸扩增来进行测定时的扩增反应液相比，核酸合成的底物核苷酸浓度设定 得高，优选设定为超过1倍，进一步优选设定为1.1倍以上。通过这样能够使在内标物的扩 增反应中消耗的底物得以补偿，靶核酸的扩增滞后得以消除，从而能够更加高灵敏度地、在 更短时间内进行检测。本领域技术人员可以对以上记载的反应试剂成分的条件进行适当调节，使内标物 得以提前扩增。此外，本发明的内标引物设计为在严格条件下与内标物进行特异性杂交而与靶核 酸不发生杂交；并且，靶核酸引物设计为在与所述相同的严格条件下与靶核酸进行特异性 杂交而与内标物不发生杂交。严格条件，指的是形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，也就是与 各核酸具有高度同源性(同源性为80%以上，优选为90%以上，进一步优选为95%以上) 的寡核苷酸发生杂交的条件。更加具体地说，这样的条件可以举例为在0. 5 IM的NaCl 存在下42 68°C、或在50%甲酰胺存在下42 °C、或在水溶液中65 68 °C进行杂交后，使 用0. 1 2倍浓度的SSC溶液在室温 68°C条件下进行清洗的条件。在一个实施方式中，本发明的核酸扩增方法包括以下工序(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的 内标物，(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于使内标物扩增 的寡核苷酸引物和用于使靶核酸扩增的寡核苷酸引物，所述用于使内标物扩增的寡核苷酸 引物能够在早于靶核酸扩增的时期(提前)使所述内标物进行扩增，(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行 测定的工序。在另一实施方式中，本发明的核酸扩增方法包括以下工序(a)向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的 内标物，(b)使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于使内标物扩增 的寡核苷酸引物和用于使靶核酸扩增的寡核苷酸引物，所述用于使内标物扩增的寡核苷酸 引物能够在早于靶核酸扩增的时期(提前)使所述内标物进行扩增，(c)通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行实时测定，根据其结果和内标物的添加量，计算样品中的初始靶核酸浓度或拷贝数的工序。在本发明中所用的样品，只要是有可能含有核酸的样品即可，没有特殊限制。作为 样品，可以举例为来源于人类或其它动物的活体或来源于植物、食品、环境的待测样品，含 有部分或完全由人工合成的核酸的样品，以及它们的培养液等。这些样品可以进行分离、提 取、浓缩、纯化等预处理。本发明中的靶核酸，指的是用于扩增的需要检测的核酸；靶序列指的是靶核酸上 的作为靶的碱基序列。靶核酸只要是用于扩增的任意核酸即可，没有特殊限制。动植物的 各种基因、各种病毒的基因、细菌、霉菌、酵母等的各种微生物基因等，无论DNA或RNA均可 以作为靶核酸。靶核酸可以是天然的，也可以是人工合成的，也包括PNA等。此外，靶核酸 包括单链核酸和双链核酸这二者。本发明中的模板核酸指本来的检测对象，其分子中含有 靶序列，是引物设计的基础。通过在进行分离、提取、浓缩、纯化等预处理之前在样品中添加内标物，并在预处 理之后实施本发明的方法来进行靶核酸的检测，能够监测预处理法的效率。此外，在预处理 后的样品中添加内标物而进行靶核酸的定性检测时，可以查出样品中的成分对于扩增反应 的影响，从而能够分辨假阴性。此外，使用各种已知浓度的靶核酸实施本发明的方法来预先 绘制标准曲线，再将未知的待测样品的测定结果与该标准曲线相比较，能够对未知的待测 样品中的靶核酸进行定量。本发明中检测核酸的方法，只要能够分辨内标物和靶核酸的扩增反应即可，没有 特殊限制。例如，可以采用使用荧光标记探针、放射性标记探针等的方法。本发明中的核酸扩增方法，只要是扩增效率高的等温核酸扩增方法即可，没有特 殊限制，例如适合采用使用具有X1 c+X2结构的引物的扩增方法或LAMP (Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)法。对使用具有Xlc+X2结构的引物的扩增方法说明如下。具有Xlc+X2结构的引物， 具体来讲是如下设计的。