基于sm-蛋白的分泌工程化的制作方法

专利名称：基于sm-蛋白的分泌工程化的制作方法
技术领域：
本发明系关于细胞培养技术之领域。其系关于一种产生蛋白之方法以及一种产生 新表达载体及宿主细胞以供生物药生产之方法。本发明另外系关于药物组合物及治疗方 法。
背景技术：
用于人类疗法之生物药品的市场继续高速增长，有270种新颖生物药品在临床研 究中正得到评估且估计在2003年出售了 300亿。生物药品可自各种宿主细胞系统制造，所 述宿主细胞系统包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞，包括衍生 自人类之细胞株。目前，由于真核细胞之正确加工及修饰人类蛋白之能力，因此自真核细胞 制造愈来愈多数目之生物药品。因此，自此等细胞成功且高产率地制造生物药品系关键的 且高度视用于方法中之重组单克隆细胞株之特征而定。因此，急需产生具有改良特性之新 颖宿主细胞系统且建立以高的比生产率培养生产细胞株之的方法作为高产率方法之基础。任何生物药品制造方法之产率均很大程度上视当在方法条件下生长时生产细胞 (producing cell)每次分泌之蛋白产物之量而定。许多复杂之生物化学细胞内过程对于自 真核细胞合成及分泌治疗用蛋白为必要的。所有此等步骤，诸如转录、RNA转运、转译、转译 后修饰及蛋白转运在野生型宿主细胞株中均经严格调控且将影响衍生自此宿主之任何生 产细胞株的比生产率。在以往，大多数工程化方法系集中于推动诸如转录及转译之过程的分子网络以提 高蛋白制造中此等步骤之产率。然而，就任何多步骤制造过程而言，在过程链之早期步骤期 间拓宽瓶颈均可能在远处下游(尤其分泌途径中之转译后)产生瓶颈。上至某一临限，已 报道生产细胞之比生产率系与产物基因转录量线性相关。然而，进一步增强产物在mRNA水平之表达可引起蛋白合成、折叠或转运机制之超 负荷，导致蛋白产物在细胞内累积。实务上，此现象可在目前制造过程中频繁地观察到。因 此，制造细胞株之分泌性转运机制为用于新颖宿主细胞工程化策略之引人关注之目标。对工程化所分泌之治疗用蛋白之细胞内转运的首次研究系围绕如结合蛋白BiP/ GRP78及蛋白二硫化异构酶(PDI)之分子伴随蛋白的过度表达。伴随蛋白为宿于内质网 (ER)中且有助于新合成蛋白之折叠及组装的细胞蛋白。然而，与可预期之情况相反，已展示 哺乳动物细胞中之BiP过度表达降低而非增大其所缔合之蛋白的分泌，而CHO细胞中之PDI 过度表达产生与不同蛋白产物抵触之结果。描述在CHO细胞株中对于IFN-γ制造之ER至 顺式高尔基体转运问题之报告(Hooker等人，1999)支持此等惊人发现(增大细胞之蛋白折 叠能力产生远处下游制造瓶颈)之可能解释。总之，需要改良宿主细胞之分泌能力以便重组蛋白纸制造。此与新颖转录增强技 术及高滴度方法组合可甚至变得更重要以防止转译后瓶颈及蛋白产物之细胞内累积。然 而，目前在通向分泌性转运机制之目标操作的道路上存在两个主要障碍关于基本调控机 制之仍受限之了解及防止在分泌过程中瓶颈移至远处下游之挑战。

发明内容
本发明描述Secl/Munc 18 (SM)蛋白家族之成员，尤其两个成员，亦即Munc-18c及 Slyl，藉由联合促进将所分泌蛋白转运至细胞表面及调节分泌小泡与细胞膜之融合中的若 干后续步骤而在刺激总体胞吐作用中的新颖及惊人作用。本发明亦提供有效改良自真核细 胞经由分泌途径转运之蛋白之产量的方法。另外，其描述分泌途径之目标操作用于治疗疾 病及发炎病况之用途。蛋白分泌为复杂之多步骤机制蛋白预定转运至细胞外空间或将外部细胞膜首先 以共转译方式转运至内质网中。自此，将其封装于脂质小泡中且转运至高尔基体(Golgi apparatus)且最终从穿越高尔基体的网络至细胞膜中，其中将其释放至培养基中。在各转运步骤中，自小泡及目标膜之SNARE [可溶性NSF (N-乙基马来酰亚胺敏感 因子)附接受体]蛋白均形成反式SNARE复合物，其构成发生融合所需之核心机构。为满 足在各种情况下之生理需求，SNARE介导的融合机构必须空间地且暂时地可调，以便能将来 自细胞内及细胞外两方面的刺激正确地整合。Secl/Muncl8(SM)蛋白似乎为调节SNARE蛋白之关键。两种SM蛋白，Slyl及 MimclS (包括a、b及c三种同工型)系与沿分泌途径(ER-高尔基体-细胞膜)之小泡融 合有关。Slyl为融合至内质网(ER)衍生COPII小泡之高尔基体所需，MunclS为融合至分 泌小泡之细胞膜(PM)所需。在本发明中，我们分析Slyl及MimclSc对分泌途径之生理影响，且首次发现两种 SM蛋白一致地刺激总体胞吐作用。MimclSc及Slyl之活化作用的分子机制可能亦保守。 基于本文之发现，我们领创了基于SM蛋白之分泌工程化，其导致增强哺乳动物细胞中的分 泌。基于SM蛋白之分泌工程化代表了代谢工程化的新颖策略，为工业化生产蛋白药提供了 新的平台。本发明所述方法在若干方面有利首先，我们证实，Munc-ISc或Sly-I单独，或两种蛋白一起异源表达，是一种通过 提高宿主细胞分泌能力来增加重组蛋白产量的策略。在产业化应用方面，该研究通过在分泌途径中引入转译后发挥作用的转基因进行 基因工程化，开拓了避过此瓶颈的激励人心的前景。这看上去特别具有实用性，因为最近的 一代高效表达载体的使用可能引起生产细胞株内蛋白折叠、修饰及转运机构的超负荷，因 此降低其理论最大生产率。异源引入SM家族的促分泌蛋白(诸如MimclS及/或Slyl)可 克服此限制。第二，SM蛋白系自酵母至人类保守进化在酵母中，存在四种SM蛋白(Seclp、 Slylp、Vps33p 及 Vps45p)，在果蝇中有三种(R0P、Slyl 及 Vps33/康乃馨(carnation))，在 蠕虫中有六种(Unc-18以及5种根据基因组序列数据库之其它基因)以及在脊椎动物中有 七种蛋白(Munc 18-1、Munc 18-2 及 Muncl8-3、VPS45、VPS33_A 及 VPS33-B 及 Slyl)。鉴于跨 物种之高保守程度，似乎极有可能将SM蛋白用以调节所有真核宿主细胞物种(自酵母历经 蠕虫及昆虫细胞至哺乳动物系统)中的蛋白分泌及细胞表面表达。第三，SM蛋白家族所有成员均展示在整个序列中之高序列相似性程度，表明其应 显示类似整体结构。另外，已为四个物种中九种SM基因描述了功能损失突变，其所有均引
6起小泡转运及融合之严重损伤，表明SM蛋白在小泡转运及分泌过程中应起到类似及重要 之作用。因此，我们主张MimclS及/或Slyl对在本发明中所述之目的之适用性可同等地 转移至SM蛋白家族之任何其它成员。第四，藉由调节SNARE介导之小泡融合机构，SM蛋白家族之成员与自ER至高尔基 体、自高尔基体至细胞膜之小泡转运及最终胞吐融合(exocytoticfusion)之所有不同步 骤均有关。因此，参与分泌性转运链之后续步骤的多种SM蛋白之异源表达具有对跨膜蛋白 之总体胞吐作用或细胞表面表达产生附加或甚至协同效应的潜力。另外，作为藉由转录因 子XBP-I异源性共表达之蛋白转运的起点之ER之同时工程化进一步提高此分泌增强作用。作为第五优势，SM蛋白亦影响分泌途径之最后一个步骤，亦即小泡转运至细胞膜， 且藉此在不产生远处下游瓶颈之风险的情况下促进蛋白分泌。总之，SM蛋白在小泡介导蛋白转运(自ER至高尔基体及自高尔基体至细胞膜)之 所有步骤中的参与使得MimC18C、Slyl及所有其它SM家族蛋白均为用于目的在于增强真核 细胞分泌能力之(多)基因工程化方法的极诱人及有希望之目标。在本发明中所述之小泡介导蛋白转运之目标工程化可具有广泛应用。详言之，可 突出两种基本方法(i)过度表达SM蛋白及/或增强SM蛋白之活性以提高细胞之分泌性转运能力，或(ii)降低SM蛋白活性及/或表达以作为降低癌细胞增殖及/或侵入之基因疗法 的手段。SM蛋白过度表达之适用性所述之本发明描述一种藉由SM家族蛋白之过度表达改良细胞之总体蛋白分泌能 力来产生用于制造异源蛋白之改良真核宿主细胞之方法。此使得在基于真核细胞之制造过程中提高蛋白产率。其藉此降低此等过程之物品 的成本且同时降低需经制造以产生物质之批料之数目，该物质为治疗用蛋白之调查研究、 诊断学、临床研究或市场供应所需。本发明另外加速药物开发，因为产生足量的用于临床前 研究之物质常为关于时间表之关键工作包。本发明可用以提高用于产生一或若干种用于诊断目的、研究目的(目标识别、先 导识别(lead identification)、先导最佳化(lead optimization))或在市场或在临床开 发中制造治疗用蛋白的特异性蛋白之所有真核细胞的蛋白制造能力。如在本申请案中所示，SM蛋白之异源表达引起所有类别蛋白(包括经分泌之酶、 生长因子及抗体)之产量增加。因为跨膜蛋白共享同一小泡介导转运途径(其系由SM蛋 白与SNARE之相互作用来调节)，所以此工程化方法同等地适用于改良跨膜蛋白之转运及 增强其在细胞表面上之丰度。因此，本文所述之方法亦可用于学术及工业研究目的，其旨在表征细胞表面受体 之功能。举例而言，其可用于表面蛋白之制造及后续纯化、结晶及/或分析。另外，藉由所 述方法产生之跨膜蛋白或表达此等蛋白之细胞可用于筛选试验，例如物质之筛选、孤儿受 体之配位体的识别或在先导最佳化期间对改良效用之搜寻。因为细胞表面受体为药物目标 之主要类别，所以此对于新颖人类药物疗法之开发至关重要。另外，本文所述之方法对于研究与细胞表面受体缔合之细胞内信号复合物或分析 细胞-细胞通讯(部分系由可溶性生长因子与在同一或另一细胞上之其相应受体的相互作
7用所介导)而言可为有利的。降低/抑制SM蛋白表达及/或活性之适用性在本发明中，我们提供SM表达降低引起可溶性细胞外蛋白分泌降低之证据，如为 MunclSc及Slyl所示。此使得SM蛋白为治疗性操作之诱人目标。自正常健康细胞转化为癌细胞的特点之一为自外源生长因子之存在获得独立。与 正常细胞相反，肿瘤细胞能够产生所有为其存活及自身增殖所必需之生长因子。除此自分 泌机制之外，癌细胞常展示在其表面上生长因子受体之上调表达，其导致对自周围组织中 之细胞所分泌之旁分泌作用生长及存活因子的反应性增强。例如藉由使用shRNA-方法、 siRNA-方法或反义RNA-方法，藉由靶向SM-蛋白，如肿瘤细胞中之Sly-I及Muncl8，可能 以两种方式破坏自分泌以及旁分泌生长-刺激及/或存活机制(i)藉由降低生长因子转 运及分泌及(ii)藉由减少肿瘤细胞上相应生长因子-受体之量。藉此，生长刺激信号之量 及癌细胞感知及响应此等信号之能力均将降低。抑制在癌细胞中之SM蛋白表达或活性因 此应代表防止癌细胞增殖及存活之强大手段。SM蛋白另外似乎为抑制肿瘤侵入及转移之有效治疗目标。在大多数类型之人类癌 症的晚期，原发肿瘤产生先驱细胞(pioneer cell)，所述先驱细胞移出、侵入相邻组织且行 进至远程位点，其中其可成功建立新群落(称为转移)。作为组织侵入之先决条件，癌细胞表达整套蛋白酶，所述蛋白酶使其能够经由周 围健康组织而迁移，穿过基膜，进入血流且最终侵入目标组织。将此等蛋白酶中之一些表示 为膜结合蛋白，例如MT-MMP及ADAM。由于其在基质重塑、生长因子排出(shedding)及肿瘤 侵入中之关键作用，因此将蛋白酶本身讨论作为癌症疗法之药物目标。我们主张抑制肿瘤 细胞中SM蛋白表达及/或活性减少在目标细胞表面上之膜结合蛋白酶之量。此应降低或 甚至损伤肿瘤细胞之侵入能力以及其对生长因子排出之能力，从而使得肿瘤侵入性及转移 潜力降低。因此，靶向SM家族之蛋白提供防止晚期肿瘤发生，尤其自良性/实体节结转化 为侵袭性转移肿瘤之新颖方式。因此，对于治疗应用而言，目标在于降低及/或抑制SM蛋白之活性及/或表达。此 可藉由核苷酸组合物来达成，将该核苷酸组合物用作藉由抑制SM蛋白功能来治疗疾病之 人类治疗剂，藉以该药物包含经由结合其RNA之序列移动子(sequence motive)来特异性 抑制SM蛋白的shRNA、RNAi、siRNA或反义RNA。降低/抑制SM蛋白活性/表达亦可藉由 含有结合及沉默各别SM蛋白基因之启动子的核苷酸之药物物质来达成。另外，药物物质或产物可包含抑制SM蛋白之表达或活性的新颖化学实体或肽或 蛋白。在蛋白为活性医药化合物之情况下，其可为(i)与SM蛋白之启动子结合藉此抑制其 表达之蛋白，(ii)与SM蛋白或其相互作用搭配物(例如，SNARE复合物内之突触融合蛋白 (syntaxin)或蛋白)结合藉此阻碍SM蛋白与其结合搭配物之功能相互作用的蛋白，(iii) 类似于SM蛋白但并不履行其功能之蛋白，意谓"显性负"SM蛋白变异体，或(iv)充当SM 蛋白及其结合搭配物两者之骨架从而使得蛋白不可逆结合且形成稳定及非功能性蛋白复 合物的蛋白。根据本发明，提供使用本发明之化合物的新颖方法。因此，本发明之化合物可用以 治疗癌症或其它异常增殖性疾病。癌症系以两种方式分类癌症起源之组织的类型(组织 类型)及原发部位，或在体内癌症首先发生之位置。癌症发生之最常见部位包括皮肤、肺、女性乳房、前列腺、结肠及直肠、淋巴系统、子宫颈及子宫。化合物因此适用于治疗多种癌症，包括(但不限于)以下AIDS相关之癌症，诸如卡波氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)；骨相关癌症，诸如尤因 (Ewing)家族肿瘤及骨肉瘤；脑相关癌症诸如成人脑瘤、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星 形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、儿童室管膜瘤、儿童神经管胚细胞瘤、 儿童小脑幕上原始神经外胚层瘤、儿童视觉途径及下丘脑神经胶质瘤及其它儿童脑瘤；乳 癌；消化/胃肠相关癌症，诸如肛门癌、肝外胆管癌、胃肠类癌、结肠癌、食道癌、胆囊癌、成 人原发性肝癌、儿童肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌及胃癌；内分泌相关癌症，诸如肾上腺皮 质癌、胃肠类癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、副甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤及甲状腺癌； 眼相关癌症，诸如眼内黑色素瘤及视网膜胚细胞瘤；泌尿生殖器相关癌症，诸如膀胱癌、肾 脏(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞(transitional cell)肾盂及输尿管癌、睾 丸癌、尿道癌、韦尔姆斯氏瘤(Wilms' tumor)及其它儿童肾脏肿瘤；生殖细胞相关癌症， 诸如儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤及睾丸癌；妇科相 关癌症，诸如子宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠期滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor)、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜力肿瘤、子宫肉瘤、阴道癌及外阴 癌；头及颈部相关癌症，诸如下咽癌(hypopharyngeal cancer)、喉癌、唇及口腔癌、原发灶 隐匿之转移性鳞状颈癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦及鼻腔癌、副甲状腺癌及唾液腺癌；血液学 /血液相关癌症，诸如白血病，诸如成人急性淋巴母细胞白血病、儿童急性淋巴母细胞白血 病、成人急性骨髓白血病、儿童急性骨髓白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓白血病及 毛细胞白血病；及淋巴瘤，诸如AIDS相关之淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、成人霍奇金氏淋 巴瘤(adultHodgkin' s lymphoma)、儿童霍奇金氏淋巴瘤、怀孕期间霍奇金氏淋巴瘤、蕈样 真菌病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、怀孕期间非霍奇金氏淋巴瘤、原 发性中枢神经系统淋巴瘤、赛谢症候群(Sezarysyndrome)、皮肤T-细胞淋巴瘤及华氏巨球 蛋白血症(Waldenstrsm's macroglobulinemia)及其它血液学/血液相关癌，诸如慢性 脊髓增生病症、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓发育不良症候群及骨髓发育不良/骨髓增 生病；肺相关癌症，诸如非小细胞肺癌及小细胞肺癌；肌肉骨骼相关癌症，诸如尤因氏家族 肿瘤、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤、成人软组织肉瘤、儿童软组织肉瘤 及子宫肉瘤；神经相关癌症，诸如成人脑瘤、儿童脑瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、 大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、小脑幕上原始神经外胚层 瘤、视觉途径及下丘脑神经胶质瘤及其它脑瘤，诸如神经母细胞瘤、垂体瘤及原发性中枢神 经系统淋巴瘤；呼吸道/胸相关癌症，诸如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤 及胸腺癌；皮肤相关癌症，诸如皮肤T-细胞淋巴瘤、卡波氏肉瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌 (Merkel cell carcinoma)及皮肤癌。此等病症已在人类中充分表征，但于其它哺乳动物中亦以类似之病源学存在，且 可藉由本发明之药物组合物来治疗。对于治疗用途而言，可以治疗有效量、以任何习知剂型、以任何习知方式来投与化 合物。投与途径包括(但不限于)静脉内、肌肉内、皮下、滑液内、藉由输注、舌下、经皮、经 口、局部或藉由吸入、锭剂、胶囊、囊片、液体、溶液、悬浮液、乳液、口含剂、糖浆、可复水散 剂、颗粒、栓剂及经皮贴片剂。制备此等剂型之方法为已知的(例如，参见，H. C. Ansel及
