多重基因组获得和丢失分析的制作方法

专利名称：多重基因组获得和丢失分析的制作方法
技术领域：
本文描述的技术大体涉及核酸检测用方法和组合物。更具体而言，所描述的是基 因组DNA多重分析用方法和组合物。
背景技术：
基因组获得和丢失检测用分析可以对构成疾病、行为和认知病症以及其他遗传病 变的病因的遗传性异常进行检测和诊断。需要一种针对染色体获得和丢失的编码小球多重 分析，所述分析可提供以BACDNA作为探针材料的益处，而没有小球交联或其他分析性能问题。

发明内容
一种分析DNA样本的方法包括提供第一编码颗粒系列，该编码颗粒系列自身包含 连接有扩增子的编码颗粒。所述扩增子包含合在一起基本上代表完整的第一种模板DNA序 列的随机核酸序列。所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样本DNA以及可检 测地标记的参照DNA杂交。检测指示所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样 本DNA特异性杂交的第一信号。检测指示所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记 的参照DNA特异性杂交的第二信号。比较所述第一信号和第二信号，以检测所述第一信号 和所述第二信号之间的差异，所述第一信号和第二信号之间的差异指示所述样本DNA和所 述参照DNA之间的差异。任选地，所连扩增子的长度范围为约500-1200个核苷酸，包括端值。可检测地标记的样本DNA可以是获自受试个体的DNA，如基因组DNA。在本文所述 方法的具体实施方案中，受试者为人。本文所述方法的各实施方案还包括提供第二编码颗粒系列，该编码颗粒系列含有 连接有扩增子的编码颗粒。所述第二编码颗粒系列的扩增子包含合在一起基本上代表完整 的第二种模板DNA序列的DNA序列。所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样 本DNA以及可检测地标记的参照DNA杂交。检测指示所述第二编码颗粒系列的扩增子与可 检测地标记的样本DNA特异性杂交的第一信号。检测指示所述第二编码颗粒系列的扩增子 与可检测地标记的参照DNA特异性杂交的第二信号。比较所述第一信号和第二信号，以检 测所述第一信号和所述第二信号之间的差异，所述第一信号和第二信号之间的差异指示所 述样本DNA与所述参照DNA之间的差异。在具体的实施方案中，所述第一和第二编码颗粒系列以混合物的形式提供。使用
5各编码颗粒系列的混合物的方法的实施方案还包括将各颗粒系列的编码情况与所检测到 的信号联系起来，从而将与具体的模板DNA相关的信号与样本DNA和参照DNA之间的差异 联系起来。与各编码颗粒系列相连接的扩增子均包含合在一起基本上代表完整的模板DNA 序列的随机核酸序列。在具体的实施方案中，所述完整的模板DNA序列比各个连接的扩增 子都要大。在一个具体的实例中，所述完整的模板DNA序列的长度范围为约20-300kb，包括 端值，并且各个连接的扩增子包含与模板DNA序列的一部分相同的核酸序列，其长度范围 为约500-1200个核苷酸(包括端值)。描述了一种制备用于分析DNA的编码小球系列的方法，所述方法包括a)使用DNA 模板和第一种反应寡核苷酸引物进行第一扩增反应。在该反应中，多个所述第一种反应引 物中的每一个都包含一段可变的非特异性简并DNA序列和一段毗邻的恒定DNA序列。所述 第一反应的反应产物含有第一扩增子，其中各个第一扩增子均包含一段与所述DNA模板的 一个随机部分相同的DNA序列以及一段与所述第一种反应引物的所述恒定DNA序列相同的 DNA序列。在方法中还包括b)使用所述第一扩增子的至少一部分作为模板DNA，并使用第 二种反应寡核苷酸引物进行第二扩增反应。所述第二种反应寡核苷酸引物包含所述第一 种反应引物的所述恒定DNA序列，且所述第二扩增反应产生含有第二扩增子的第二反应产 物。各个第二扩增子均含有一段与所述DNA模板的一个随机部分相同的DNA序列以及一段 与所述第一种反应引物的恒定DNA序列相同的DNA序列。还包括c)将所述第二扩增子与 第一种多个编码颗粒相连，从而产生用于分析DNA的编码颗粒系列。任选地，所述第二种反应寡核苷酸引物还含有用于与编码颗粒反应的官能团。例 如，可以含有5'端胺。在其他实施方案中，重复a)-c)但其中使用第二种DNA模板并将由此获得的第二 种扩增子与第二种多个编码颗粒相连，所述第二种多个编码颗粒与所述第一种多个编码颗 粒具有可检测差异。通过该方法形成用于分析DNA的第二编码颗粒系列。在又另外的实施 方案中，重复a)-c)但其中使用第三种、第四种、第五种或后续的基因组DNA模板，并将由此 产生的第三种、第四种、第五种或后续的扩增子与第三种、第四种、第五种或后续的多个编 码颗粒相连，从而得到用于分析DNA的第三种、第四种、第五种或后续的编码颗粒，所述第 三种、第四种、第五种或后续的多个编码颗粒中的每一种均以可检测方式不同于其他各种 多个编码颗粒。无意于限制使用不同的DNA模板可以形成的编码颗粒系列的数目。可形成 任何数目的编码颗粒系列。而且，可以混合任何合适数目的编码颗粒系列来产生多重DNA 分析试剂。本文描述了一种用于分析DNA的试剂，所述试剂包括连接有由模板DNA序列扩增 得到的扩增子的多个编码颗粒。各个连接的扩增子均包含一段与所述模板DNA序列的一 个随机部分相同的DNA序列，其中所述扩增子合在一起基本上代表完整的模板DNA，并且其 中各个扩增子的与模板DNA序列的一个随机部分相同的所述DNA序列比所述完整的模板 DNA序列要短。例如，在具体的实施方案中，所述完整的模板DNA序列的长度范围可以是约 20-300kb,包括端值，并且各个连接的扩增子均含有与所述模板DNA序列的一个随机部分 相同的一段DNA序列，其长度范围为约500-1200个核苷酸，包括端值。本文所描述的用于分析DNA的多重试剂包括两种或者更多种多个编码颗粒的混
