专利名称：干酪乳杆菌副干酪亚种作为抗真菌剂的用途的制作方法
干酪乳杆菌副干酪亚种作为抗真菌剂的用途本发明涉及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)用于保护乳制品免于产生霉菌的 用途。几千年来就知道选择微生物用于改善食品贮存。在这些微生物中，可提及的是乳 酸菌，其广泛用于保存旨在用作人类食物或动物饲料的乳制品、肉制品或植物来源的产品。 利用乳酸菌改善食品贮存在很大程度上是基于它们在发酵过程中产生乳酸及其它有机酸 的能力，乳酸及所述其它有机酸通过降低介质的PH、使其不利于不期望之微生物(细菌和 霉菌)的生长和/或其对这些微生物具有直接毒性作用而抑制这些微生物的生长。除了这 些有机酸之外，某些乳酸菌还产生抗真菌和/或抗菌物质，比如过氧化氢、双乙酰或乳酸链 球菌肽(nisine)。申请EP 0221499描述了干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus)NRRL-B-15972的抗真菌性质。当在补充有黄瓜汁的琼脂培养基上培养该细菌 时，其能够完全抑制橄榄色毛壳霉(Chaetomiumolivacium)的生长，以及部分抑制土曲霉 (Aspergillus terreus)和轮枝孢霉属物种(Verticillium sp.)的生长。另一方面，在这 些条件下，其对草酸青霉(Penicillium oxalicum)的生长没有影响；然而，在pH约为3. 7 的黄瓜汁中培养该细菌时，观察到其对该微生物的抑制作用。申请EP 0576780描述了干酪乳杆菌鼠李糖亚种LC-705的抗真菌作用。利用 补充有酪蛋白水解产物和酵母提取物的基于乳清(lactoserum)的培养基获得的该细菌 的培养物可以抑制青霉菌属(Penicillium)、分支孢子菌属(Cladosporium)、镰刀菌属 (Fusarium)和念珠菌属(Candida)的生长。PCT 申请 WO 97/36603 描述了干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei ssp. Casei)N94/49432的抗真菌作用。利用补充有酵母提取物的合成培养基获得的该细菌的培 养物对链格孢属(Alternaria)、Chaetomtum、分支孢子菌属、刺盘孢属(Colletotrichum)、 小克银汉霉属(Cunninghamella)、Dothiorella、地丝菌属(Geotrichum)、莲点霉属 (Phoma)和Phomopsis有抗真菌作用。申请EP 1308506 描述了詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)与某些干 酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus casei ssp. paracasei)菌株之组合的抗真菌和抗细 菌作用。现在，本发明人注意到当单独使用干酪乳杆菌副干酪亚种细菌时，即不与其它抗 真菌细菌特别是詹氏丙酸杆菌组合时，其具有抗真菌活性(特别是对于青霉菌属的霉菌)。该抗真菌活性显示出下述特征当利用合成培养基培养干酪乳杆菌时，不产生抗真菌活性，但是当利用乳培养基 或基于乳的培养基(milieu abase de lait)上培养时，显示出从培养5小时开始产生抗真 菌活性。在发酵24至48小时后达到其最大值。其对PH敏感。其在PH低于4时消失，但是如果PH重新上升到高于4，则其再次产生。其还对热敏感。在60°C热处理1小时后，其消失。
而且，其既不与有机酸(例如山梨酸、丙酸或苯甲酸(已知它们具有抗真菌活性)) 的产生相关，也不与过氧化氢的产生相关，在具有抗真菌性质的干酪乳杆菌副干酪亚种的 培养物中检测不到这些物质。本发明的目的是干酪乳杆菌副干酪亚种细菌赋予发酵乳制品以抗真菌性质的用 途。特别地，本发明的目的是用于抑制发酵乳制品中子囊菌类的霉菌(特别是青霉 菌属的霉菌)的方法，其特征在于其包括在干酪乳杆菌副干酪亚种细菌存在下，将乳基质 (substrat laitier)发酵足以在该基质中出现抗真菌活性的一段时间。在发酵后所述制品 被所述霉菌污染情况下，该抗真菌活性具有抑制所述霉菌生长的作用。有利地，对于所述发酵而言，接种所述乳基质的所述干酪乳杆菌副干酪亚种之细 菌的量为至少IO6Cfu/克乳基质，优选为至少IO7Cfu/克乳基质，有利地为IO7至IO8Cfu/克 乳基质。根据本发明方法的一个优选的实施方案，所述乳基质的发酵进行至少5小时，优 选至少15小时，更优选地24至48小时。