9N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第 5 版，Lea 及Febiger (1990))。治疗有效量可由熟习此项技术者基于诸如体重、代谢及疾患严重性等 因素来确定。活性化合物优选以每公斤体重每日约Img至约500mg来给药。活性化合物更 优选以每公斤体重每日约Img至约IOOmg来给药。化合物可单独或与佐剂组合投与，所述佐剂增强抑制剂之稳定性，促进在某些实 施例中含有其之药物组合物的投与，提供增强之溶解或分散，提高抑制活性，提供辅助疗 法，及其类似情况。有利地，此等组合可利用较低剂量之活性成份，由此降低可能之毒性及 不利副作用。与根据本发明之化合物一起使用的可药用载剂及佐剂包括(例如)离子交换剂、 氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、缓冲物质、水、盐或电解质及基于纤维素之物质。此并 非可能之可药用载剂及佐剂的完整清单，且一般技术者知道其它可能性，其在此项技术中 为充分的。总之，本发明描述藉由异源表达MimclSc、Slyl或SM蛋白家族之其它成员及其组 合来增强在真核细胞中蛋白之分泌性转运的新颖方法。此方法尤其适用于以增强之制造能 力产生最优化宿主细胞系统以便表达及制造重组蛋白产物。Secl/Muncl8(SM)蛋白为在细胞内蛋白转运中膜融合所需的，但已长期提出其作 用之性质为不同而非统一的，其部分系因为在SM蛋白与SNARE之间相互作用之非均质性。 在本发明中，我们评估两种SM蛋白对分泌途径之生理影响。基本发现在于在小泡融合至细 胞膜及高尔基体中涉及之Muncl8c及Slyl —致地刺激总体胞吐作用。与此模型一致，我们展示当敲低Slyl及MimclSc时，总体胞吐作用降低(图3)。 相反地，藉由过度表达造成的增加水平之Slyl提高分泌能力(图4)。重要及令人惊讶地， MimclSc亦显著刺激宿主细胞之分泌能力。为支持此，我们论证MimclSc系与为融合至 PM (细胞膜)而特异性化之SNARE复合物直接结合(图5)。先前研究指定Muncl8c在胞吐作用中之抑制作用(Riento等人，2000 ；Kanda等 人，2005 ；Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)，其与本发明之结果相抵触。为提供 MunclSc在转运机制中之作用，详言之其与由突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2组成之胞 吐SNARE蛋白之相互作用的分子理解，我们报道免疫沉淀实验。如图5中所示，MimclSc-特 异性抗体定量地使Muncl8c连同显著量之突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2 一起沉淀，表 明Muncl8c与此等SNARE之活体内缔合，其促进在分泌途径中的小泡-细胞器融合(Peng 及GallwitZ，2002 ；Shen等人，2007 ；Scott等人，2004)。此发现强调类似于与完全组装之 SNARE复合物结合且促进融合高尔基体之Slyl,MimclSc亦与SNARE复合物直接相互作用， 提示藉由促进SNARE介导之转运机制之保守作用机制。因此，Slyl及Muncl8c功能之生理学作用及机制在SNARE介导分泌途径中均为保 守的。当Slyl、Munc 18c及通用细胞器扩增因子Xbp-I过度表达时，基于SM蛋白之分泌 工程增强多种蛋白之胞吐作用，所述蛋白包括酶、生长激素及免疫治疗单克隆抗体。本申请案之数据论证一旦在相同细胞内两种SM蛋白同时过度表达即对蛋白分泌 有附加或甚至协同之效应，如为MimclSc及Slyl所示。我们的数据因此支持SM蛋白在刺 激SNARE介导转运机制中之统一功能的模型且表示用于增强分泌之转译后工程化的新颖策略。总之，在本申请案中，我们提供SM蛋白在胞吐/分泌途径中之统一活化作用的第 一个惊人证据。基于此发现，我们开创了基于SM蛋白之转译后工程化，藉由其成功达成增 强之胞吐作用。有效产生蛋白治疗剂对生物技术工业仍为大挑战。迄今为止，已开发多种不同代 谢工程化策略。举例而言，藉由增大转录(转录工程化)；藉由调节哺乳动物细胞之转译效 能(转译工程化)；藉由提高特异性糖型(glycoform)之产量(糖基化工程化)；藉由仅将 代谢能复位向至产物形成(受控增殖技术)及藉由改良生产细胞株之活力(抗细胞凋亡 工程化)。然而，基于和谐配合之(orchestrated)分泌机构的代谢工程仍为难懂的。基于 Slyl及MimclSc —致地刺激总体胞吐作用之发现，在本文中我们首次报道引起哺乳动物细 胞之分泌能力增强的基于SM蛋白之转译后工程化。该系统系与所用启动子之表达组态、类 型及启动子介导转录量无关，使得其尤其适于工业制造重组蛋白及医药。本发明另外提供藉由干扰SM蛋白表达来抑制或降低蛋白胞吐作用之手段。此将 为治疗癌症或发炎病况提供适用手段。先前已描述，在真核细胞中，膜结合转运小泡使蛋白及脂质在亚细胞区室/细胞 器之间穿梭。在各转运步骤，自小泡及目标膜之SNARE [可溶性NSF (N-乙基马来酰亚胺敏感 因子)附接受体]蛋白均形成反式SNARE复合物，其构成发生融合所需之核心机构。为满 足在各种情况下之生理需求，SNARE介导融合机构必须在空间上暂时地可调以自待适当整 合之细胞内及细胞外来源均获得刺激。因此，关键在于活体内调节或微调SNARE功能以使 膜融合之特异性及速度均不受损。Secl/MimclS (SM)蛋白可为调节SNARE蛋白之关键。首 先在酵母及线虫中识别之SM蛋白为融合所必需。除SNARE外几乎不存在相互作用搭配物 之事实已得出SM蛋白系与SNARE蛋白功能偶联之普遍观点(Gallwitz及Jahn，2003 Jahn 等人，2003 ；Toonen及Verhage，2003)。然而，推广SM蛋白之功能模型的尝试已显著地受阻 于其与SNARE相互作用之异质性质。在独特转运步骤且在不同生物体中，单体突触融合蛋 白(Dulubova 等人，1999 ；Yang 等人，2000 ；Peng 及 GalIwitz，2002)、小泡相关 SNARE (Li 等 人，2005 ；Carpp 等人，2006 ；Peng 及 Gallwitz ；2004 ;Shen 等人，2007)、异二聚体 t-SNARE 复合物(Scott等人，2004 ;Zilly等人，2006)以及三元完全组装之SNARE复合物(Carpp等 人，2006 ；Peng 及 Gallwitz ；2004 ；Shen 等人，2007 ；Togneri 等人，2006 ；Carr 等人，1999 ； Dulubova等人，2007)已展示易于与个别SM蛋白结合。因此，已为膜融合中之SM蛋白功能 以正面及负面观点解释了此等相互作用之生理学意义。因此，分子机制，尤其SM蛋白在分泌途径中之生理作用仍为未知的。举例而言， Slyl系与单体突触融合蛋白5、单体小泡结合SNARE及完全组装之SNARE复合物相互作用 (Li等人，2005 ；Peng及Gallwitz ；2004)，且已展示正面影响形成SNARE复合物及融合特异 性(Peng 及 Gallwitz, 2002 ；Kosodo 等人，2002)。另一方面，先前研究指定MimclS蛋白在膜融合及胞吐作用中之抑制作用突触小 泡之经调节胞吐作用尤其需要之神经元特异性MimclSa呈现两种与SNARE相互作用之功 能对立藉由与突触融合蛋白1之封闭构形结合，由此抑制SNARE复合物组装(Dulubova 等人，1999 ；Yang等人，2000)，且与完全组装之SNARE复合物结合，因此促进膜融合(Shen 等人，2007 ；Dulubova等人，2007)。一致地，报道了 MunC18a对胞吐作用之抑制及促进作用(Wu 等人，1998 ；Verhage 等人，2000 ；Voets 等人，2001)。Munc 18b 及 Munc 18c 在序列上 与MunC18a同源但无所不在地表达。活体外数据表明Muncl8c在SNARE结合方面类似于 Muncl8a(Latham等人，2006 ；D' Andrea-Merrins等人，2007)，且两种蛋白之结构为保守的 (Misura等人，2000 ；Hu等人，2007)。然而，遗传学及生理学研究迄今为止已提供Muncl8b 及Muncl8c在胞吐作用中之抑制作用的专有证据(Riento等人，2000 ；Kanda等人，2005 ； Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)。举例而言，1)蝇类中Muncl8a之过度表达抑制神 经元传输(Wu等人，1998)，2)在Caco-2细胞中Muncl8b之过度表达抑制流感病毒血球凝集 素之顶端传递(apical delivery) (Riento等人，2000)，3)Muncl8c对突触融合蛋白4与对 VAMP2竞争结合(Thurmond等人，1998) ；4)在脂肪细胞中经胰岛素刺激GLUT小泡之易位系 受Muncl8c过度表达抑制但在无Muncl8c小鼠中增强(Tellam等人，1997 ；Thurmond等人， 1998)。与此等报道相反且与主导预想不同，在本申请案中，我们藉由证明两种蛋白通常 同等刺激胞吐作用来论证两种SM蛋白slyl及Muncl8c之新颖及惊人之作用。藉由Muncl8c 及Slyl之活化作用的分子机制可能亦为保守的。基于此等惊人发现，我们开创了在哺乳动 物细胞中产生增强之分泌的基于SM蛋白之分泌工程化。基于SM蛋白之分泌工程化表示代 谢工程之新颖策略且为在工业中生产蛋白医药提供新颖平台。详言之，Slyl及MimclSc表达对哺乳动物细胞分泌能力之正面作用指出一种将增 大分泌之哺乳动物生产细胞株工程化之新颖转译后方法。在实施例5中说明slyl与munC18C同时过度表达引起SEAP产量增大8倍，相比 之下，藉由单独之slyl或munC18C增大5倍。SAMY及VEGF121之分泌亦增大(图4b、4c)。 slyl、muncl8c及xbp-1全部之过度表达将SEAP、SAMY及VEGF之分泌分别增大10倍、12倍 及8倍(图4a、4b、4c)，明显地说明在Slyl与Munc 18c之间及在两种SM蛋白与通用细胞器 扩增因子Xbp-I之间对分泌存在协同效应。在实施例6中进一步说明，藉由产生为slyl (CHO-Slyl16及CHO-Slyl23)或 munc 18c (CHO-Munc 18c8及CH0_Muncl8c9)之组成型表达而工程化的稳定CH0-K1衍生细胞 株，CHO-Slyl16及CHO-Slyl23刺激SEAP分泌增加4倍及8倍(图6a)及SAMY产量提高4倍 及5倍(图6b)。有趣地，产生较多SEAP之CHO-Slyl23亦展示较高Slyl水平，表明SM与产 物蛋白之正相关性(图6c)。类似地，为组成型mimclSc表达转基因之细胞(CHO-MuncISc9) 产生多9倍及6. 5倍之SEAP及SAMY(图6e及6f)且产生更多SEAP之CH0_Muncl89亦展 示较高Muncl8c水平(图6d)。与亲本CHO-Kl相比，稳定细胞株CH0-Slyl-Muncl8ci (为 组成型Slyl及Muncl8c表达之双转基因)及CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp_l7 (为组成型Slyl、 Munc 18c及Xbp-I表达之三转基因)展示高13倍及16倍之SEAP产量(图6g)。具体地，基于SM蛋白之分泌工程化提高生产细胞株之抗体的比生产率。实施 例7藉由在原型生物药生产方案中使用基于SM蛋白之分泌工程化以在CHO-Slyl16及 CHO-Slyl23中(增大至多10倍)、在CH0-Slyl-Muncl8ci中(增大至多15倍)及在 CHO-Slyl-Xbp-I4 中(增大至多 13 倍)及在 CH0-Slyl-Muncl8c_Xbp-l7 中(增大至多 19 倍)表达称为利妥昔单抗(Rituximab)之单克隆抗人类⑶20 IgGl来说明此(图7a)。当 在CH0-Slyl-MunC18C-Xbp-l7中产生利妥昔单抗时，可达到至多40pg/细胞/天之特别制 造水平，与同基因对照细胞株相比，其对应于增大接近20倍(图7a)。SDS-PAGE分析表明藉由CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17&野生型CHO-Kl细胞产生之抗体为结构完整的且彼此不 可区分(图7b、7c)。自在CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中产生之利妥昔单抗的N-连接Fc寡 糖之基于Maldi-TOF之糖基化概况分析(Glycoprofiling)揭示与原生生产细胞株相比无 差异，表明基于SM/Xbp-Ι之分泌工程化并不损害产物质量(图7d及7e)。


图 1Slyl及Muncl8在HEK-293中之表达及定位。(a)及(b)将肌动蛋白用作内源对 照物对slyl (a)及mimclS (b)转录物进行基于RT-PCR之侦测。将I-Kb序列梯用作分子 量标准。(c)Muncl8a/b/c之Western印迹。(d)共焦显微照片显示Slyl及Muncl8c在经 YFP-Munc 18c (pRP23)力 Π CFP-突触融合蛋白 4(Stx4，pRP29)组合或 YFP-Slyl (pRP32)加 CFP-突触融合蛋白5 (Stx5,pRP40)组合转柒的HEK-293中的亚细胞定位。箭头表示Slyl与 突触融合蛋白5 (上图)或MimclSc与突触融合蛋白4 (下图)之共定位(colocalization)。图 2基于shRNA而敲低slyl及Muncl8c。(a)图示编码双顺反子slyl/GFP的表达载 体PRP3，其用作不同的slyl特异性shRNA的slyl特异性敲低报道构建体。(b)荧光显微照 片显示经pRP3及编码shRNA的不同表达载体共转染、且培养48h的CHO-Kl。(c)图示编码 双顺反子Muncl8c/GFP的表达载体pRP4，其用作不同的Muncl8c特异性shRNA的Muncl8c 特异性敲低报道构建体。(d)荧光显微照片显示经pRP4及编码shRNA的不同表达载体共转 染、且培养48h的HEK-293。图 3基于shRNA而敲低slyl及muncl8c导致降低总体胞吐作用。(a)HEK_293的Slyl 特异性Western印迹，所述细胞被靶向slyl的shRNA表达载体(ShRNAslyl 1/2/3 ；pRP5_7)转 染。将亲本载体pmU6、对照物shRNA及p27Kipl用作对照物。(b)HEK-293的SEAP表达概 况，所述细胞被PSEAP2-对照物及不同的ShRNAslyl表达载体共转染(48h)。(c) HEK-293的 Munc 18c特异性Western印迹，所述细胞被靶向muncl8c的shRNA表达载体(shRNA_cl8 cl/2/3 ；PRP12,14，38，39)转染。(d) HEK-293的SEAP表达概况，所述细胞被pSEAP2_对照物 及不同的shRNA_。18表达载体共转染。图 4Slyl及Muncl8c的异位表达在转录后阶段提高CHO-Kl的蛋白产量。(a_c) CHO-Kl之生产概况，所述细胞被SEAP(pSEAPl-对照物)(a)、SAMY (pSS 158) (b)或 VEGF121 (pffff276) (c)生产型载体及(不同组合的)编码 Slyl (pRP24)、Muncl8c (pRP17)及 Xbp-I (pcDNA3. 1-Xbp-1)的表达载体共转染。(d)在有或无SM蛋白表达时，产物mRNA水平 基于定量RT-PCR的概况分析(profiling)。图 5Munc 18c与胞吐的SNARE复合物的相互作用。用亲和纯化的、蛋白A-S印harose-偶 联的抗Muncl8c抗体使HEK-293溶胞物免疫沉淀之后，对Muncl8c、突触融合蛋白4、 SNAP-23及VAMP2/突触泡蛋白(synaptobrevin) 2 (Sybil)进行Western印迹分析。用未沉 淀的蛋白(上清)及Slyl作对照物。