6合物，这样编码使得每种多个颗粒的颗粒均可检测地区别于其他各种多个颗粒的颗粒。所 述编码颗粒连接有由模板DNA序列扩增得到的扩增子，并且，将各种多个编码颗粒的每一 种相比，所述每种多个编码颗粒均连接有由不同的模板DNA序列扩增得到的扩增子。而且， 各个连接的扩增子均包含一段与所述模板DNA序列的一个随机部分相同的DNA序列。提供了一种用于分析DNA的试剂盒，其含有编码颗粒系列和/或两个或者更多个 编码颗粒系列的混合物。


图1是示出一个实施方案的流程图，该实施方案包括使用两个扩增反应由模板 DNA制备扩增子，并将扩增子作为探针固定于一系列编码小球上，其中该系列中的小球均具 有相同的ID代码；图IA是示出一个实施方案的流程图，该实施方案包括由单个BAC克隆制备BAC扩 增子，并将该扩增子作为探针固定到一系列编码小球上，从而形成一个小球系列，其中该系 列中的小球全都具有相同的ID代码；图2是示出一个实施方案的流程图，所述实施方案包括混合m个不同的编码小球 系列，各系列均具有其各自被固定的BAC-扩增子探针DNA，它们合在一起形成多重编码小 球系列；图3是示出一个实施方案的流程图，所述实施方案包括使用多重编码小球系列在 η个样本上进行多重基因组获得和丢失分析；图3Α为示出一个实施方案的流程图，所述实施方案包括使用多重编码小球系列 在η个样本上进行多重基因组获得和丢失分析；图4为SBS标准的96孔微孔板的模式图，其示出平行地对46份样本运行分析的 两份对照和两份样本的示例性位置；图5为使用男性的13号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本所形成的数据 的一个实例；图6为使用男性的18号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本所形成的数据 的一个实例；图7为使用女性的21号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本所形成的数据 的一个实例；图8为使用具有X染色体5拷贝扩增的Coriell DNA样本所形成的数据的一个实 例；和图9为一张图表，其示出用于在示例性分析中形成固定到编码小球上的扩增子的 BAC克隆、其染色体和cyto条带(cytoband)位置、阴性对照寡核苷酸的序列和固定有各扩 增子探针的小球系列的小球ID (Luminex小球区)。
具体实施例方式本申请提供了与针对染色体获得和丢失的编码颗粒多重分析相关的方法和组合 物。本文使用的科技术语旨在具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。这
7些术语在多部权威的参考书中被定义和使用，所述参考书例如包括J. Sambrook md D. W. RusselljMolecular Cloning :ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed.，2001 ；F. Μ. Ausubel, Ed.，Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002 ；B.Alberts et al.，Molecular Biologyof the Cell，4th Ed.，Garland，2002 ；D. L. Nelson and Μ. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed.，W. H. Freeman &Company，2004 ； 禾口 Herdewi jn，P. (Ed.)， Oligonulceotide Synthesis :Methods and Applications， Methods in Molecular Biology, HumanaPress，2004。本文所使用的术语“核酸”是指任何形式的具有多于1个核苷酸(包括单链、双链 的寡核苷酸或多核苷酸)的RNA或DNA分子。试剂组合物提供了一种用于分析基因组DNA的试剂，其包括连接有作为探针的扩增子的多个 编码颗粒。连接在所述多个编码颗粒上的扩增子每一个均含有与模板基因组核酸的一部分 相同或者完全互补的一段核酸序列，并且所述扩增子合在一起基本上代表完整的模板基因 组核酸。图1示出制备用于分析基因组DNA的试剂的方法的一个实施方案。如图1所示，提 供一个模板核酸(1)。使用简并寡核苷酸引物(DOP)在第一扩增反应中扩增所述模板(2)， 从而产生第一扩增产物。所述模板核酸可以是能够使用核酸扩增方法被复制的任何核酸。用于所述第一扩增反应的模板DNA任选地为基因组DNA，其大小范围通常为约 20-300kb，但是该模板也可以更小或者更大。术语“基因组的”指细胞或者生物体的基因组 的DNA，其不仅包括由细胞或者生物体的基因组的DNA复制得到的DNA，如克隆得到的DNA， 还包括从细胞或生物体直接分离得到的DNA，如显微切割的染色体DNA。