为了使用短的发酵时间获得抗真菌活性，优选使 用相对大量的干酪乳杆菌副干酪亚种；例如，为了观察所述乳基质发酵5小时后的抗真菌 活性，按照至少IO7Cfu/克乳基质的比例进行接种。根据本发明方法的另一个优选的实施方案，如果需要，其包括调节发酵基质的pH 至高于4、优选4至6. 5之间的值。有利地，所述干酪乳杆菌副干酪亚种细菌为CNCM 1-1518菌株的细菌。该菌株特 别描述于申请EP0794707中；根据布达佩斯条约的规定，其于1994年12月30日保藏于巴 黎Docteur Roux大街25号的CNCM(国家微生物培养物保藏中心，Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes)。根据下述阐述干酪乳杆菌副干酪亚种菌株抗真菌活性之实施例的进一步说明，本 发明将得到更好地理解。实施例1 在干酪乳杆菌副干酪亚种存在下证实发酵乳制品的抗真菌活性用 下述6种真菌，按照IO2个孢子的比例接种包含干酪乳杆菌副干酪亚种的发酵乳制品 (Actimel ,包含CNCM 1-1518菌株与嗜热链球菌(S. thermophilus)和保加利亚乳杆菌 (L. bulgaricus)的组合)以及包含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的发酵乳制品(对照) 卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)(测试2个菌株)；白霉菌(Mucor plumbeus)；扩展 青霉菌(Penicillium expansum)；娄地青霉菌(Penicillium roqueforti)；短密青霉菌 (Penicillium brevicompactum)。这些物种是鲜奶制品中通常遇到的代表性污染物。然后，在10°C孵育该制品，每7天检查真菌生长菌体的外观。对于Aetimel 而言，从第14天开始，以及对于对照制品而言从第7天开始，在这 两种制品上都观察到毛霉菌属物种的大量产生。另一方面，对Aetimel 而言，在孵育40天 后观察到青霉菌极低地生长(聚集体)或缺少可见的生长，而仅在14天中就观察到了对对 照产品表面的侵入(envahissement)。在又一系列试验中，利用源自抗菌谱技术的技术评价了 CNCM 1-1518菌株的抗真 菌活性。其包括将测试制品混入琼脂(80%的产品+20%的琼脂溶液(15g/l))中，并将该混合物倒入培养皿中。将3个无菌纸盘放置在固化培养基上，并将100个测试霉菌的孢子(扩展青霉菌 LMSA 00 083)置于该盘上。在25°C和10°C孵育该培养皿。定期测量真菌菌体的直径。所测试制品如下Actimel ; Actimel 与嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的 乳混合物，不含CNCM 1-1518菌株；不含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的Actimel 的乳 混合物，在CNCM 1-1518菌株存在下发酵24小时。将每个测试条件下两次测试的结果列在下表I中。表 I
孵育后的菌体直径(mm)在10。，17天后的菌 体直径(mm)在10。，24天后的菌 体直径测试1 在25T下8天测试2 在25C下7天测试1测试2测试1测试2标准 Actimel (市售)17.6 ± 4.419.2 ±4.89.6 土 0.510 ± 0.910.9 ± 0.812.9 士 1.8Actimel ,不 含干酪乳杆菌>65>65>65>65>65>65
Actimel 的乳混合物，在不存在嗜热W菌和保加利亚9.4 ±18.8 ±111.4 ± 115.1 ± 1.214.1 ± 0.917.2 ± 1.2乳杆菌下，其与干酪乳杆菌发酵24小时与不含有CNCM 1-1518菌株的制品(不含有干酪乳杆菌的Actimel 的乳混合
物)不同，包含CNCM 1-1518菌株的两种制品(Actimel ;以及Actimel 的乳混合物，
其在不存在嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌下与干酪乳杆菌发酵24小时)显示出抗真菌活 性。实施例2 用干酪乳杆菌副干酪亚种发酵期间抗真菌活性的表观动力学对由脱脂乳组成的混合物进行抗真菌活性测试，所述脱脂乳补充有2%的葡萄糖