图 6基于SM蛋白的分泌工程化提高了异源蛋白在CHO-KI衍生之细胞株中的产量。(a) 稳定混合并克隆化的CHO-Kl衍生群体的SEAP产量，所述细胞是Slyl及SEAP组成型表达 (CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 及 CHO-SlyligJ 的转基因体，且已培养 48h。(b)经 pSS158 瞬 时转染的 CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 及 CHO-Slyl 混合的 SAMY 产量。(c) CH0-K1、CHO-SlyI16 及 CHO-Slyl23 的 Slyl 特异性 Western 印迹，以 p27Kipl 作为负载对照物(loading control)。 (d)CHO-Kl、CHO-Munc 18c8 及 CHO-Munc 18c9 的 Muncl8c 特异性 Western 印迹，p27Kipl 作为 负载对照物。(e)稳定混合并克隆化的CH0-K1衍生群体的SEAP产量，所述细胞为MunclSc 及SEAP组成型表达的转基因体(CH0-Muncl8c8、CHO-Munc 18c9及CHO-Munc 18cs纟)，并已 培养 4他。(f)经 pSSl58 瞬时转染的 CH0-Muncl8c8、CHO-Munc 18c9 及 CHO-Muncl8 .混合的 SAMY产量。(g)稳定细胞克隆培养48h之后的SEAP生产概况，所述细胞组成型表达Slyl 及 Muncl8c(CH0-Slyl-Muncl8Cl)、Slyl 及 Xbp-I (CHO-Slyl-Xbpl4)及 Slyl、Munc 18c 以及 Xbp-I (CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17)。图 7在分泌工程化CH0-K1衍生物中产生的利妥昔单抗的产量及糖基化概况分析。 (a)不同的分泌工程化CH0-K1衍生物的利妥昔单抗比生产率。基于SM蛋白的代谢工程 化使人IgGl的分泌增加。(b、c)从CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17及CH0-K1细胞纯化的利 妥昔单抗经非还原型(b)和还原型(c) SDS-PAGE来分析。图中示出了标准蛋白和IgGl重 链及轻链(HC、LC)的分子量(KDa)。(d、e)基于MALDI-T0F分析在CH0-K1及分泌工程化 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中产生的利妥昔单抗的糖基化概况。图 8表达构建体的示意图编码至少一种目标蛋白(GOI)及一种SM蛋白的载体，所述蛋白由不同的表达单元 (a)或由单个双顺反子单元(b)编码。包含两种SM蛋白的基因的表达载体，所述蛋白由不同的表达盒(C)编码，或者两 个基因通过IRES组件相连以双顺反子方式来编码蛋白(d)。由单个多顺反子表达单元编码至少两种SM蛋白及一个目标基因(e)或多种SM蛋 白的表达载体。图 9SM蛋白增强人类细胞的HRP分泌测量人HT1080细胞上清中的HRP活性，所述细胞用分泌型辣根过氧化物酶 (ssHRP)及空载体(Mock，黑条)、Muncl8c (灰条)、Slyl (阴影条)或编码Munc 18c和Slyl 的双顺反子构建体(Munc-IRES-Sly，横纹条)共转染。相对于设定为1.0之Mock对照物， 绘制转染后24h及48h测量的相对ssHRP滴度以及比生产率的图形。这些值对应于三份试 样的平均值，误差条=SEM。图 10SM蛋白在IgG生产细胞株中的过表达提高比生产率及最终IgG滴度(A)稳定表达空载体(Mock)或 Sly-I (Slyl)、Munc_18c (Munc)或两种 SM 蛋 白(Mimc/Slyl)的表达构建体的细胞的IgGl相对比生产率。所述生产率根据补料分批
14(fed-batch)生产过程期间的滴度及活细胞计数来计算。这些柱图代表η = 2 (Mock)至η =6个单克隆转基因IgG生产细胞株的平均值，且相对于设定为100%之Mock细胞中的比 生产率来描绘。(B)历经9天补料分批发酵过程稳定地表达所述构建体的稳定细胞群的IgG滴度。实施方式一般实施例"包含"涵盖更特定之实施例"由…组成"。另外，单数及复数形式 并非以限制方式使用。在本发明期间所用之术语具有以下含义。术语〃基因“意谓脱氧核酸(DNA)序列(例如，cDNA、基因组DNA或mRNA)。在本 发明中，基因优选系指人类DNA序列，但包括自其它哺乳动物物种(优选为小鼠、仓鼠及大 鼠)之同等同源序列，以及自额外真核物种(包括鸡、鸭、苔藓、蠕虫、蝇及酵母)之同源序 列。集合术语"Secl/Munc-18蛋白〃或"SM蛋白〃或"Secl/Muncl8蛋白群" 或〃 SM-蛋白"或"编码SM-蛋白之基因"或"SM家族"包含60-70kDa之亲水性蛋白之 家族，其具有高的结构相似性程度且自酵母至人类保守进化。Munc 18及Slyl两者均属于Secl/Muncl8蛋白家族。此家族迄今进一步包括在酵母中Seclp、Slylp、Vps33p及 Vps45p在果蝇中R0P、Slyl及Vps33/康乃馨在线虫中Unc-18以及5种其它根据基因组序列数据库之基因在脊椎动物中Muncl8-l、Munc18-2 及 Munc 18-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl。术语SM-蛋白亦涵盖此等蛋白之衍生物、突变体及片段，例如带flag-卷标、带 HIS-卷标或带另外卷标之SM-蛋白。频繁地将此等衍生物例如用于蛋白之简易纯化或分离 或观测。SM蛋白展示在整个序列上之高同源性，表明其可能具有类似整体结构。另外，已为 四个物种中九种SM基因描述了功能丧失突变，其均引起小泡转运及融合之严重损伤，表明 SM蛋白在小泡转运及分泌之过程中起到类似及重要之作用。本发明之实施例使用MimclS及Slyl作为模型蛋白，然而，本发明可同样转移至SM 蛋白家族之其它成员。另外，鉴于跨物种之高保守程度，SM蛋白可用以调节在所有真核宿主细胞物种 (自酵母历经蠕虫及昆虫细胞至哺乳动物系统)中蛋白之分泌及细胞表面表达。在真核细胞中，膜结合转运小泡使蛋白及脂质在亚细胞区室/细胞器之间穿梭。 细胞转运小泡与细胞膜或与目标区室(诸如溶酶体、高尔基复合体或细胞膜)之融合系由 SNARE[可溶性NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感因子)附接受体]蛋白介导。为满足细胞之生 理需求且保持区室特异性膜组成，藉由SeCl/MimC18(SM)家族之小蛋白来在空间上暂时地 控制SNARE介导之融合机构。藉由与SNARE及突触融合蛋白直接结合，SM蛋白调节在细胞 内区室/细胞器与细胞膜之间小泡介导转运之所有步骤。术语〃 Munc-18"或〃 Munc-18蛋白〃或〃 Munc-18蛋白家族〃包括存在于真核 生物体中之所有Munc-18基因及基因产物/蛋白。此清楚地包括三种Munc-18旁系同源物(paralog)，亦即 Munc_18a (其亦称为“Munc-18-l “ )、Munc_18b 及 Munc_18c，其已在脊椎 动物中进化。更具体地，术语"Mimc-ISc"系指人类基因及亦称为"突触融合蛋白结合蛋 白3" (STXBP3)或〃血小板Secl蛋白〃 (PSP) (SEQ-ID NO 39)之蛋白Muncl8c，包括在其 它哺乳动物物种(包括小鼠、仓鼠、大鼠、狗及兔)中之其同源物。术语"Sly-I"或"Sly-I蛋白"系指所有自脊椎动物(优选为哺乳动物)中 此等基因表达之Slyl基因及蛋白。更具体地，“Sly-I"系指人类Slyl蛋白，亦称 为"含有Secl家族结构域之蛋白1" (SCFDl)或"突触融合蛋白结合蛋白_1状蛋白 2“ (STXBP1L2)，SEQ-ID NO. 41 术语〃 XBP-1"同样系指XBP-IDNA序列及所有自此基因表达之蛋白，包括XBP-I 拼接变异体。优选地，XBP-I系指人类XBP-I序列且优选系指XBP-I之拼接及活性形式，亦 称为"XBP-1"。已知转录因子XBP-I为分泌细胞分化以及维持ER稳态及扩增之关键调节 子之一(Lee，2005 ；Iwakoshi，2003)。此等功能使得XBP-1为用于分泌工程方法之候选物。更具体地，“XBP-I〃系指人类 XBP-I 蛋白，SEQ-ID NO. 43。术语"生产率"或"比生产率"描述藉由限定数目之细胞在限定时间内产生之 特异性蛋白之量。比生产率因此为细胞表达/合成/产生目标蛋白的能力之定量量度。 在工业制造中，通常将比生产率表示为每细胞及每天所产生之以皮克(‘Pg/细胞*天' 或'PCd')计的蛋白之量。测定所分泌蛋白之"比生产率"的一种方法为藉由酶联免疫吸附试验(ELISA) 来定量测量分泌至培养基中的目标蛋白之量。出于此目的，将细胞以限定密度接种至新鲜 培养基中。在限定时间之后，例如在24小时、48小时或72小时之后，对细胞培养液取样且 使其经受ELISA测量以测定目标蛋白的滴度。可藉由将滴度除以平均细胞数目及时间来测 定比生产率。藉由均勻时间解析荧光(HTRF )试验来提供如何测量细胞〃比生产率〃之另一 实例。对于细胞内、膜相关或跨膜蛋白而言之细胞的"生产率"亦可藉由Western印迹 法来侦测且定量。将细胞首先洗涤且随后溶解于含有诸如Triton-X、NP-40或SDS之清洁 剂或高盐浓度之缓冲液中。接着将细胞溶胞物中之蛋白藉由在SDS-PAGE上以尺寸分离，转 移至耐纶膜，其中目标蛋白随后藉由使用特异性抗体来侦测及观测。测定细胞之"比生产率"之另一方法为藉由针对目标蛋白而提出之荧光标记抗 体来免疫侦测目标蛋白且在流式细胞仪中定量荧光信号。在细胞内蛋白之情况下，首先将 细胞固定于中例如三聚甲醛(paraformaldehyde)缓冲液中，且接着渗透以允许侦测抗体 穿透至细胞中。可在无需事先固定或渗透的情况下对活细胞定量细胞表面蛋白。细胞之"生产率"可另外藉由测量诸如绿荧光蛋白(GFP)之报道蛋白的表达来 间接测定，该绿荧光蛋白系表达为具有目标蛋白之融合蛋白或来自与目标蛋白相同之mRNA 作为二表达单元、三表达单元或多表达单元之部分。术语"提高/增加生产率"包含增加/提高细胞之比生产率的方法。若生产率在 所研究之细胞中较之各别对照细胞更高且若此差异为统计上显著的，则比生产率增加或提 高。所研究之细胞可为经处理、转染或基因修饰之细胞的非均质群体或克隆化细胞株；未经 处理、未经转染或未经修饰之细胞可充当对照细胞。在所分泌之目标蛋白的情形中，术语"
16提高/增加/改良之生产率"及"增强/提高/改良之胞吐作用"及"提高/增加/改良 之分泌"具有相同含义且可互换使用。术语"衍生物"通常包括适于实现本发明之预定用途的序列，其意谓所述序列介 导细胞中分泌性转运之提高。术语"衍生物"当用于本发明中时意谓在序列中与原始序列或其互补序列至少 70% —致之多肽分子或核酸分子。多肽分子或核酸分子优选在序列中与原始序列或其互补 序列至少80%—致。多肽分子或核酸分子更优选在序列中与原始序列或其互补序列至少 90%—致。最优选为在序列中与原始序列或其互补序列至少95%—致且显示与原始序列相 同或类似之对分泌之影响的多肽分子或核酸分子。序列差异可基于自不同生物体之同源序列的差异。其亦可能基于藉由取代、插入 或缺失一或多个核苷酸或氨基酸(优选1、2、3、4、5、7、8、9或10个)之序列的目标修饰。可 使用位点特异性突变及/或基于PCR之突变技术来制造缺失、插入或取代突变体。可藉由 使用(例如)标准"对准"算法，例如"BLAST"来测定参考序列之序列一致性。当其在其 序列中配合在一起时，序列对准，且可借助于标准"对准"算法来识别。另外，在本发明中，术语"衍生物"意谓与其它核酸序列杂交之核酸分子(单股 或双链)。杂交优选在严格杂交及洗涤条件下进行(例如在65°C下在含有5xSSC之缓冲液 中杂交；在42 °C下使用0，2XSSC/0，1% SDS洗涤)。术语"衍生物"另外意谓尤其在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位置处蛋白缺失及/或 插入突变体、磷酸化突变体，及带有蛋白激酶C(PKC)或酪蛋白激酶II (CKII)之结合位点缺 失的突变体。术语"活性"描述且定量在细胞内或在活体外试验中蛋白之生物学功能。测量SM蛋白"活性"之一种试验为例如用于模型蛋白、抗体或目标蛋白的分泌 试验。将细胞以ss-HRP-Flag质粒连同空载体或所研究之基因(诸如Munc-18c或Sly-I) 一起共转染。转染后24h以无血清培养基洗涤细胞且在0、1、3及6h之后藉由一起培育澄 清细胞上清与ECL试剂对HRP分泌定量。以光度计(Lucy2，Anthos)在450nm下进行测量。侦测就SM蛋白之功能结合而言之"活性"的另一方法将展示SM蛋白与其已知相 互作用搭配物之结合，例如Mimc-ISc与突触融合蛋白_4之结合或Slyl与突触融合蛋白_5 之物理相互作用。SM蛋白与其它蛋白之结合可藉由免疫共沉淀来证明，例如使用与珠粒偶 联之特异性抗体使SM蛋白下沈(pull-down)，珠粒变性及之后藉由SDS-PAGE及Western印 迹之免疫共沉淀蛋白之分离及侦测。SM蛋白与另一蛋白(例如，突触融合蛋白)之直接结合可进一步在酵母_二-杂 交(yeast-two-hybrid)试验中侦测。在此试验中，两种蛋白在酵母细胞中以分别与转录因 子之DNA结合域及转录活化域之融合蛋白的形式表达。两种蛋白之直接相互作用均引起转 录因子重构，该转录因子之活性系以比色方式或藉由酵母细胞在选择性条件下生长之能力 来侦测。藉由SM蛋白与其结合搭配物之共免疫荧光法(co-immunof luorescence)及侦测 其在细胞内之共定位来提供另一间接方法。测量XBP-I之〃活性〃的一种方法为进行带移实验以侦测XBP-I转录因子与其 DNA结合位点之结合。另一方法为侦测活性XBP-I拼接变异体自细胞溶质至核之易位。或