(a)当从模板核酸链上的靶序列的3’侧起向着该模板核酸链上的3'末端方向， 依次选择了第1任意序列Flc和第2任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序，含有与 该Flc相同的序列和与该F2c互补的序列F2的引物；(b)当从模板核酸链上的靶序列的5’侧起向着该模板核酸链上的5'末端方向， 依次选择了第3任意序列Rl和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序，含有与该 Rl互补的序列Rlc和与该R2相同的序列R2的引物。此外，所述引物(a) (b)可以成对使用，也可以将(a) (b)中的任意一个与通常的引 物成对使用。扩增反应可以使用链置换型DNA聚合酶作为聚合酶在等温条件下进行。因为引物 具有Xlc+X2的结构，始于该引物的延伸产物包括Xlc+(X2+)X1，其中下划线部分为互补序 列，进一步进行链内退火而在合成的双链核酸上生成单链部分。也就是说，即使不使双链在 高温条件下发生解离，在延伸产物上也会有链内退火而形成的新的链置换反应起点。此反 应的概况可以参考后述的LAMP法。此外，作为所述的链置换型DNA聚合酶，例如可以举例为Bst DNA聚合酶、 Bca (exo-) DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(KlenowFragment)、Vent
8DNA聚合酶、Vent (Exo-) DNA聚合酶(从Vent DNA聚合酶除去核酸外切酶活性的产物)、 DeepVent DNA聚合酶、De印Vent (Exo_) DNA聚合酶(从De印Vent DNA聚合酶除去核酸外切 酶活性的产物)、Φ 29噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(厂 商日本宝酒造)、KOD DNA聚合酶(厂商日本东洋纺)等。以下对LAMP法进行说明。所谓“LAMP法”是纳富等人开发的技术(Nucleic Acids Research, 28 (12)，e63, 2000)，是通过使作为模板的核苷酸与自身的3 ‘末端退火而作为互 补链合成的起点的同时，使此时形成的环和与之退火的引物相组合，从而能在等温下进行 互补链合成的核酸扩增方法。此外，在LAMP法中，引物的3'末端始终与来源于样品的区域 退火，因此碱基序列的互补性结合的检查机制反复产生作用。其结果，能够使高特异性的基 因序列的扩增反应成为可能。在LAMP法中，作为引物至少要使用能够分辨模板核酸的碱基序列上的共计6个 区域的碱基序列的，由寡核苷酸所构成的4种引物(内部引物F(以下称为FIP)、内部引物 B (以下称为BIP)、外部引物F (以下称为F3)以及外部引物B (以下称为B3)，但伴随着扩增 反应的进行，形成以自己为模板而具有成为合成起点的3'末端，并在其两端各具有环状结 构的 铃型核苷酸。并且，在进一步使用具有与该 铃结构5'末端侧的环结构的单链部 分的碱基序列的互补序列的引物(环引物F(以下称为LF)以及/或者环引物B (以下称为 LB)时，核酸合成的起点增加，从而能够缩短反应时间和使检测灵敏度提高。内部引物是LAMP法中所必需的引物，其是当在模板DNA的各链中，选定了存在于 3，侧的任意序列X2c，和与其相比靠近5，侧的任意序列Xlc的情况下，按照从3，侧到5， 侧的顺序含有该X2c的互补序列X2和该Xlc的相同序列Xlc (具有Xlc+X2结构)的引物。 从功能上讲，内部引物上的X2是与模板发生特异性退火而提供互补链合成起点的部分，而 Xlc提供扩增(延伸)产物形成环所需的互补序列。于是，该环成为新的互补链的合成起 点ο外部引物是具有与比内部引物位于更外侧(也就是模板的3’侧)的任意序列X3c 互补的序列，能够与此退火的2种引物(与2条链各自互补的各1种)。此外，为了使引物容易与模板核酸退火，所述Xl (Xlc)、X2(X2c)、X3 (X3c)的长度 优选为5 100个碱基，进一步优选为10 50个碱基。所述内部引物和外部引物是2条链(F和R)分别需要的，因此分别设计两种内部 引物(Flc+F2和Rlc+R2)以及两种外部引物(F3和R3)。优选对各任意序列进行选择，使得由LAMP法所得到的扩增产物不是优先进行分 子间退火，而是优先进行分子内退火，从而在末端形成发夹结构。例如，为了优先在分子内 退火，在选择任意序列时考虑Flc序列和F2c序列之间的距离以及Rl序列和Rlc序列之间 的距离是很重要的。具体来讲，优选进行选择，使得两序列间隔0 500个碱基，进一步优 选0 100个碱基，最优选10 70个碱基的距离存在。这里的数值是指分别不包括Flc 序列和F2c序列本身以及Rl序列和R2序列本身的碱基数。此外，环引物指的是，当在LAMP法的扩增产物的同一链上生成的互补序列相互退 火而形成环时，在其3'末端含有与该环内的序列互补的碱基序列的2种引物(与2条链各 自互补的各1种)。所述外部引物和环引物在LAMP法中不是必须的引物，但有这些时能够 使扩增(延伸)反应更加高效率地进行。