5和6%的乳蛋白(常规脱脂乳蛋白)，用107CfU/ml的冷冻干燥形式的CNCM 1-1518菌株接 种。在用CNCM 1-1518接种之前和之后收集混合物样品，然后在发酵15小时、24小时、48 小时和72小时后收集混合物样品。在测试抗真菌活性之前，以IOkG照射所收集并冷冻的 样品以阻止细菌产生，从而防止其在测试期间生长和代谢。预先解冻该测试样品，将样品的 PH调节至6. 2 (起始混合物的pH)。如上述实施例1所述进行测试。这些测试的结果(菌体直径的测量值)显示在下表II中。术语“盘上有菌体”和 “聚集体”是指仅在盘上观察到的真菌生长的痕迹。表 II在25 °C下测试7天
未接种的混合物混合物+干路孔杆菌TOT15hT24hT48hT72 h
36.8mm 士 10.222.5mm 土 3.119.3mm 士 2.7聚集休聚集体聚集体在10°C下测试19天
未接种的混綠混合物+干酪乳杆菌TOT15hT24hT48hT72h48.5mm ±1.913.8mm 士 3.3盘上有菌体聚集体聚集体聚集体这些测试显示了抗真菌活性的早期表现，其有时在接种早期似乎就微弱地存在， 但是仅从发酵后15小时开始就很明显，并且在24小时至48小时之间达到最大值。在48 小时、甚至在72小时后，只要pH高于4，该活性就仍存在。实施例3 抗真菌活性的pH敏感性在与上述实施例2相同的条件下进行抗真菌活性测试，但是在测试前未调节pH。结果显示在下表III中。表 III未接种的混 合物混合物+干酪乳杆菌TOT15hT24hT48hT72hpH6.326.015.634.83.943.7533.2 ± 2.512.8 ± 1.3聚集体聚集体34.3 ± 11.425.2 士 2.1这些结果表明当pH低于4时抗真菌能力削弱了。然而，这种削弱似乎是可逆的，因为如果pH回到高于4的值时，抗真菌能力即得以恢复。实施例4 发酵培养基对抗真菌活性的影响为了确定抗真菌活性是否与培养基有关系，使用下述物质作为培养基进行测试 首先是在实施例2中描述的乳混合物，其次是具有下述组成的合成培养基10g/L蛋白胨， 10g/L肉提取物；5g/L酵母提取物；2g/L磷酸二钾；2g/L柠檬酸铵；0. lg/L硫酸镁；0. 05g/ L硫酸锰；20g/L葡萄糖；吐温80 =Iml ；加至IL的适量去离子水。用冷冻干燥形式的IO7Cfu/ ml的CNCM 1-1518菌株接种这些培养基。在培养24和48小时后，如实施例2所述测试抗 真菌活性，在25°C下测试7天后的抗真菌活性，在10°C下测试20天的抗真菌活性。当利用所述乳混合物进行培养时，观察到真菌生长完全被抑制，其与测试温度无 关。另一方面，当在合成培养基上进行等同细菌群落的培养时，未观察到抑制。
权利要求
干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus casei ssp.paracasei)细菌用于赋予发酵乳制品以抗真菌性质的用途。
2.抑制发酵乳制品中产生子囊菌类霉菌的方法，其特征在于，其包括在干酪乳杆菌副 干酪亚种细菌的存在下，使乳基质发酵足以在该基质中出现抗真菌活性的一段时间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，对于所述发酵，接种所述乳基质的所述干酪 乳杆菌副干酪亚种细菌的量为至少IO6Cfu/克乳基质。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，对于所述发酵，接种所述乳基质的所述干酪 乳杆菌副干酪亚种细菌的量为至少IO7Cfu/克乳基质。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于所述乳基质的发酵进行至少5 小时。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，如果需要，其包括调节所述发 酵基质的PH至高于4的值。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌副干酪亚种细 菌为CNCM 1-1518菌株的细菌。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，特征在于所述子囊菌类的霉菌属于青霉菌jM ο
全文摘要
本发明涉及干酪乳杆菌副干酪亚种用于赋予发酵乳产品以抗真菌性质的用途，特别是用于抑制所述产品中子囊菌类霉菌生长的用途。
文档编号A23C9/123GK101917861SQ200880123913
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月3日 优先权日2007年12月4日
发明者伊夫·蒂里利, 凯瑟琳·洛伊桑斯-帕鲁, 贝诺伊特·富尔曼, 路易斯·佩里尔 申请人:达能日尔维公司