17者，XBP-I “活性"可藉由测量真正(bona fide)XBP-I目标基因(诸如结合蛋白(BiP))之 一旦XBP-I异源表达后的诱导表达来间接证实。在本发明之含义中〃宿主细胞〃为诸如仓鼠细胞之细胞，优选为BHK21、BHK TK_、 CHO、CHO Pro-5、CHO 衍生之突变细胞株 Lecl 至 Lec35、CHO-KU CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl 及 CH0-DG44细胞或此等细胞株中任一者之衍生物/后代。尤其优选为CH0-DG44、CH0-DUKX、 CHO-Kl及BHK21，且甚至更优选为CH0-DG44及CHO-DUKX细胞。在本发明之另一实施例中， 宿主细胞亦意谓鼠类骨髓瘤细胞，优选为NSO及Sp2/0细胞或此等细胞株中任一者之衍生 物/后代。亦将可用于本发明含义中之鼠类及仓鼠细胞之实例概括于表1中。然而，所述 细胞、其它哺乳动物细胞(包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、猴及啮齿动物细胞株，或真 核细胞，包括(但不限于)酵母、昆虫、植物及禽类细胞)之衍生物/后代亦可以本发明之 含义使用，尤其对于制造生物药蛋白而言。表1 真核生物生产细胞株 宿主细胞当在无血清条件下建立、适应且完全培养，且任选地在不含动物来源之 任何蛋白/肽之培养基中时为最佳。市售培养基，诸如Ham' sF12 (Sigma, Deisenhofen, Germany)、RPMI-1640 (Sigma)、Dulbecco 改质之 Eagle 培养基(Dulbecco ‘ s Modified Eagle ‘ s Medium，DMEM ;Sigma)、最低必需培养基(Minimal Essential Medium, MEM ； Sigma)、Iscove 改质之 Dulbecco 培养基(Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium, IMDM ；Sigma)、CD-CH0 (Invitrogen，Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen、无血清 CHO 培养基 (Sigma)及无蛋白CHO培养基(Sigma)为例示性适当营养溶液。必要时任何培养基均可补 充有多种化合物，其实例为激素及/或其它生长因子(诸如，胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因 子、胰岛素样生长因子)、盐(诸如，氯化钠、磷酸钙、磷酸镁)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷 (诸如，腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等效能源、抗生素、微量元素。亦可包括熟习 此项技术者已知之适当浓度的任何其它必要补充剂。在本发明中，优选使用无血清培养基， 但补充有合适量血清之培养基亦可用于培养宿主细胞。对于表达可选基因之经基因修饰之 细胞的生长及选择而言，将合适选择剂添加至培养基中。术语"蛋白"可与氨基酸残基序列或多肽互换使用且系指任何长度之氨基酸的 聚合物。此等术语亦包括经由包括(但不限于)糖基化、乙酰化、磷酸化之反应或蛋白处理 而经转译后修饰之蛋白。在分子保持其生物学功能活性之同时，可在多肽结构中产生修饰 及改变(例如与其它蛋白融合)、氨基酸序列取代、缺失或插入。举例而言，可在多肽或其基 本核酸编码序列中产生某些氨基酸序列取代且可获得具有类似特性之蛋白。术语"多肽"意谓具有10个以上氨基酸之序列且术语"肽"意谓至多10个氨基 酸长度之序列。本发明适于产生用于制造生物药多肽/蛋白之宿主细胞。本发明尤其适于藉由展示增强之细胞生产率的细胞使大量不同之目标基因高产率表达。“目标基因"(GOI)、“所选序列"或"产物基因"在本文中具有相同含义且系 指编码目标产物或"目标蛋白"(亦称为"所需产物")的任何长度之多核苷酸序列。所 选序列可为全长或截短基因、融合或带标签基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段，优选 为cDNA。其可为原生序列，亦即天然存在之形式，或必要时可经突变或另外经修饰。此等修 饰包括密码子优化以便优化密码子在所选宿主细胞中、在人源化过程中或在标记过程中的 利用情况。所选序列可编码分泌型、胞质型、核型、膜结合型或细胞表面型多肽。“目标蛋白"包括蛋白、多肽、其片段、肽，其所有均可在所选宿主细胞中表达。所 需蛋白可为(例如)抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段，及可 充当激动剂或拮抗剂及/或具有治疗或诊断用途之任何其它多肽。下文亦给出所需蛋白/ 多肽之实例。在诸如单克隆抗体等较复杂分子之情况下，GOI编码两个抗体链中之一或两者。“目标产物〃亦可为反义RNA、siRNA,RNAi或shRNA。“目标蛋白"或"所需蛋白"为上述者。具体地，所需蛋白/多肽或目标蛋白例 如为(但不限于)胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子(诸如介白素(IL)，例如 IL-UIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-14、 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(IFN) α、IFNβ、IFNy、IFNco 或 IFNt、肿瘤坏死因 子(TNF)，诸如 TNF α 及 TNF β、TNF γ、TRAIL ；G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-I 及 VEGF。亦包 括制造红细胞生成素或任何其它激素生长因子。根据本发明之方法亦可有利地用于制造抗 体或其片段。此等片段包括(例如)Fab片段(片段抗原-结合=Fab)。Fab片段系由藉 由相邻恒定区保持在一起之两个链的可变区组成。此等者可藉由自习知抗体例如以木瓜酶 进行蛋白酶消化来形成，但在同时藉由基因工程亦可产生类似Fab片段。其它抗体片段包 括F(ab' )2片段，其可藉由用胃蛋白酶之蛋白水解来制备。目标蛋白优选系自培养基中以分泌之多肽的形式回收，或若在无分泌信号情况下 表达则其可自宿主细胞溶胞物中回收。有必要以获得目标蛋白的大体上均勻制剂之方式自 其它重组蛋白及宿主细胞蛋白纯化目标蛋白。作为第一步，自培养基或溶解物移除细胞及 /或微粒细胞碎片。此后例如藉由免疫亲和或离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、 Sephadex层析、硅层析或诸如DEAE之阳离子交换树脂层析将目标产物从污染的可溶性蛋 白、多肽及核酸中纯化。一般而言，在此项技术中熟知教示熟习此项技术者如何纯化由宿主 细胞异源表达之蛋白的方法。使用基因工程方法，可能产生仅由重链之可变区(VH)及轻链之可变区(VL)组成 的缩短抗体片段。将此等者称为Fv片段(可变片段(Fragmentvariable)=可变部分之片 段)。因为此等Fv片段缺乏两个链藉由恒定链之半胱氨酸的共价键结，所以Fv片段经常为 稳定的。有利的在于藉由短肽片段(例如，具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸)连 接重链之可变区与轻链之可变区。以此方式，获得由藉由肽连接子连接之VH及VL组成的 单一肽链。将此类抗体蛋白称为单链-Fv(ScFv)。自先前技术已知此类scFv-抗体蛋白之 实例。近年来，已开发各种策略用以制备呈多聚体衍生物之scFv。此尤其意欲产生具有 改良之药物动力学及生物分布特性以及具有提高之结合亲和力的重组抗体。为达成scFv
20之多聚化，将scFv制备为具有多聚化结构域之融合蛋白。多聚化结构域可为(例如)IgG 或卷曲螺旋结构(螺线结构)(诸如亮氨酸_拉链域(Leucin-zippeer domain))之CH3 区域。然而，亦存在将scFv之VH/VL区域之间的相互作用用于多聚化(例如，双功能抗体 (diabodies)、三功能抗体(tribodies)及五功能抗体(pentabodies))之策略。对于熟习 此项技术者而言双功能抗体意谓二价均二聚scFv衍生物。将scFv分子中之连接子缩短至 5-10个氨基酸使得形成内部产生链间VH/VL迭加之均二聚体。双功能抗体可另外藉由并入 二硫桥(disulphide bridge)而稳定。自先前技术已知双功能抗体-抗体蛋白之实例。对于熟习此项技术者而言微型抗体意谓二价均二聚scFv衍生物。其系由融合蛋 白组成，该融合蛋白含有免疫球蛋白，优选IgG，最优选呈二聚化区域形式(其经由铰链区 (例如，亦自IgGl)及连接区域来连接至scFv)之IgGl的CH3区域。自先前技术已知微型 抗体-抗体蛋白之实例。对于熟习此项技术者而言三功能抗体意谓三价均三聚scFv衍生物。VH-VL在无 连接子序列之情况下直接融合之scFv衍生物使得形成三聚物。对于熟习此项技术者而言，“骨架蛋白"意谓藉由基因克隆或藉由共转译过程与 另一蛋白或具有另一功能之蛋白之部分偶联的蛋白之任何功能域。熟习此项技术者亦应熟悉具有二价、三价或四价结构且衍生自scFv之所谓微型 抗体。藉由二聚、三聚或四聚卷曲螺旋结构进行多聚化。据定义，即使所引入序列或基因与宿主细胞中之内源序列或基因一致，仍将任何 引入宿主细胞中之序列或基因相对于宿主细胞称作"异源序列"或"异源基因"或"转 基因"或"重组基因"。甚至当目标序列为内源序列，但序列已(人工地/有意地/实验地)被带进细胞中 且因此自不同于内源基因座之宿主基因组中之基因座表达时，将序列称作"异源序列"。甚至当目标序列(例如cDNA)为(人工地/有意地/实验地)再引入(=重组) 之内源序列且此序列之表达系受调节序列之改变/修饰(例如，启动子改变或藉由任何其 它手段)之影响时，将序列称作"异源序列"。“异源"蛋白因此为自异源序列表达之蛋白。可藉由使用"表达载体"，优选真核生物，且甚至更优选哺乳动物表达载体将异 源基因序列引入目标细胞中。用以构建载体之方法为熟习此项技术者所熟知且描述于各 种出版物中。详言之，在先前技术中已知用于构建合适载体之技术，包括描述功能组件， 诸如启动子、强化子、终止子(termination)及聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点及拼 接信号。载体可包括(但不限于)质粒载体、噬菌粒(Phagemid)、粘粒、人工/微型染色 体(例如ACE)或病毒载体，诸如杆状病毒(baculovirus)、反转录病毒、腺病毒、腺联病毒 (adeno-associated virus)、单纯疱疹病毒、反转录病毒、噬菌体。真核生物表达载体通常 亦将含有促进载体在细菌中繁殖(诸如复制起始)之原核序列及用于在细菌中选择之抗生 素抗性基因。在此项技术中熟知多种含有克隆位点(多核苷酸可有效连接至其中)之真核 生物表达载体，且一些可购自诸如 Stratagene, La Jolla, CA ；Invitrogen, Carlsbad, CA ； Promega, Madison, WI 或 BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA 之公司。在一优选实施例中，表达载体包含至少一种核酸序列，该核酸序列为编码目标肽/ 多肽/蛋白之核苷酸序列的转录及转译所必需之调节序列。
如本文中所用之术语"表达"系指异源核酸序列在宿主细胞中之转录及/或转 译。所需产物/目标蛋白在宿主细胞中之表达程度可取决于存在于细胞中之相应mRNA 之量，或藉由如在本发明实例中之所选序列编码的所需多肽/目标蛋白之量。举例而言， 自所选序列所转录之mRNA可藉由Northen印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA 之原位杂交或藉由PCR来定量。由所选序列编码之蛋白可藉由以下各种方法来定量例 如藉由ELISA、藉由Western印迹法、藉由放射免疫分析、藉由免疫沉淀、藉由检测蛋白之 生物活性、藉由将蛋白免疫染色，接着FACS分析或藉由均勻时间解析荧光(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)试验。在本发明中，术语"表达"同样系用于基因(意谓DNA序列)之情形中，以及DNA 序列所转译之蛋白产物之情形中。术语"基因"及"蛋白"因此在表达之情形中可互换使 用，例如"目标蛋白之表达"及"目标基因之表达"可互换使用且两个用语系指同一事实 问题。在本发明中，此等术语优选系指人类基因及蛋白，但包括来自其它哺乳动物物种(优 选为小鼠、仓鼠及大鼠)之同等同源序列，以及来自额外真核物种(包括鸡、鸭、苔藓、蠕虫、 蝇及酵母)之同源序列。如本文中所用之术语"实现"目标蛋白的表达或"实现"目标蛋白的分泌系指 正面影响该事件或引起该事件。如本文中所用之此等术语优选系指"增加表达"或"提高 分泌"。可藉由在此项技术中熟知之任何方法对真核宿主细胞进行以多核苷酸或表达载 体"转染"，从而产生经基因修饰之细胞或转基因细胞。转染方法包括(但不限于)脂质 粒介导转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(诸如DEAE-葡聚糖)介导转染、原生质体融 合、病毒感染及显微注射。转染优选为稳定转染。在特定宿主细胞株及细胞类型中提供异 源基因之最佳转染频率及表达的转染方法为有利的。可藉由常规程序确定合适方法。为了 稳定转染，将构建体整合至宿主细胞之基因组或人工染色体/微型染色体中或以游离方式 (episomally)定位以便稳定地保持在宿主细胞内。除非另作说明，否则本发明之实践将采用细胞生物学、分子生物学、细胞培养、免 疫学及在熟习此项技术者之技术中的类似学科之习知技术。在目前文献中充分揭示此等技 术。本发明系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码 SM-蛋白之基因的表达或各别蛋白或其至少一种衍生物、突变体或片段之活性，及b)实现 该目标异源蛋白的表达。本发明具体地系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一 种编码来自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，及b)实现该目标异源 蛋白的表达。在方法步骤b)中目标蛋白的分泌优选得以提高。本发明因此优选系关于在 细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种编码来自SEC1/Mimcl8蛋白群 (SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，及b)提高该目标异源蛋白的分泌。本发明优选系关于在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包含a)增加至少一种 编码选自SEC1/Muncl8蛋白群(SM-蛋白)之蛋白的基因之表达，该SEC1/Muncl8蛋白群系 由以下各物组成Seclp、Slylp、Vps33p 及 Vps45p、R0P、Slyl 及 Vps33/ 康乃馨、Unc-18、Muncl8_l、