这一系列反应，优选在用于给予酶反应适合的pH值的缓冲剂、用于维持酶活性和 退火所必须的盐类、酶的保护剂、如需要还可以在解链温度(Tm)的调整剂共存的条件下进 行。缓冲剂可以使用Tris-HCl等具有从中性到弱碱性的缓冲作用的缓冲剂。pH根据使用 的DNA聚合酶进行调整即可。可以适当添加例如KC1、NaCl, MgCl2或(NH4)2SO4等盐类，用 于维持酶活性和调整DNA的解链温度(Tm)。酶的保护剂可以使用牛血清白蛋白(albumin) 和糖类等。此外，解链温度(Tm)调整剂一般可以使用甜菜碱(betaine)、脯氨酸(proline)、 二甲基亚砜或甲酰胺等。LAMP法中的反应是通过对于模板核酸添加以下的成分⑴(ii) (iii)，并且在使 得内部引物能够与模板核酸上的互补序列形成稳定的碱基对结合、且链置换型聚合酶能够 维持酶活性的温度下进行温育而进行。温育温度为50 75°C，优选为55 70°C，温育时 间为1分钟 10小时，优选为5分钟 4小时。(i)2种内部引物，或进一步包括2种外部引物，或进一步包括2种环引物(ii)链置换型聚合酶(iii)底物核苷酸从外部引物开始的核苷酸链合成，需要在从内部引物开始的核苷酸链合成之后开 始。达到这个目的的方法，可以举例为将内部引物的浓度设定得高于外部引物的浓度等。 具体来讲，可以通过将内部引物的浓度设定得比外部引物的浓度高2 50倍，优选设定为 4 25倍来进行实施。在实施本发明的方法时需要的各种试剂，可以预先包装而使其套件化。例如，可以 将内标物、内标引物、靶核酸引物、作为核酸合成底物的4种dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、 缓冲液、盐类、保护剂、标记探针等必要试剂作为套件来供应。具体来讲，本发明的测试试剂或试剂套件，至少包括以下试剂(a)至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列，并且浓度或拷贝数已 知的内标物，(b)能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增的，用于扩增内标物的寡核 苷酸引物，(c)用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物。本发明的测试试剂或试剂套件，可以进一步含有以下试剂(a)用于检测内标物的寡核苷酸探针，和(b)用于检测靶核酸的寡核苷酸探针。实施例以下给出本发明的实施例，但本发明不局限于这些实施例。实施例1.使用LAMP法进行淋菌(淋菌)的定量(1)检测模板作为内标物模板，制作了将沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的隐蔽性质粒 区域的一部分进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为CT质粒)。此外，作为靶核酸模 板，制作了将淋菌mtrA区域的一部分进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为NG质粒)。内标模板序列(CT质粒)(序列号1)CTCGAGMGA TTTATCGTAC GCAMTATCA TCTTTGCGGTTGCGTGTCCT GTGACCTTCA 60
TTATGTCGGAGTCTGAGCACCCTAGGCGTTTGTACTCCGTCACAGCGGTTGCTCGMGCA120
CGTGCGGGGTTATCTTAAMGGGATTGCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGMCGTGCGGG180
CGATTTGCCTTMCCCCACCATTTTTCCGGAGCGAGTTACGMGACAAMCCTCTTCGTT240
GACCGATGTACTCTTGTAGAMGTGCATMACTTCTGAGGATMGTTATAATMTCCTCT300
TTTCTGTCTGACGGTTCTTAAGCTGGGAGAMGAMTGGTAGCTTGTTGGAMCAMTCT360
GACTMTCTCCMGCTTMGACTTCAGAGGAGCGTTTACCTCCTTGGAGCATTGTCTGGG420
CGATCAAC 428
(2)内标引物和淬灭探针的合成
将沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)的隐蔽性质粒区域作为靶，设计了与近