22Munc 18-2 及 Munc 18-3、VPS45、VPS33-A、VPS33-B 及 Slyl，及b)实现该目标异源蛋白的表达，优选增加该目标异源蛋白的表达或尤其优选 其之分泌。步骤a)中之蛋白优选系选自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)，该群系由以下各物 组成Seclp、Slylp、Vps33p、Vps45p、Munc 18-1、Munc 18-2 及 Muncl8_3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl。步骤a)中之蛋白更优选系选自SEC1/Mimcl8蛋白群(SM-蛋白)，该群系由 Muncl8-l、Muncl8-2、Muncl8-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl 组成。步骤 a)中之蛋 白最优选系选自SEC1/Muncl8蛋白群(SM-蛋白)，该群系由Muncl8_3/Muncl8c及Sly-I组 成。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Mimc-18蛋 白或Mimc-18蛋白家族成员。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一 基因编码三种Muncl8同工型，Muncl8a、b或c中之一者，优选Muncl8c。在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码 Munc18c(SEQ ID NO 39)。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码Sly-I蛋白 或Sly-I蛋白家族成员，优选Sly-1。在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于步骤a)中之一基因编码 Sly-I(SEQ ID NO 41)。在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于步骤a)包含增加至少两种编码 SM-蛋白之基因的表达或活性，藉此所述SM蛋白系与小泡转运之两个不同步骤有关。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于a) —基因编码调节小泡与细胞膜 之融合的SM蛋白，b)第二基因编码调节小泡与高尔基复合体之融合的SM蛋白。在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于MimC18C(SEQ IDNO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)之表达或活性增加。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于步骤a)包含a)增加编码SM蛋白家族 之一成员的第一基因之表达或活性，b)第二基因编码SM蛋白家族之另一成员，及c)第三 基因编码XBP-I。在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于Muncl8c (SEQ IDNO 39)、 Sly-I (SEQ ID NO 41) R XBP-I (SEQ ID NO 43)之表达或活性增加。本发明另外系关于将细胞工程化之方法，其包含a)将一或多种包含为至少两种 多肽编码之核酸序列的载体系统引入细胞中，藉以i)至少一种第一核酸序列编码SM-蛋白 或其衍生物、突变体或片段，及ii)第二核酸序列编码目标蛋白，b)在该细胞中表达该目标 蛋白及该至少一种SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于将核酸序列依次引入该细胞中。在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于引入至少一种编码SM蛋白之核 酸序列，随后引入编码该目标蛋白的核酸序列。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于引入至少一种编码目标蛋白的核酸序 列，随后引入编码该SM蛋白的核酸序列。
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在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于将核酸序列同时引入该细胞中。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于SM-蛋白为Mimc-18同工型中之任 一者，优选为 Munc-18c(SEQ ID NO 39)或 Sly-I (SEQ ID NO :41)。在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于在步骤a) i)中组合使用两种SM-蛋 白，藉以所述SM蛋白系与小泡转运之两个不同步骤有关。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于a) —基因编码调节小泡与细胞膜之 融合的SM蛋白，b)第二基因编码调节小泡与高尔基复合体之融合的SM蛋白。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于组合使用之两种SM-蛋白为 Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I(SEQ ID NO 41)。 在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于在步骤a) i)中，将两种SM-蛋白与 XBP-I组合使用。在本发明之一尤其优选实施例中，方法之特征在于SM蛋白为与XBP-I (SEQ ID NO 43)组合之 Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ IDNO :41)。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该细胞为真核细胞，诸如酵母、植物、 蠕虫、昆虫、禽类、鱼、爬行动物或哺乳动物细胞。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于该细胞为真核细胞，优选为脊椎动 物细胞，最优选为哺乳动物细胞。该脊椎动物细胞优选为禽类细胞，诸如鸡或鸭细胞。在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于该哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢 (Chinese Hamster Ovary, CH0)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER. C6 、人类胚肾 HEK293、人类骨髓瘤、人类羊水细胞(humanamniocyte)、婴儿仓鼠肾脏、非洲绿猴肾脏、人类 宫颈癌、犬肾、水牛大鼠肝脏、人类肺脏、人类肝脏、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、NS0、狗、猪 或恒河猴细胞、大鼠、兔、猫、山羊细胞，优选为CHO细胞。在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于该CHO细胞为野生型CH0、CHO Kl、 CHO DG44、CH0 DUKX-B11,CHO Pro_5或由其衍生之突变体，包括CHO突变体Lecl至Lec35， 优选为CHO DG44。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于目标蛋白为膜或分泌蛋白，优选为 抗体或抗体片段。在本发明之另一特定实施例中，方法之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动 物、鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋 白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、 单链Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以 上片段中一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该异源SM蛋白存在于包含至少一种 SNARE蛋白之小泡融合复合物中。在本发明之一特定实施例中，方法之特征在于该异源SM蛋白存在于包含至少一 种SNARE蛋白及突触融合蛋白4或突触融合蛋白5之小泡融合复合物中。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于在该细胞中该目标异源蛋白的比生产率为每细胞每天至少5pg，每细胞每天15pg，每细胞每天20pg，每细胞每天25pg。在本发明之另一实施例中，方法之特征在于该方法引起该目标蛋白在该细胞中与 表达该目标蛋白之对照细胞相比提高之比细胞生产率，但藉以该对照细胞并不具有任何 SM-蛋白之增加之表达或活性。在本发明之一优选实施例中，方法之特征在于生产率之提高为约5%至约10%、 约11%至约20%、约21%至约30%、约31%至约40%、约41%至约50%、约51%至约 60%、约61%至约70%、约71%至约80%、约81%至约90%、约91%至约100%、约101% 至约149%、约150%至约199%、约200%至约299%、约300%至约499%，或约500%至约 1000%。本发明另外系关于一种提高目标膜或分泌蛋白在细胞中之比细胞生产率或滴度 的方法，其包含a)将一或多种包含为至少两种多肽编码之核酸序列的载体系统引入细胞 中，藉以i)至少一种第一多核苷酸编码SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，及ii)第二多 核苷酸编码目标蛋白，及b)在该细胞中表达该目标蛋白及该SM-蛋白或其衍生物、突变体 或片段。本发明另外系关于包含编码至少两种多肽之表达单元的表达载体，藉以a)至少 一种多肽为SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，及b)第二多肽为目标蛋白。在本发明之一特定实施例中，表达载体之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白，优选 为抗体或抗体片段。在本发明之一优选实施例中，表达载体之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动 物、鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋 白轻链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、 单链Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以 上片段中之一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于表达单元为多顺反子，优选为双 顺反子。在本发明之一特定实施例中，表达载体之特征在于载体包含在图8中所述之表达 构建体的任一者。在本发明之一优选实施例中，表达载体之特征在于载体包含至少一个配置如下之 双顺反子表达单元a)编码SM蛋白之基因，b) IRES组件及c)编码SM蛋白之第二基因。参 见图8d)。在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于自分离之表达单元(图8a) 或自一种双顺反子单元(图8b)编码至少一种目标蛋白(GOI)及一种SM蛋白。在本发明 之另一优选实施例中，表达载体之特征在于其包含自分离之表达盒(图8c)编码或以双顺 反子而其中两个基因经由一个IRES组件连接(图8d)编码两种SM蛋白的基因。在本发明 之另一实施例中，表达载体之特征在于其编码至少两种SM蛋白及一个目标基因(图8e)或 自一种多顺反子表达单元编码几种SM蛋白。在本发明之一个优选实施例中，表达载体之特征在于SM-蛋白为Mimc-18同工型 Munc a、b、c之一，优选为Munc-18c(SEQ ID NO :39)。在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于SM-蛋白为Sly-1(SEQ IDNO 41)。在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于组合使用至少两种SM-蛋白。在本发明之一个特定实施例中，表达载体之特征在于该至少两种SM蛋白涉及小 泡转运之两个不同步骤。在本发明之另一实施例中，表达载体之特征在于a) —种SM蛋白调节小泡与细胞 膜之融合，b)第二 SM蛋白调节小泡与高尔基复合体之融合。在本发明之一个优选实施例中，表达载体之特征在于SM蛋白为Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)。在本发明之另一优选实施例中，表达载体之特征在于至少两种SM-蛋白与XBP-I 组合使用，优选 Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)与 XBP-1 (SEQ ID NO: 43)组合。本发明另外系关于表达至少两种异源基因之细胞a)至少一种编码SM-蛋白或其 衍生物、突变体或片段之基因，及b)编码目标蛋白的基因。在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗 体或抗体片段。在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于抗体为单克隆、多克隆、哺乳动物、 鼠类、嵌合、人源化、灵长化、灵长类、人类或其抗体片段或衍生物，诸如抗体、免疫球蛋白轻 链、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链及重链、Fab、F (ab' ) 2、Fe、Fc-Fc融合蛋白、Fv、单链 Fv、单结构域Fv、四价单链Fv、二硫键联Fv、结构域缺失、微型抗体、双功能抗体，或以上片 段中之一者与另一肽或多肽之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于SM蛋白之表达量显著在内源量以 上，优选10%。在本发明之另一实施例中，细胞之特征在于该蛋白之表达量系在内源量以上 5%，优选在内源量以上 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65 % ,70 % ,75 % ,80 % ,85 % ,90 % ,95 % UOO % ,120 % ,150 % ,175 % ,200 % ,300 % ,400 %, 500%、1000%。在本发明之另一实施例中，细胞包含本发明之表达载体之任一者。在本发明之一特定实施例中，细胞之特征在于该细胞为真核细胞，优选为脊椎动 物细胞，最优选为哺乳动物细胞。尤其优选为啮齿动物细胞。在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于该真核细胞为禽类细胞。在本发明之另一特定实施例中，细胞之特征在于该哺乳动物细胞为啮齿动物细 胞，优选为仓鼠或鼠类细胞。在本发明之一优选实施例中，细胞之特征在于该哺乳动物细胞 为中国仓鼠卵巢(CHO)、猴肾CV1、猴肾COS、人类晶状体上皮PER. C6 、人类骨髓瘤、人类羊 水细胞、人类胚肾HEK293、婴儿仓鼠肾脏、非洲绿猴肾脏、人类宫颈癌、犬肾、水牛大鼠肝脏、 人类肺脏、人类肝脏、小鼠乳腺肿瘤或骨髓瘤细胞、NS0、狗、猪或恒河猴细胞、大鼠、兔、猫、 山羊细胞，优选为CHO细胞。在本发明之另一优选实施例中，细胞之特征在于该CHO细胞为野生型CHO、CHO KU CHO DG44、CHO DUKX-BlU CHO Pro-5或由其衍生之突变体，包括CHO突变体Lecl至 Lec35，优选为 CHO DG44。在本发明之一尤其优选实施例中，细胞之特征在于该细胞为CHO细胞，优选为CHO
26DG44细胞。本发明另外系关于目标蛋白，优选藉由任何本发明之方法产生的抗体。本发明另外系关于一种药物组合物，其包含适用于阻断或降低一或若干种SM-蛋 白之活性或表达(优选为表达)之化合物及可药用载剂。在本发明之一特定实施例中，药物组合物之特征在于化合物为多核苷酸序列。多 核苷酸序列优选为shRNA、RNAi、siRNA或反义-RNA，最优选为shRNA。在本发明之另一特定实施例中，药物组合物之特征在于SM-蛋白为Mimc-ISc (SEQ ID NO 39)或 Sly-I (SEQ ID NO 41)或两者之组合。本发明另外系关于一种识别SM-蛋白功能之调节剂的方法，其包含a)提供至少一 种SM-蛋白或其衍生物、突变体或片段，优选为Mimc-ISc，b)使步骤a)之该SM-蛋白与测 试剂接触，c)测定与细胞表面蛋白之增加或减少之蛋白分泌或表达相关的效应。本发明另外系关于一种治疗癌症、自身免疫病及炎症之方法，其包含向有此需要 之患者投与治疗有效量之根据本发明之药物组合物。本发明亦系关于一种包含应用根据本发明之药物组合物以治疗癌症、自身免疫病 及炎症之方法。本发明亦系关于一种抑制或降低细胞增殖或迁移之方法，其包含使该细胞与根据 本发明之药物组合物接触。本发明之可能治疗应用包括防止诸如自细胞或组织之发炎性介体、生长因子、血 管生成因子之蛋白的分泌以在癌症疗法、自身免疫病及炎症中控制细胞-细胞通讯，或为 了促进在悬浮液中生长及防止细胞聚集之目的藉由减少锚定跨膜蛋白之细胞表面存在来 减少细胞附接。本发明另外系关于SM-蛋白或编码SM-蛋白之多核苷酸在活体外细胞或组织 培养系统中增加目标蛋白的分泌及/或产量之用途。SM蛋白优选为MimclS蛋白，诸如 Munc 18c (SEQ ID NO :39)。亦优选的为 Sly-I 蛋白，诸如 Sly-I (SEQ ID NO :41)。本发明另外系关于本发明之任何方法、表达载体、细胞或药物组合物的诊断用途。本发明另外系关于一种提高细胞之蛋白分泌/将细胞工程化/在细胞中产生目标 异源蛋白的方法，其包含a)将人类Secl/Muncl8及Slyl/SCFDl克隆至表达载体(例如，哺乳动物BI-HEX 表达平台)中，藉以所述蛋白可藉由一种或不同双顺反子/多顺反子表达单元来编码且藉 以可在同一或不同质粒上含有所述蛋白，b)以单独或组合方式，同时或依次将所述构建体转染至真核生物宿主细胞中，所 述真核生物宿主细胞优选为哺乳动物细胞，诸如CHO、BHK、NSO、HEK293、PerC. 6，c)任选地核对转基因表达，d)引入编码目标基因(GOI)之构建体，优选为分泌蛋白或跨膜蛋白，e)例例如藉由ELISA、Western印迹法或流式细胞仪进行GOI之表达分析。或者，步骤(b+c)及(d+e)之顺序可变化，藉此首先引入G0I，或步骤(b)及(d)可 同时进行。参考仅出于说明本发明之某些实施例之目的而包括于本文中之以下实施例，将较 易于理解上文一般描述之本发明。以下实施例并非限制性的。其仅展示本发明之可能实施例。熟习此项技术者可易于调节条件以将其应用于其它实施例。实验材料及方法质粒设计。人slyl从HEK-293总RNA经RT-PCR扩增，使用寡核苷酸 0RP70(5 ‘ -CGCGGATCCACCATGGCGGCGG CGGCGGCAGCG-3 ‘ ， SEQ ID NO 1)及 0RP71(5 ‘ -CCGCTCG AGTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3 ‘，SEQID NO 2)，将克隆 的 BamHI/XhoI 弓丨入 pcDNA3. 1 (Invitrogen)中，得到 pRP24(PhCMV-slyl-pAsv4。)。同样 地，将 muncl8c 克隆(0RP69，5 ‘ -CGCGGATCCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAG AGAGG-3 ‘，SEQ ID NO 3;0RP66，5' -CCCTCGAGCTATTCA TCTTTAATTAAGGAGAC-3 ‘，SEQ ID NO 4)，得到 pRP17(PhCMV-muncl8c-pAsv40)。pRP32 (P請-EYFP-slyl-pAsv4(1)通过插入 slyl 来构建，所述 slyl,使用 0RP29(5' -CTCAGATCTGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3‘，SEQ ID NO 5)及 0RP30(5' -ACCGTCGACCTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3'，SEQ ID NO 6)从 pRP24 经 PCR 扩增获得，再 经 Bglll/Sall 引入 pEYFP-Cl (Clontech)。pRP23 (PhCMV-EYFP-muncl8c-pAsv4Q)的设计是从 PRP17 切取 muncl8c BamHI/XhoI，将其经 Bglll/Sall 处理克隆至 pEYFP-Cl 中。pRP3 通过 插入 syl 1 来产生，所述 syl 1 用 0RP9 (5 ‘ -CGCGCGGCCGCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGC G-3 ‘， SEQ ID N07)及 0RP10(5' -CCGGGATCCTTACTTTTGTCCAAGTTGT GACMCTG-3 ‘，SEQ ID NO 8) 经PCR扩增获得，经Notl/BamHI引入pRPl中，该pRPl来自pIRESneo (Clontech)，是将新 霉素抗性基因替换为Smal/Xbal GFP而衍生的，所述GFP用0RP5 (5 ‘ -CCCCCGGGATGGTGAG CAAGGGCG AGG-3‘ ， SEQ IDNO 9)及 0RP6(5‘ -TTTCTAGATTACTTGTACAGCTCG TCC-3‘ ， SEQ ID NO10)自pLEGFP-Nl (Clontech)经PCR扩增制得。同样地，pRP4通过插入muncl8c来构 建，所述 muncl8c 用 0RP15，5' -CGCGCGGCCGCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3 ‘，SEQ ID NO 11 ；0RP16,5' -CCGGATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3‘，SEQ ID NO 12)从pRP 17 经 PCR扩增获得，并经Notl/BamHI引入pRPl中。pRP29 (Pmv-ECFP-突触融合蛋白4_pAsv4(1)的 构建是，用 PCR 扩增突触融合蛋白 4 (0RP127, 5 ‘ -CCCAAGCTTTGCGCGACAGGACCCACGAG-3 ‘， SEQ ID NO 13 ；0RP128,5' -CGCGTCGACTTATCCAACGGTTATGG TGATGCC-3‘，SEQ ID NO 14)， 接着将Hindlll/Sall克隆至pECFP-Cl (Clontech)中。同样地，将突触融合蛋白5克隆 (0RP136,5' -GGMGATCTATCCCGCGGAAACGCTAC-3‘，SEQ ID NO 15 ；0RP137,5' -CCCMGCTT TCAAGCAAGGAAGACCAC-3 ‘，SEQ ID NO 16)，得到 pRP40 (Phcw-ECFP-突触融合蛋白 5_pAsv40)。 带slyl-或muncl8c-特异性shRNA的表达载体通过将双链DNA片段经Bbsl/Xbal插入pmU6 中来克隆(i) slyl (ShRNAslyl ！ ；pRP5, 5 ‘ -TTTGGAAGTAAACT GGAAGATATTTTCAAGAGAAATATCT TCCAGTTTACTTCTTTTT-3‘ ，SEQ ID NO 23，及5' -CTAGAAAAAGAAGTAAACTGGAAGATATTTCTCTT GAMATATCTTCCAGTTTACTTC-3‘ ；SEQ ID NO 24,shRNAslyl 2 ；pRP6,5' -TTTGGCAGTGAMCTAGA CAAGAAATTCMGAGATTTCTTGTCTAGTTTCACTGCTTTTT-3'，SEQ ID NO 25及 5' -CTAGAAAAAGCA GTGAAACTAGACAAGAAATCTCTTGAATTTCTTGTCTAGTTTCACTGC-3 ‘ ； SEQ ID NO 26 ShRNAslyl 3； pRP7，5‘ -TTTGGGAGGCAACTACATTGAATATTTCAAGAGAATATTCAATGTAGTTGCCTCCTTTTT-3‘，SEQ ID NO 27，及 5' -CTAGAAAAAGGAGGCAACTACATTGAATATTCTCTTGAAATATTCAATGTAGTTGCCTCC-3'，SEQ ID NO 28) ； (ii)muncl8c (shRNA_cl8c 丄；pRP12，5' -TTTGCACATGAATCTC AGGTGTAT ATTCAAGAGATATACACCTGAGATTCATGTGTTTTT-3' ， SEQ ID NO 29，及 5' -CTAGAAAAACACATGA
28ATCTCAGGTGTATATCTCTTGAATATACACCTGAGATTCATGTG-3 ‘ , SEQ ID NO 30 ； ShRNAmuncl8c 2 ； pRP14，5 ‘ -TTTGGCTTGAAGACTACTACAAGATTTCAAGAGAATCTTGTAGTAGTCTTCAAGCTTTTT-3 ‘， SEQ ID NO 31，及 -CTAGAAAAAGCTTGAAGACTACTACAAGATTCTCTTGAAATCTTGTAGTAGTCTTC AAGC-3 ‘，SEQ ID NO 32 ；ShRNAmuncl8c 3 ；pRP38,5' -TTTGCGCCAGAAAC CCAGAGCTAATTTCAA GAGAATTAGCTCTGGGTTTCTGGCGTTTTT-3' , SEQ ID N033，及 5' -CTAGAAAAACGCCAGAAA CCC AGAGCTAATTCTCTTGAAATTAGCTCTGGGTTTCTGG CG-3'，SEQ ID NO 34 ； ShRNAmuncl8c 4 ；pRP39, 5 ‘ -TTTGGCTGAATAAACCCAAGGATAATTCAAGAGATTATCCTTGGGTTTATTCAGCTTTTT-3 ‘ ， SEQ ID NO 35，及 5 ‘ -CTAGAA AAAGCTGAATAAACCCAAGGATAATCTCTTGAATTATCCTTGGGTTTATTCAGC-3'，SEQ IDNO 360 ； (iii)对照 shRNA(pRP9，5 ‘ -TTTGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTCAAGA GAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGTTTTT-3‘ ，SEQ ID N037，及-CTAGAAAAACACAAGCTGGAGTACAA CTACTCTCTTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTG-3 ‘，SEQ ID NO 38)。编码人类胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的pSEAP2对照购自Clontech，携嗜热脂肪芽孢 杆菌衍生的分泌型α-淀粉酶(SAMY)的pSS158已被在先文献49描述。含有人类血管内 皮生长因子121 (VGEF121)的pffff276以及分别编码人类IgGl利妥昔单抗之重链及轻链的 PWW943 及 pffff946 由 Wilfried Weber 友情提供。xbp_l 表达载体 pcDNA3. I-Xbp-I (PhCMV-xbp-l-pASV40)之前已描述(Tigges 及 Fussenegger，2006)。细胞培养及转染a)贴壁细胞之培养在37 °C下在含有5 % CO2之湿润气氛中，在补充有5 % FCS (PAN Biotech, Aidenbach, Germany ；目录号 3302，批号 P231902)之 ChoMaster HTS 培养基(Cell Culture Technology, Gravesano, Switzerland)或 Dulbecco 改质之 Eagle 培养基(DMEM ； Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培养中国仓鼠卵巢(CH0-K1 ；ATCC CCL-61)及人类胚肾 细胞(HEK-293 ；ATCC CRL-1573)。为了瞬间转染，将1 X IO5个细胞接种于12孔组织培养 板之一个孔中，24h后，用改良的基于磷酸钙的方案47或FUGENE6转染试剂(Roche，Basel, Switzerland)进行转染。使用表达及选择载体以及抗生素之以下组合来产生为组成型转 基因表达而工程化之单转基因稳定CH0-K1衍生物(i)CHO-Slyl16及CHO-Slyl23 ；pRP24 ； 400 μ g/ml G418 (Merck) ； (ii) CH0_Muncl8c8 及 CH0_Muncl8c9、pRP17 ;400 μ g/ml G418。双 转基因细胞株 CH0-Slyl-Muncl8ci 及 CHO-Slyl-Xbpl4 系藉由将 pRP17 与 pPUR(Clontech)、 pcDNA3. I-Xbp-I35与pPUR分别共转染至CHO-Slyl23中，接着以G418及嘌呤霉素(4 μ g/ ml)进行克隆选择来构建。藉由将pcDNA3. I-Xbp-I与pZeoSV2 (Invitrogen)共转染至 CH0-Slyl-Muncl8ci 中，接着以 G418 (400 μ g/ml)、嘌呤霉素(4yg/ml)及零霉素(zeocin) (150 μ g/ml)进行选择来产生使能够组成型表达slyl、muncl8c及xbp-Ι之三转基因细胞 株 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17。b)悬浮液培养物将产生单克隆抗体(mAB)的CH0-DG44细胞的悬浮液培养物(Urlaub等人，1986) 及其稳定转染物培育于BI专属(ΒΙ-proprietary)化学确定的(chemically defined) 无血清培养基中。每2-3天转种(sub-cultivated)晶种储备培养物，接种密度分别为 3X 105-2X 105个细胞/毫升。使细胞生长于T-烧瓶或摇瓶(Nunc)中。在5%C02、37°C及 120rpm下，在湿润培育箱(Thermo)中培育T-烧瓶且在Multitron HT培育箱(Infors)中培育摇瓶。使用血球计通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)，来测定细胞浓度及活 力。补料分批培养将细胞以3X IO5个细胞/毫升接种于IOOOml摇瓶中，于250ml无抗生素或 MTX(Sigma-Aldrich,Germany)之BI-专属生产型培养基中。将培养物在120rpm、37°C、5% CO2中搅拌，稍后，当细胞数目增加时将CO2降至2%。每日测定培养参数，包括pH值、葡萄 糖及乳酸盐浓度，根据需要用NaCOjfpH值调节至pH 7.0。每24hr添加BI-专属补料溶 液。用自动化CEDEX细胞定量系统(Irmovatis)通过台盼蓝排除法来测定细胞密度及活力。 收集来自细胞培养液之试样，通过ELISA测量滴度。为进行ELISA，使用抗人类-Fe片段之抗体(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶联 HRP 的人类 κ 轻链(Sigma)。将累积的比生产率(cumulative specific productivity)计算为指定日的产物 浓度除以直至该时间点的〃活细胞总数〃 (integral of viable cells，IVC)。RNA分离、RT-PCR及定量实时PCR用 NucleoSpin RNA II 试剂盒(Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland), 从哺乳动物细胞制备总RNA,用TITANIUM One-Step RT-PCR试剂盒(Clontech)根 据制造商方案进行RT-PCR。seap、samy及Vegf121 mRNA之相对定量系以Applied Biosystems 7500 实时 PCR 装置，使用 25 μ 1 含有 Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems，Warrington，UK)、IOOng cDNA、900nM 正向及反向引物(特异 于 seap(5 ‘ -AGGCCCGGGACAGGAA-3 ‘，SEQID NO 17 ；5 ‘ -GCCGTCCTTGAGCACATAGC-3 ‘， SEQ ID NO 18)、特异于 samy(5 ‘ -AAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTC-3 ‘，SEQ ID NO 19; 5' -AACACGACATCGGCGTACACT-3‘，SEQ ID NO 20)及特异于 Vegf121 (5‘ -CTTGCTGCTCTACC TCCACCAT-3‘，SEQ ID NO 21 ；5' -TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3‘，SEQ ID NO 22))之反应 液来进行。使用核糖体ISs-RNA特异性转录物试验(Applied Biosystems)将所有试样均 标准化且对所有扩增子(amplicons)均进行解链曲线分析，以证实不存在非特异性扩增。共焦显微法在48h之后将接种且转染于涂布聚赖氨酸之玻璃载片上的HEK-293以磷酸盐缓 冲盐水(PBS)洗涤，以低聚甲醛(paraformaldehyde，3固定，以PBS再次洗涤，且藉 由共焦显微法分析。以Leica TCS SPl (Leica, Heerbrugg, Switzerland)记录影像且藉由 Adobe Photoshop 10 力口以分析。