缘菌没有交叉性的引物。引物的合成是委托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针 的合成是委托J_Bio21公司进行的。
0109]CT-FIP (序列号 2)
0110]5' -CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTACTCCGTCAC-3‘
0111]CT-BIP :(序列号 3)
0112]5' -GCGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTT-3'
0113]CT-F3 (序列号 4) 5 ‘ -ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ‘
0114]CT-B3 (序列号 5) 5 ‘ -CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ‘
0115]CT-LF (序列号 6) 5 ‘ -AAGATAACCCCGCACGT-3 ‘
0116]CT-LB (序列号 7) 5 ‘ -GGAGCGAGTTACGAAGACA-3 ‘
0117]CT-Pr (TAMRA 标记)(序列号 8)
0118]5' -ATAACCCCGCACGTGCTTCGAGCAACC-3‘
0119](3)靶核酸引物和淬灭探针的合成
0120]将淋菌的mtrA区域作为靶，设计了与近缘菌没有交叉性的引物。引物的合成是委 托Operon生物技术公司进行的。此外，淬灭探针的合成，是委托J_Bio21公司进行的。
0121]NG-FIP :(序列号 9)
0122]5' -CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3'
0123]NG-BIP (序列号 10)
0124]5' -ACGGAGAAAGTTTACAACCGGACACAAAACAGGCTCATATCCAGC-3'
0125]NG-F3 (序列号 11)5' -GCGGTTATCTCTGCATCG-3 ‘
0126]NG-B3 (序列号 12) 5 ‘ -GGTGTCGTAGCGGAAAC-3 ‘
0127]NG-LF (序列号 13) 5 ‘ -CGGGAAAAATACAATATCGCCC-3 ‘
0128]NG-LB (序列号 14) 5 ‘ -CGACAAAACGGCACATTTATGG-3 ‘
0129]NG-Pr (B0DIPY-FL 标记)(序列号 15)
0130]5' -CACATTTATGGTCAAACAGTG CGGCAAC-3‘ 0131 ](4) LAMP反应试剂的成分和浓度
0132]调制LAMP最终反应溶液30 μ L，其中各试剂浓度如下。
0133]· 30mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)
0134]· 15mM KCl
0135]· 15mM (NH4)2SO4
11
· 12mM MgSO4· 0. 15% Tween20· 2. ImM dATP· 2. ImM dCTP· 2. ImM dGTP· 2. ImM dTTP· 38. 4U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)· IO7拷贝CT质粒·内标引物0. 8μΜ CT-FIP(序列号 2)和 CT-BIP(序列号 3)0. 1 μ M CT-F3 (序列号 4)和 CT-B3 (序列号 5)0. 4 μ M CT-LF (序列号 6)和 CT-LB (序列号 7)· 0. 067 μ M 内标探针 CT-Pr (序列号 8) 靶核酸引物0. 8μΜ NG-FIP(序列号 9)和 NG-BIP(序列号 10)0. ΙμΜ NG-F3(序列号 11)和 NG_B3(序列号 12)0. 4μ M NG-LF(序列号 13)和 NG-LB(序列号 14)· 0. 067 μ M靶核酸探针NG-Pr (序列号15)(5)检测和计算定量值检测是使用淬灭探针(Quenching Probe)法进行的。使用Mx3000P (STRATAGENE公 司)，对伴随内标物和靶核酸的扩增的荧光消光进行了实时测定。定量值是根据Tt值(荧 光强度随扩增变化而达到特定数值的时间)依赖于初始模板量而进行计算的。(6)靶核酸的定量评价将NG质粒IO1至IO7拷贝的稀释系列作为靶核酸，添加到所述LAMP反应试剂中。 在63°C进行60分钟LAMP反应，使用淬灭探针法对荧光消光进行实时测定，绘制了标准曲 线。其结果，最低检测灵敏度为NG质粒10拷贝/测试(图1)，定量测定范围为IO1至 IO7拷贝/测试(标准曲线的相关系数为R = 0.9994)(图2)。NG质粒和CT质粒均具有良 好的再现性(图1，3)，此外，NG质粒的IO1至IO7拷贝/测试的所有的扩增均在60分钟以 内结束。实施例2.使用LAMP法进行HBV的定量(1)检测模板作为内标物模板，制作了将人工核酸进行了亚克隆而得到的质粒DNA(以下称为 Arita2质粒)。此外，作为靶核酸模板，制作了将HBV S区域的一部分进行了亚克隆而得到 的质粒DNA (以下称为HBV质粒)。内标模板序列(Arita2质粒)(序列号16)ATTCGMGGG TGATTGGATC GGAGATAGGA TGGGTCMTCGTAGGGACM TCGMGCCAG 60MTGCMGGG TCMTGGTAC GCAGMTGGA TGGCACTTAGCTAGCCAGTT AGGATCCGAC 120TATCCMGCG TGTATCGTAC GGTGTATGCT TCGGAGTMCGATCGCACTA AGCATGGCTC 180
进行的
MTCCTAGGC ATTCGTACCG ATCACACCCG ATAGCTACCC ATTCCTACGG TTACGTACGC TATGGMCGG (2)内标引物和淬灭探针的合成 将人工核酸Arita2作为靶设计了引物
TGATAGGTTCGCACATAGCATGCCACATACGATCCGTGATTGCTAGCGTG240AGMCTCACGCCTTATGACTGCCCTTATGTCACCGCTTATGTCTCCCGAT300TTATCTCAGCCCTMTCTCTGCGGTTTAGTCTGGCCTTMTCCATGCCTC360TCATACCATCGCTCATACCTTCCGACATTGCATCCGTCATTCCMCCCTG420TCTMCCTAGCCTCTATCCTACCCAGTTAGGTTGCCTCTTAGCATCCCTG480TCTTACCATGCGTCTTACCTTGGCACTATCGATGGGAGTATGGTAGCGAG540ACTMCGTAGGCAGTMGCTAGGGTGTMGGTTGGGACTAAGGATGCCAG600
引物的合成是委托Operon生物技术公司 此外，淬灭探针的合成是委托J_Bio21公司进行的。
淬灭探针(QP)是日本独立行政法人产业技术综合研究所开发的荧光标记探针， 其原理在于通过与靶序列进行杂交，靶序列中存在的鸟嘌呤使荧光消光(参考日本专利第 3437816号，日本专利第3985959号)。Arita2-FIP (序列号 17)5 ‘ -CGCTTGGATAGTCGGATGCAAGGGTCAATGGTAC-3‘Arita2-BIP (序列号 18)5 ‘ -ACGGTGTATGCTTCGGTGTGCGAACCTATCAGC-3‘Arita2-F3 (序列号 19) 5 ‘ -GGACAATCGAAGCCAGAA-3 ‘
Arita2-B3 (序列号 20) 5 ‘ -ATCACGGATCGTATGTGG-3 ‘Arita2-LF (序列号 21) 5' -GCTAGCTAAGTGCCATCC-3 ‘Arita2-LB (序列号 22) 5 ‘ -AACGATCGCACTAAGCAT-3 ‘Arita2-Pr (TAMRA 标记)(序列号 23)5' -GCTAGCTAAGTGCCATCCATTCTGCGTACC-3'(2)靶核酸引物和淬灭探针的合成将HBV的S区域作为靶设计了引物。引物的合成，是委托Operon生物技术公司进 行的。此外，淬灭探针的合成是委托J_Bio21公司进行的。HBV-FIP (序列号 24)5' -CCGCAGACACATCCAGCGATAAACCTCCAATCACTCACCAA-3'HBV-BIP (序列号 25)5' -CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTCCTGGAATTAGAGGACA-3‘HBV-F3 (序列号 26) 5 ‘ -CAAAATTCGCAGTCCC-3 ‘HBV-B3 (序列号 27) 5 ‘ -GCAGGTCTTGCATGGTCC-3 ‘HBV-LF (序列号 28) 5 ‘ -CAGCGATAGCCAGGACA-3 ‘HBV-LB (序列号 29) 5 ‘ -TCTGGACTATCAAGGTATGTTGC-3 ‘HBV-Pr (B0DIPY-FL 标记)(序列号 30)5' -GTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCC-3'(4) LAMP反应试剂的成分和浓度调制LAMP最终反应溶液30 μ L，其中各试剂浓度如下。· 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)