抗体、免疫沉淀及Western印迹法将哺乳动物细胞在冰上溶胞缓冲液(50mM Tris-HCL, pH 7. 5、150mMNaCl、ImM DTTUmM EDTAU % Triton X-100)中裂解。4°C、14，000X g 离心 lOmin，接着 4°C 与蛋白 A-Sepharose 珠粒(Amersham Biosicences, Uppsla, Sweden) 一起培育 30min,—次获得总 蛋白溶胞物。4°C旋转过夜，使2mg总蛋白与亲和纯化的Muncl8c抗体(与蛋白A-S印harose 偶联)混合于最终体积为500μ 1的溶胞缓冲液中，进行免疫沉淀。接着将珠粒用500μ 1 溶胞缓冲液洗涤四次，洗脱蛋白，用SDS-PAGE分离，接着进行Western印迹分析。特异于 Slyl 的抗体由 Jesse Hay (University of Montana,Missoula,MO, USA)友情提供。特异于Muncl8a>^Mffi-n SS 4 R Vamp2 的自 SynapticSystems (Goettingen, Germany), 抗 Munc 18b、Munc 18c 及 p27Kipl 的抗体来自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz，CA， USA)。使用 ECL-Plus 侦测试剂及偶联 HRP 的第二抗体(Amersham，Piscataway，NJ，USA)来 观测经印迹之蛋白。蛋白生产蛋白生产在培养48h之后用标准试验来评估SEAP，基于对硝基苯磷酸盐之光 吸收时间过程；SAMY，蓝淀粉 Phadebas .试验(Pharmacia Upjohn, Peapack，NJ，目录 号 10-5380-32) ；VEGF121，人 VEGF121 特异性 ELISA(R&DSystem, Minneapolis, MN,目录号 DY293)；利妥昔单抗，ELISA (Sigma,目录号 12136 及 A0170)。如下测定生长于悬浮液培养物中之细胞的抗体滴度及比生产率以双顺反子载体转染产抗体的CH0-DG44，分析异源蛋白表达对mAb生产率之影 响。为评定种子储用培养物之生产率，自三个连续继代收集来自细胞培养物上清之试样。接 着藉由酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析产物浓度。为进行ELISA，使用抗人类-Fc片段抗 体(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及偶联 HRP 的人类 κ 轻链(Sigma)。连同细 胞密度及活力一起，如下计算比生产率， qp =比生产率(pg/细胞/天)mAb =抗体浓度(mg/L)t=时点(天)cc =细胞计数(X IO6细胞/毫升)P =代 利妥昔单抗之N-连接糖基化概况利妥昔单抗用蛋白A-Siipharose纯化，以IOmM甘氨酸缓冲液(pH 2. 8)洗脱，接着 以2M Tris (pH 9.0)中和。藉由SDS-PAGE证实纯度/完整性。接着在37°C以2mM Tris (pH7) 中之 0. 05mU/mg 蛋白进行 N-糖苷酶消化(PNGaseF, EC 3. 5. 1. 52，QA-Bio, San Mateo, CA) 历时3h，从而使寡糖自抗体中酶促释放。在150mM乙酸中培育所释放之寡糖，随后以DHB 作为基质(Papac 等人，1998)，使用 Autoflex MALDI/TOF (Bruker Daltonics, Faellanden, Switzerland)，以阳离子模式操作来进行MALDI分析。HRP转运试验以编码分泌型辣根过氧化物酶(ssHRP)的构建体与空载体、表达MimC18C、Slyl的 构建体或编码Muncl8c及Slyl两者的双顺反子表达单元中之任一者来共转染人类HT1080 纤维肉瘤细胞。在转染后24h及48h后，自细胞培养液取样，将澄清细胞的上清与TMB试剂 (BD Biosciences, Pharmingen) 一起培育，侦测报道蛋白ssHRP之分泌。3min后，停止反 应，以ELISA读取器(Spectra Rainbow Thermo)在450nm测量光吸收度，以确定ssHRP滴 度。为进一步分析比生产率，在最后一次测量之后将细胞用胰蛋白酶消化，用CASY 细胞 计数器(Schaerfe System)计数，将ssHRP滴度除以细胞总数来计算比生产率。
实施例实施例1 将Slyl及Muncl8c沿分泌途径在HEK-293中定位。我们使用基于RT-PCR之分析以描绘SM蛋白Slyl及Muncl8之同工型(a、b、c)在 HEK-293 中之表达。如在图 Ia 及 Ib 中所示，slyl(NM_016160)及 muncl8c (NM_007269)表达 水平较高，mucl8b (NM_006949)痕量表达，未能侦测到神经元特异性muncl8a (NM_003165) 之转录物。藉由Western印迹法(图Ic)来证实SM蛋白概况。藉由在HEK-293中共表达 YFP-Slyl (pRP32)与 CFP-突触融合蛋白 5 (pRP40)或 YFP-Munc 18c (pRP23)与 CFP-突触融 合蛋白4(pRP29)来分析Slyl及Muncl8主要同工型Muncl8c之细胞内定位。突触融合蛋 白5为定位于高尔基体之结合Slyl的SNARE，突触融合蛋白4为与细胞膜结合之与MimclSc 相互作用的SNARE。共焦显微法展示，Slyl显示与突触融合蛋白5在高尔基体处极致密之 核周共定位，MimclSc与突触融合蛋白4之细胞膜共染色(co-stain)(图Id)。此等结果证 明Slyl及MimclSc在HEK-293中表达且定位于高尔基体与细胞膜，此系与其在各个细胞器 处之两个独特融合步骤中之作用一致(Jahn等人，2003)。实施例2 =Slyl及Muncl8对蛋白分泌进行调节。已知SM蛋白控制对细胞内蛋白转运必需之小泡融合，但其对于蛋白分泌之作用 仍未知。为表征Slyl及MimclS对总体胞吐作用之影响，我们设计了这些SM蛋白的特异性 shRNA。Slyl及MimclSc的敲低用以下方法证明细胞用双顺反子性质的编码Slyl (pRP3 ； PhCMV-slyl-IRES-eGFP-pA)及编码 Munc 18c (pRP4 ;PhCMV-munc 18c-IRES_eGFP-pA)的报道构 建体与特异性以及非特异性对照物shRNA共转染，进行荧光显微镜检(图2)。在HEK-293 中证实，各个shRNA将内源Slyl及Muncl8c表达最多敲低70%之能力(图3a及3c)。为 分析Slyl及MimclSc敲低对哺乳动物细胞之总体蛋白分泌能力的影响，我们将pSEAP2 对照物及 PRP5 (ShRNAslylj)、pRP6 (shRNAslyl 2)、pRP7 (shRNAslyl 3)或 pRP12 (shRNAmuncl8c l)、 pRP14 (ShRNAmuncl8c 2)、pRP38 (shRNAmuncl8c 3)、pRP39 (shRNAmuncl8c 4)共转染至 HEK-293 中，确定 培养上清中的SEAP水平。Slyl及MimclSc的敲低与SEAP产量减少直接相关，表明此等SM 蛋白在哺乳动物分泌途径中起重要作用(图3b及3d)。实施例3 =Slyl及Muncl8c之异位表达提高哺乳动物细胞之分泌能力。在Slyl 或 Muncl8c 于 CH0-K1 中异位表达(图 4a 4b,4c)之后，SEAP、SAMY 或 VEGF121之异源生产提高至多5倍，这与用以启动产物基因转录的启动子(PSV4C1、Phctw> PefiJ 无关。当使用HEK-293细胞时，亦观察到类似结果(数据未展示)。因为SEAP、SAMY及VEGF 之mRNA水平在有或无升高之Slyl、MimC18C或两者之情况下都基本恒定(图4d)，所以异源 蛋白产量之提高系由转译后机制介导。我们的结果与主张MimclS蛋白在一系列细胞类型 (包括脂肪细胞及肌细胞)中对胞吐有抑制作用的先前研究(Riento等人，2000 ；Kanda等 人，2005 ；Tellam等人，1997 ；Thurmond等人，1998)形成鲜明对比，，这是首次提供Muncl8c 及Slyl均促进总体胞吐作用的证据。实施例4 :SM蛋白及Xbp-I对分泌途径之协同效应。因为Slyl及MunclS以及Xbp-I (最近被鉴定为通过增大分泌细胞器之尺寸来增 强蛋白分泌(Tigges及Fussenegger，2006))在分泌途径中具有不同目标，所以其可能能够 协同地提高蛋白产量。因此我们将编码Slyl、MunclSc及Xbp-I的表达载体以及含SEAP、 SAMY及VEGF121的表达载体的不同组合共转染至CHO-Kl中，确定培养上清中的报道蛋白水平。如图4a中所示，slyl与munC18C同时过度表达引起SEAP产量提高8倍，相比之下，单 独之slyl或muncl8c仅导致提高5倍。SAMY及VEGF121之分泌亦增多(图4b,4c)。slyl、 muncl8c及xbp_l全都过度表达将SEAP、SAMY及VEGF之分泌分别增多10倍、12倍及8倍 (图4a、4b、4c)，明显地说明在Slyl与Muncl8c之间及在两种SM蛋白与通用细胞器扩张因 子Xbp-I之间存在对分泌的协同效应。实施例5 =SM蛋白藉由刺激SNARE介导之转运机制来提高分泌能力。先前研究指定MimclSc在胞吐中起抑制作用，其与在本文中报道之结果形成对比 (Riento 等人，2000 ；Kanda 等人，2005 ；Tellam 等人，1997 ；Thurmond 等人，1998)。为从分子 水平研究Muncl8c在转运机制中之作用，尤其是其与由突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP2 组成之胞吐SNARE蛋白之相互作用，我们进行免疫沉淀实验。如图5中所示，MimclSc-特异 性抗体定量沉淀Muncl8c以及显著量的突触融合蛋白4、SNAP-23及VAMP 2，表明Muncl8c 与这些SNARE在体内相关(association)，其在分泌途径中促进小泡-细胞器融合(Peng and Gallwitz，2002 ；Shen等人，2007 ；Scott等人，2004)。此发现强调，类似于与完全组装 之SNARE复合物结合且促进融合高尔基体之Slyl，Munc 18c亦与SNARE复合物直接相互作 用，提示抑制通过促进SNARE介导之转运机制而起作用的保守机制。实施例6 对哺乳动物细胞进行基于SM蛋白的工程化以提高哺乳动物细胞中的分 泌能力。Slyl及Muncl8c表达对哺乳动物细胞分泌能力之正面效应提出一种对哺 乳动物生产细胞株进行工程化以提高分泌的新颖转译后方法。因此我们制得稳定的 CHO-Kl衍生细胞株，它们经工程化后能组成型表达slyl (CHO-Slyl16及CHO-Slyl23)或 muncl8c (CH0_Muncl8c8 及 CH0_Muncl8c9)。CHO-Slyl16 及 CHO-Slyl23 刺激 4 倍和 8 倍的 SEAP 分泌(图6a)及4倍和5倍的SAMY生产(图6b)。有趣的是，产生较多SEAP之CHO-Slyl23 亦展示较高的Slyl水平，表明SM与产物蛋白正相关(图6c)。类似地，因转基因而为组成型 表达muncl8c的细胞(CHO-Munc 18c9)的SEAP产量多9倍，SAMY产量多6. 5倍(图6e及6f)， 产生更多SEAP的CH0-Muncl89亦展示较高的Muncl8c水平(图6d)。与亲本CHO-Kl相比，组 成型表达Slyl及Muncl8c的双转基因稳定细胞株CH0-Slyl-Muncl8ci的SEAP产量高出13 倍，组成型表达Slyl、Munc 18c及Xbp-I的三转基因稳定细胞株CH0-Slyl-Muncl8c_Xbp-l7 的SEAP产量高出16倍(图6g)。实施例7 基于SM蛋白的分泌工程化提高生产细胞株对抗体的比生产率。为在原型生物药生产方案中验证基于SM蛋白之分泌工程化，我们使称为利 妥昔单抗之单克隆抗人类⑶20 IgGl在CHO-Slyl16及CHO-Slyl23中表达(增加至多 10倍)、在CH0-Slyl-Muncl8ci中表达(增加至多15倍)及在CHO-Slyl-Xbp-I4中表 达(增加至多13倍)及在CH0-Slyl-MunC18C-Xbp-l7中表达(增加至多19倍)(图 7a)。当在CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中产生利妥昔单抗时，可达到至多40pg/细胞/天 之特别制造水平，其比同基因对照细胞株增加近20倍(图7a)。SDS-PAGE分析表明，由 CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17及野生型CHO-Kl细胞产生的抗体结构完整且彼此无法区别 (图7b,7c)。对CH0-Slyl-Muncl8c-Xbp-17中产生的利妥昔单抗的N-连接Fc寡糖进行 基于Maldi-TOF的糖基化概况分析，结果发现与天然生产细胞株相比无差异，表明基于SM/ Xbp-I之分泌工程化并不损害产物质量(图7d及7e)。
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实施例8 基于SM蛋白的分泌工程化提高生产过程中的抗体总产量。a)为测试SM蛋白之异源表达是否亦可用以在工业制造之相关条件下提高治疗 用蛋白的分泌，以空载体(MOCK对照物)或编码Slyl(SEQ ID NO. 41)或Munc-18 (SEQ ID NO. 39)或两者之表达构建体作为双顺反子表达单元来稳定转染分泌人源化抗⑶44v6 IgG 抗体BIWA 4的产抗体CHO细胞株(CH0DG44)。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池(cell pool)。在六次后续传代期间，自所有稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测 定MCP-I滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产率。在所有表达任一 SM蛋白之细胞中， 与MOCK或未经转染之细胞相比，IgG表达均显著提高，最高值见于同时表达两种SM蛋白之 细胞池中。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。每日测量细胞总数 及细胞活力，且在第3天、第5天、第7天、第9天及第11天，自细胞培养液取样以测定IgG滴 度及比生产率(图10AU0B)。在此等条件下，与MOCK对照物及未经转染之亲本细胞株相比， SM蛋白转基因细胞展示类似生长特性。然而与MOCK对照物相比，在表达Slyl或Munc-18 或同时表达两种SM蛋白之细胞中IgG比生产率显著提高(高至多50%)(图10A)，造成在 制造过程中单克隆抗体滴度明显增加(图10B)。这些数据一起证明，基于SM蛋白之细胞工程化方法可用于以多种培养形式(包括 系列培养、生物反应器分批培养及补料分批培养)提高治疗用蛋白的产量。b)首先以编码 Slyl(SEQ ID N0. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋白一起 之载体转染CHO宿主细胞(CH0 DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细 胞株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码人类单克隆IgG型抗体作 为目标基因的表达构建体转染。在第二轮选择之后，自所有历经六次后续传代的稳定细胞 池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定IgG滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产 率。最高值见于同时携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Slyl或Munc-18者， 其仍产生与不表达任一 SM蛋白之CHO DG-44细胞相比显著更高之抗体滴度。对稳定转染 物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在上述每一种情况中，两种SM蛋白都过 度表达引起抗体滴度及比生产率均显著提高。此表明，单独之Slyl或Munc-18之异源表达 足以增强治疗用抗体的分泌。另外，两种蛋白之异源表达以组合形式联合地以协同方式在 瞬间以及在稳定转染的细胞株中增强总体胞吐作用。实施例9 :SM蛋白之过度表达提高成纤维细胞活化蛋白 α (FibroblastActivation Protein alpha, FAP)之生物药蛋白产量。(a)表达跨膜明胶酶成纤维细胞活化蛋白α (FAP)之人类纤维肉瘤细胞株 (ΗΤ1080, ATCC CCL-121)以空载体(M0CK 对照物)、或以编码 Slyl (SEQ IDN0. 41)或 Munc-18 (SEQ ID NO. 39)或编码两种蛋白作为双顺反子表达单元的表达构建体来转染。接 着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。自此等池之种子储用培养物收集细胞，将其固定以 便藉由FACS测定FAP表面表达，或制备细胞溶胞物以便使用抗FAP抗体进行Western印迹 法。与MOCK细胞相比，细胞表面FAP量在所有表达SM蛋白之细胞中均显著增大，且在表达 Slyl及Munc-18两者之细胞中表达为最高。此等结果表明，两种SM蛋白协同地增强细胞产 生及转运细胞表面跨膜蛋白的能力。