· 12. 8mM (NH4)2SO4· 9. 7mM MgSO4· 0. 10% Tween20· 1. 79mM dATP· 1. 79mM dCTP· 1. 79mM dGTP· 1. 79mM dTTP· 28. 8U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)· IO6 拷贝 Arita2 质粒·内标引物0. 4μΜ Arita2_FIP(序列号 17)和 Arita2_BIP(序列号 18)0.05 μ M Arita2_F3(序列号 19)和 Arita2_B3 (序列号 20)0. 4μΜ Arita2_LF(序列号 21)和 Arita2_LB(序列号 22)· 0. 067 μ M 内标探针 Arita2_Pr (序列号 23) 靶核酸引物1. 6μΜ HBV-FIP (序列号 24)和 HBV-BIP (序列号 25)0. 2 μ M HBV-F3 (序列号 26)和 HBV-B3 (序列号 27)0. 8 μ M HBV-LF (序列号 28)和 HBV-LB (序列号 29)· 0. 067 μ M靴核酸探针HBV-Pr (序列号30)(5)检测和计算定量值检测是使用淬灭探针法进行的。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)，对伴随内标物 和靶核酸的扩增的荧光消光进行了实时测定。定量值是根据Tt值依赖于初始模板量而进 行计算的。(6)靶核酸的定量评价将HBV质粒IO1至IO8拷贝的稀释系列作为靶核酸，添加到所述LAMP反应试剂中。 在63°C进行60分钟LAMP反应，使用淬灭探针法对荧光消光进行实时测定，绘制了标准曲 线。其结果，最低检测灵敏度为HBV质粒10拷贝/测试(图4)，定量测定范围为IO1 至IO8拷贝/测试(标准曲线的相关系数为R = O. 9996)(图5)。HBV质粒和Arita2质粒 均具有良好的再现性(图4，6)，此外，HBV质粒的IO1至IO8拷贝/测试的所有的扩增均在 60分钟以内结束。实施例3. HBV检测中内标物浓度变化的影响为了调查提前扩增所需要的内标物的浓度，对HBV检测中内标物(Arita2质粒) 的模板量为每测试IO2拷贝、IO4拷贝、和IO6拷贝时进行了研究。(I)LAMP反应试剂的成分和浓度内标物的模板量以外的反应试剂成分和浓度，与实施例2相同。(2) HBV质粒模板量和检测将每次测试的HBV质粒模板量设为IO1拷贝、IO8拷贝这两种浓度，在63°C条件下
14进行了 60分钟LAMP反应。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)对各模板量时随着HBV质粒 和内标物(Arita2质粒)扩增引起的荧光消光进行了实时检测，计算了 Tt值。(3)结果将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间，显示在表1和图7中。内标物为低浓度 (IO2拷贝/测试)时，高浓度(IO8拷贝/测试)的HBV质粒模板提前于内标物进行扩增，受 其影响内标物的扩增反应大幅度滞后。此外，HBV质粒模板的两个浓度间的内标物的扩增 时间差很大，是5. 67分钟。一方面，内标物为高浓度(IO6拷贝)时内标物的扩增没有滞后， 并且内标物的扩增时间与HBV质粒模板浓度无关，是基本一定的。也就是说，为了使内标物 更早地，并且与靶核酸模板量无关地在一定时间内扩增，需要将内标物模板量设定得高，在 本研究中选择IO6拷贝/测试是适当的。表1内标物模板量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟)
模板量内标模板量(拷贝/测试)(拷贝/测试)IO8IO4IO2HBV IO1拷贝33.927.422.4HBV IO8拷贝5.905.575.54Arita2 (HBV IO1 拷贝)5.386.848.33Arita2 (HBV IO8 拷贝)5.418.4114.0实施例4 HBV检测中内标引物浓度变化的影响为了调查适合提前扩增的内标引物浓度，在HBV检测中将内标引物浓度设定 为Xl(在不使内标物提前扩增的体系中使用的浓度)、X0. 25、X0. 3、X0. 5而进行了研允。(I)LAMP反应试剂的成分和浓度Xl内标引物1. 3μΜ Arita2_FIP(序列号 17)和 Arita2_BIP (序列号 18)0. 17 μ M Arita2-F3 (序列号 19)和 Arita2_B3 (序列号 20)1. 3μΜ Arita2_LF(序列号 21)和 Arita2_LB (序列号 22)此外，内标引物量以外的反应试剂的成分和浓度与实施例2相同。(2) HBV质粒模板量和检测将HBV质粒模板量设定为每次测试IO1拷贝、IO8拷贝这2种浓度，在63°C进行60 分钟的LAMP反应。使用Mx3000P (STRATAGENE公司)对于各模板量中伴随着HBV质粒、内 标物的扩增的荧光消光进行实时检测，计算了 Tt值。(3)结果将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间显示在表2和图8中。内标引物量多时 (X1)，HBV质粒的扩增时间整体变慢，灵敏度附近的扩增时间滞后明显。此外，内标引物量 过于低时(X0. 25)，某些HBV质粒浓度时内标物的扩增时间发生背离，难于在一定时间内进行扩增。因此，在本研究中选择X0. 3作为内标引物浓度是适当的。表2内标引物量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟) 实施例5. HBV检测中反应试剂成分浓度的影响为了调查适合内标物提前扩增的反应试剂成分浓度，在HBV检测中，改变含有底 物核苷酸的反应试剂成分，对其影响进行了探讨。(I)LAMP反应试剂的成分和浓度调制了含有底物核苷酸的试剂成分AX 1 (在单一的靶核酸检测系统中通常使用 的浓度)和其1. 2倍浓度的试剂成分X 1. 2。试剂成分AXlLAMP最终反应溶液30 μ L中各试剂浓度如下。25mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)IOmM KClIOmM (NH4)2SO48mM MgSO40. 10% Tween201. 4mM dATP1. 4mM dCTP1. 4mM dGTP1. 4mM dTTP28. 8U Bst DNA 聚合酶(New England Biolab 公司)此外，试剂成分A之外的内标物(Arita2质粒)、内标引物、内部标准探针、靶核酸 引物、靶核酸探针以及这些物质的浓度与实施例2相同。(3) HBV质粒模板量和检测将HBV质粒模板量设定为每次测试IO1拷贝、IO4拷贝、IO8拷贝这3种浓度，在63°C 进行60分钟的LAMP反应。使用Mx3000P(STRATAGENE公司)对于各模板量中伴随着HBV 质粒、内标物的扩增的荧光消光进行实时检测，计算了 Tt值。(3)结果将在(2)中求得的Tt值作为扩增时间显示在表3和图9中。在试剂成分AXl反 应液中，高浓度的HBV质粒模板(IO8拷贝/测试)优先于内标物进行扩增，而在XI. 2反
16应液中，内标物的扩增在先，并且与HBV质粒模板的浓度无关，能够在一定时间内使内标物 进行扩增。因此，为了使内标物提前扩增，应将含有底物核苷酸的反应试剂成分浓度设得较 高，在本探讨中研究XI. 2是适当的。表3反应试剂成分量变化时的靶核酸和内标物的扩增时间(分钟) 实施例6.使用LAMP法讲行淋菌的检测(1) LAMP反应试剂成分和浓度反应试剂成分和浓度与实施例1中相同。
0280](2)检测以高浓度的NG质粒或低浓度的NG质粒作为靶核酸，在63°C下进行LAMP反应60 分钟，使用淬灭探针法对于荧光消光进行了实时测定。(3)结果如图10，11所示，能够在同一反应系中进行内标物(CT质粒)和靶核酸(NG质粒) 的扩增，与靶核酸的模板浓度无关，内标物的扩增时间是一定的。本说明书中引用的所有的出版物、专利和专利申请，作为参考直接包括于本说明 书中。
权利要求
一种核酸扩增方法，该核酸扩增方法中使用内标物，其中，内标物提前或滞后于靶核酸而进行扩增。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，该核酸扩增方法中内标物提前于靶核酸而进 行扩增，其包括以下工序向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的内标物；使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的寡核苷酸 引物和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用于扩增内标物的寡核苷酸引物能够在早于 靶核酸扩增的时期使所述内标物进行扩增；通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法进行测定的工序。