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b)首先以编码 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋白一起 之载体转染人类HT1080或HEK293细胞。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细 胞株。随后，此等细胞株及1111080或冊1(293野生型细胞平行地以编码？4 0作为目标基因 的载体转染。在第二轮选择之后，自所有稳定细胞池之培养物取细胞，藉由FACS或Western 印迹法来测定FAP表达量。最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Slyl 或Mimc-18者，其仍表达与不表达任一 SM蛋白之亲本细胞相比显著更高之FAP水平。使 稳定转染物适应于在悬浮液中生长且经受分批发酵或补料分批发酵，则可获得类似结果。 在所述每一种情况中，两种SM蛋白一起过度表达引起FAP表达显著增多。此表明Slyl及 Mimc-18之异源表达引起跨膜蛋白之产量及细胞表面定位的改进，在异源引入组合之两种 蛋白后，效果为最佳。实施例10 =SM蛋白之过度表达增佳跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR)之生物药
蛋白产量。(a)表达跨膜蛋白表皮生长因子受体(EGFR)之CHO细胞株(例如CH0-DG44)以 空载体(MOCK对照物)或编码Slyl (SEQ ID NO. 41)或Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋 白作为双顺反子表达单元之表达构建体来转染。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。 在四次后续传代期间，自此等池之种子储用培养物取细胞，藉由FACS或Western印迹法测 定EGFR表达量。与MOCK细胞相比，细胞表面EGFR量在所有表达SM蛋白之细胞中均显著 增大，在表达Slyl及Mimc-18两者之细胞中为最高。使稳定转染物经受分批发酵或补料分 批发酵，可获得极类似结果。在所述每一种情况中，Slyl或Mimc-18之过度表达引起EGFR 表达与对照物相比中等增加，而一旦Slyl与Mimc-18同时过度表达后EGFR水平即显著提 高，表明两种SM蛋白协同地增强细胞在多种培养形式(包括系列培养、生物反应器分批培 养及补料分批培养)中产生及转运细胞表面跨膜蛋白的能力。b)首先以编码 Slyl(SEQ ID N0. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋白一起 之载体转染CHO宿主细胞(CH0 DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细 胞株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码EGFR作为目标基因的载体 转染。在第二轮选择之后，从六次连续传代的所有稳定细胞池之种子储用培养物取细胞，藉 由FACS或Western印迹法来测定EGFR表达量。最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次 是表达单独之Slyl或Mimc-18者，其仍表达与不表达任一 SM蛋白之CHO DG-44细胞相比 显著更高之EGFR水平。对稳定转染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在 所述每一种情况中，两种SM蛋白一起之过度表达引起EGFR表达显著增加。此表明Slyl及 Mimc-18之异源表达使跨膜蛋白之产量及细胞表面定位都改进，一旦异源引入组合之两种 蛋白后，效果最好。实施例11 =SM蛋白之过度表达增加单核细胞趋化蛋白1 (MCP-I)之生物药蛋白产量。(a)分泌单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)之CHO细胞株(CH0 DG44)以空载体(M0CK 对照物)或编码Slyl (SEQ ID N0. 41)或Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋白作为双顺反 子表达单元之表达构建体来转染。接着使细胞经受选择以获得稳定细胞池。在六次后续传 代期间，自所有稳定细胞池之种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定MCP-I滴度，将其除 以细胞平均数来计算比生产率。在所有表达任一 SM蛋白之细胞中，与MOCK或未经转染之细胞相比，IgG表达均显著增加，最高值见于同时表达两种SM蛋白之细胞池中。对稳定转 染物进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白之 过度表达引起MCP-I分泌增强，表明两种SM蛋白协同改进细胞在多种培养形式(包括系列 培养、生物反应器分批培养及补料分批培养)中产生蛋白的能力。b)首先以编码 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc_18(SEQ ID NO. 39)或两种蛋白一起 之载体转染CHO宿主细胞(CHO DG44)。使细胞经受选择压力，挑选异源表达SM蛋白的细胞 株。随后，此等细胞株及CHO DG 44野生型细胞平行地以编码单核细胞趋化蛋白I(MCP-I) 作为目标基因的载体转染。在第二轮选择之后，自所有历经六次后续传代的稳定细胞池之 种子储用培养物取上清，藉由ELISA测定MCP-I滴度，将其除以细胞平均数来计算比生产 率。最高值见于携两种SM蛋白之细胞池，其次是表达单独之Slyl或Mimc-18者，其仍 产生与不表达任一 SM蛋白之CHO DG-44细胞相比显著更高之MCP-I滴度。对稳定转染物 进行分批发酵或补料分批发酵可获得类似结果。在所述每一种情况中，两种SM蛋白一起之 过度表达引起MCP-I滴度及比生产率均显著提高。此表明单独之Slyl或Mimc-18之异源 表达足以增强MCP-I分泌。然而，两种蛋白之异源表达以组合形式联合地以协同方式在瞬 间以及稳定转染之细胞株中增强总体胞吐作用。实施例12 :SM蛋白增强人类细胞的HRP分泌。为解决SM蛋白过度表达是否亦可用以在非啮齿动物细胞、尤其人类细胞中增强 分泌性转运之问题，我们使用了编码分泌型辣根过氧化物酶(ssHRP)之质粒，其可用作组 成型蛋白分泌之报道物。人类纤维肉瘤细胞株(HT1080，ATCC CCL-121)以编码ssHRP的表达质粒，与空载 体(MOCK对照物)或编码Slyl (SEQ ID NO. 41)、Munc 18 (SEQ IDN0. 39)或两种蛋白作为双 顺反子表达单元之表达构建体来共转染。转染后24小时及48小时，自细胞培养物上清取 样，分析过氧化物酶活性。在测量之后，将细胞用胰蛋白酶消化，计数以测定细胞之比生产率。在24小时之后，可在表达Muncl8或Muncl8与Slyl两者之细胞中侦测到与对照 细胞相比ssHRP分泌之略微增强(图9)。在转染后48小时，与mock对照物相比，所有表达 SM蛋白之细胞均展示提高之ssHRP滴度(图9)。在MimclS转染的细胞的试样中测量到最 高值，其HRP活性比对照试样提高约1. 4倍。经MimclS或Slyl或两种SM蛋白转染的细胞 与对照细胞相比，比生产率亦显著提高(图9)。此证实，两种SM蛋白均功能性表达，且增强人类细胞的蛋白分泌。参考文献清单Ansel, H. 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权利要求
一种在细胞中产生目标异源蛋白的方法，其包括a)增加至少一种基因的表达，所述基因编码来自SEC1/Munc18群(SM蛋白)的蛋白，及b)实现该目标异源蛋白的表达。
2.权利要求1之方法，其中在步骤b)中该目标异源蛋白的表达增加，优选在步骤b)中 该目标异源蛋白的分泌增加。
3.权利要求1或2之方法，其中步骤a)中的一个基因编码三种MimclS同工型 (isoforms) :Muncl8a、b 或 c 中的一种，优选为 Munc 18c (SEQ ID NO 39)。
4.权利要求1或2之方法，其中步骤a)中的一个基因编码Sly-I(SEQ IDNO :41)。
5.权利要求1或2之方法，其中步骤a)包含增加至少两个编码SM-蛋白的基因的表 达，其中所述SM蛋白参与小泡转运的两个不同步骤。
6.权利要求5之方法，其中a)一个基因编码能调节小泡与细胞膜融合的SM蛋白，b)第二基因编码能调节小泡与高尔基复合体融合的SM蛋白。
7.权利要求5 或 6 之方法，其中 Muncl8c(SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ IDNO 41)的 表达增加。
8.权利要求1或2之方法，其中步骤a)包含i)增加编码该SM蛋白家族之一个成员的第一基因之表达， )增加编码该SM蛋白家族之另一成员的第二基因之表达，及iii)增加编码XBP-I之第三基因的表达。
9.权利要求8 之方法，其中 Muncl8c(SEQ ID NO :39)、Sly-I (SEQ ID NO :41)及 XBP-I (SEQ ID NO 43)之表达增加。
10.一种细胞工程化之方法，其包含a)将一或多种载体系统引入细胞中，所述载体系统包含编码至少两种多肽之核酸序 列，其中i)至少一种第一核酸序列编码SM-蛋白，及 )第二核酸序列编码目标蛋白，b)表达该目标蛋白及该至少一种SM-蛋白。
11.权利要求10之方法，其中该SM-蛋白为Munc-18同工型之一，优选为Munc-18c(SEQ ID NO :39)，或 Sly-I (SEQ ID NO :41)。
12.权利要求10之方法，其中在步骤a)i)中组合使用两种SM-蛋白，其中所述SM蛋白 参与小泡转运的两个不同步骤。
13.权利要求12之方法，其中a)一个基因编码能调节小泡与细胞膜融合的SM蛋白，b)第二基因编码能调节小泡与高尔基复合体融合的SM蛋白。
14.权利要求13之方法，其中组合使用的两种SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO 39)及 Sly-KSEQ ID NO 41)。
15.权利要求10或12之方法，其中在步骤a)i)中两种SM-蛋白与XBP-I组合使用。
16.权利要求15之方法，其中所述SM蛋白为Munc-18c(SEQID NO :39)及Sly-I (SEQ ID NO 41)与 XBP-I (SEQ ID NO 43)组合。
17.权利要求1-16中任一项之方法，其中该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最 优选为哺乳动物细胞。
18.权利要求1-17中任一项之方法，其中该目标蛋白为治疗用蛋白。
19.权利要求18之方法，其中该目标蛋白为抗体或抗体片段。
20.一种表达载体，其包含编码至少两种多肽的表达单元，其中a)至少一种多肽为SM-蛋白，及b)第二多肽为目标蛋白。
21.权利要求20之表达载体，其中该目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。
22.权利要求20或21之表达载体，其中所述表达单元为多顺反子，优选为双顺反子。
23.权利要求20-22之一的表达载体，其中该SM-蛋白为Munc-18同工型Munc_18a、 b、c 之一，优选为 Munc-18c(SEQ ID NO :39)。
24.权利要求20-22之一的表达载体，其中该SM-蛋白为Sly-1(SEQIDNO :41)。
25.权利要求20-24之一的表达载体，其中组合使用至少两种SM-蛋白。
26.权利要求25之表达载体，其中该载体包含至少一个配置如下之双顺反子表达单元a)编码SM蛋白之基因，b)IRES组件，及c)编码SM蛋白之第二基因。
27.权利要求20-26之一的表达载体，其中至少两种SM-蛋白与XBP-I组合使用，优选 为 Munc-18c (SEQ ID NO 39)及 Sly-I (SEQ ID NO 41)与 XBP-1 (SEQ ID NO 43)组合。
28.一种细胞，其表达至少两种异源基因a)至少一种基因编码SM-蛋白，及b)另一基因编码目标蛋白。
29.权利要求28之细胞，其中该目标蛋白为治疗用蛋白，优选为抗体或抗体片段。
30.权利要求28或29之细胞，其中该SM蛋白之表达量显著高于内源表达量，优选高 10%。
31.权利要求28-30之一的细胞，其包含权利要求20至27的任一表达载体。
32.权利要求28-31之一的细胞，其中该细胞为真核细胞，优选为脊椎动物细胞，最优 选为哺乳动物细胞。
33.权利要求32之细胞，其中该细胞为CHO细胞，优选为CHODG44细胞。
34.一种目标蛋白，优选为抗体，其藉由权利要求1至19中任一项之方法所产生。
35.一种药物组合物，其包含化合物及可药用载剂，所述化合物适用于阻断或降低一或 多种SM-蛋白之活性或表达。
36.权利要求35之药物组合物，其中该化合物为多核苷酸序列。
37.权利要求36之药物组合物，其中该多核苷酸序列为shRNA、RNAi、siRNA或反 义-RNA，优选为shRNA。
38.权利要求35-37之一的药物组合物，其中该SM-蛋白为Munc-18c(SEQ ID NO 39) 或Sly-I (SEQ ID NO 41)或该两者之组合。
39.鉴别SM-蛋白功能的调节剂的方法，其包含a)提供至少一种SM-蛋白，优选为Munc-18c，b)使步骤a)之该SM-蛋白与测试剂接触，c)测定与增加或减少蛋白分泌或细胞表面蛋白表达相关的效应。
40.治疗癌症、自身免疫病及炎症的方法，包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权 利要求35-38之一的药物组合物。
41.抑制或减少细胞增殖或迁移的方法，包括将所述细胞与权利要求35-38之一的药 物组合物接触。
42.SM-蛋白或编码SM-蛋白之多核苷酸在活体外细胞或组织培养系统中增加目标蛋 白的分泌及/或生成的用途。
43.权利要求1-42之一的方法，表达载体，细胞或药物组合物的诊断用途。全文摘要
本发明系关于细胞培养技术之领域。其描述一种藉由异源表达Munc18c、Sly1或其它SM蛋白家族成员来增强蛋白在真核细胞中分泌性转运的新颖方法。此方法尤其适用于产生具有增强之制造能力之最优化宿主细胞系统以表达及制造重组蛋白产物。
文档编号C12N15/113GK101903529SQ200880122185
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月20日
发明者乔伊·M·斯图茨, 劳尔·弗洛林, 埃里克·贝克, 希托·考夫曼, 彭仁旺, 马丁·弗森尼格 申请人:贝林格尔英格海姆法玛两合公司