3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，该核酸扩增方法中内标物提前于靶核酸而进 行扩增，其包括以下工序向含有靶核酸的样品中添加溶液的工序，该溶液中含有已知浓度或拷贝数的内标物；使用扩增反应液进行扩增反应的工序，该扩增反应液含有用于扩增内标物的寡核苷酸 引物和用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物，所述用于扩增内标物的寡核苷酸引物能够在早于 靶核酸扩增的时期使所述内标物进行扩增；通过能够分辨所述内标物的扩增反应和所述靶核酸的扩增反应的方法，进行实时测 定，根据其结果和内标物的添加量，计算出样品中的初始靶核酸浓度或拷贝数的工序。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，进行靶核酸的定量。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，检测靶核酸的有无。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，内标物至少在引物设计 区域内具有与靶核酸不同的碱基序列。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，用于扩增内标物的寡核 苷酸引物设计为与内标物特异性杂交而不与靶核酸杂交；并且，用于扩增靶核酸的寡核苷 酸引物设计为与靶核酸特异性杂交而不与内标物杂交。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的核酸扩增方法，该核酸扩增方法中内标物提 前于靶核酸而进行扩增，其中，使用下述用于扩增内标物的寡核苷酸引物，所述用于扩增内 标物的寡核苷酸引物设计为使得在早于靶核酸扩增的时期发生内标物扩增。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的核酸扩增方法，其特征在于通过以下的条 件设定，使内标物提前于靶核酸进行扩增(a)与使内标物和靶核酸同时扩增来进行测定时的扩增反应液相比，将内标物设定为 更高浓度和/或将用于扩增内标物的寡核苷酸引物设定为更低浓度；(b)与不使用内标物而使相同的靶核酸扩增来进行测定时的扩增反应液相比，将底物 核苷酸设定为更高浓度。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，在等温条件下进行扩 增反应。
11.根据权利要求1至9中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，扩增反应使用下述引 物(a)和/或引物(b)(a)当从模板核酸上的靶序列的3’侧起朝着该模板核酸上的3'末端方向依次选定第1任意序列Flc和第2任意序列F2c时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该Flc相同的序 列和与该F2c互补的序列F2的引物；(b)当从模板核酸上的靶序列的5’侧起朝着该模板核酸上的5'末端方向依次选定第 3任意序列Rl和第4任意序列R2时，按照从5’侧到3’侧的顺序含有与该Rl互补的序列 Rlc和与该R2相同的序列R2的引物。
12.根据权利要求1至9中任意一项所述的核酸扩增方法，其中，扩增反应为LAMP法。
13.—种测试试剂或试剂套件，其用于实施根据权利要求1至12中任意一项所述的核 酸扩增方法。
14.根据权利要求13所述的测试试剂或试剂套件，其用于实施内标物提前于靶核酸而 进行扩增的核酸扩增方法，其至少含有以下的试剂内标物，其至少在引物设计区域内具有与靶核酸不同的碱基序列，并且浓度或拷贝数 已知；用于扩增内标物的寡核苷酸引物，其能够在早于靶核酸扩增的时期使内标物进行扩增；用于扩增靶核酸的寡核苷酸引物。
15.根据权利要求14所述的测试试剂或试剂套件，其还含有如下的试剂(a)用于检测内标物的寡核苷酸探针；和(b)用于检测靶核酸的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明的课题在于提供一种在使用内标物的核酸检测系统中，能够在确保对靶核酸的精确测定值的同时稳定地对内标物进行扩增的方法，以及在该方法中使用的试剂套件。本发明涉及使用内标物的样品中靶核酸的扩增方法，和在该方法中使用的试剂以及试剂套件，在所述方法中，通过提前于靶核酸扩增而使内标物进行扩增，来防止内标物的扩增产物对靶核酸的扩增反应产生影响。
文档编号C12Q1/68GK101903520SQ200880122150
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月17日 优先权日2007年10月19日
发明者保坂宪光, 神田秀俊, 米川俊广, 纳富继宣 申请人:荣研化学株式会社