模板DNA可以包括 全部的或者部分的细胞或者生物体基因组。模板DNA可以包括表现为一个或者多个染色 体、染色体的一部分、基因座、基因或基因的一部分的DNA。模板DNA可以为任何形式，如载 体中的插入物，例如包括细菌人工染色体、酵母人工染色体、人的人工染色体、黏粒、质粒、 噬菌粒、噬菌体DNA或F黏粒。模板DNA可以是经显微切割的染色体DNA的形式。因此，尽 管本文描述的具体实例是以BAC作为模板DNA来源，但是也可以使用其他类型的克隆，如 PAC、YAC、黏粒、F 黏粒、cDNA 等。模板基因组DNA的获得是通过本领域已知的方法实现，例如描述于以下文献 中的方法J. Sambrook and D. W. Russell, MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress ；3rd Ed. ,2001,或者 F. Μ. Ausubel, Ed. , Short Protocols inMolecular Biology, Current Protocols ；5th Ed· ，2002。DNA
买获得和/或使用用于分离基因组DNA的商用试剂盒获得。使用体外扩增方法可以实现对模板DNA的扩增。术语“扩增方法”指这样一种方 法或技术，即所述方法或技术用于复制模板核酸，由此产生包括全部的或者部分的模板核 酸的多个拷贝的核酸，所产生的核酸也称为扩增子。扩增子任选地含有存在于引物中但不存在于原始DNA模板中的核酸序列。这些引 物来源的核酸增加了功能性，例如用于其他扩增反应的引物结合位点，和/或与底物进行
8化学键合的官能团。举例而言，扩增方法包括PCR、连接反应介导的PCR(LM-PCR)、phi_29PCR和其他 核酸扩增方法，例如，如 C. W. Dieffenbachet al. , PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press,2003 ；禾口V. Demidov et al. ,DNA Amplification Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004 中所述。可以使用具体的DNA模板来源和核酸扩增方法的多种结合。术语“寡核苷酸引物”指能够在合适的反应条件下担当引物延伸产物合成的起始 位点的核酸。寡核苷酸引物的长度通常为约10-30个连续的核苷酸。寡核苷酸引物与模板 核酸的一个区域完全互补或者基本互补，因而使得在杂交条件下，寡核苷酸引物与模板核 酸的互补区域退火。合成引物延伸产物的合适反应条件包括存在合适的反应组分(包括但 不限于聚合酶和核苷三磷酸)。对于适合用于扩增反应中的寡核苷酸引物的设计为本领域 所熟知，例如如 A. Yuryev et al.，PCR Primer Design, Humana Press, 2007 中所述。术语“简并寡核苷酸引物”指含有具有随机或者半随机核苷酸序列的核酸的引物。 对于适合用于具体的核酸扩增反应的简并寡核苷酸引物的设计为本领域所熟知，例如如 A. Yuryev et al.，PCR PrimerDesign,Humana Press，2007 中所述。可以使用具有大约 5—8 个核苷酸的随机或半随机核苷酸序列。在其他实施方案中，随机或半随机核苷酸六聚体包 含在用于第一扩增反应的简并寡核苷酸引物中。在具体的实施方案中所使用的简并寡核苷酸引物每一个均包含一个5'恒定 DNA区段、一个中间随机DNA区段和一个3'锚定区段，例如如Fiegler et al.，Genes Chromosomes Cancer,36 (4) :361_74,2003 ；禾口 Telenius, et al. , Genomics 13 :718_25, 1992中所述。5'恒定DNA区段任选地具有在所有DOP中均相同的核苷酸序列。3'锚 定区段任选地具有这样的核苷酸序列，即所述核苷酸序列经测定在模板核酸中具有所需 出现频率。对具体的核酸序列出现频率的分析为本领域所熟知，例如如Milosavljic， A. and Jurka, J.,1993, Comput. Applic. Biosci. , 9 407-411 ；Pesole, G. et al. ,1992, Nucleic acids, Res. ,20 :2871_2875 ；禾口 Hutchinson, G. B. ,1996, Comput. Appl. Biosci., 12 391-398 中所述。在具体的实施方案中，DOP含有约17-25个连续的核苷酸，其中约7-12个连续的核 苷酸包含于5'恒定DNA区段之中，约5-8个连续的核苷酸包含于随机DNA区段中，约5_8 个连续的核苷酸包含于3’锚定区段中。第一扩增反应产生含有多个扩增子的第一反应产物。第一反应产物中的各个扩增 子均含有与DNA模板的随机部分相同或者完全互补的一段DNA序列以及与第一种反应引物 的5 ‘恒定DNA序列相同的一段DNA序列。本文中使用的术语“互补的”指核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对，具体地指 核苷酸通过氢键彼此键合，胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基相连，而胞 嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键相连。通常，核酸所包含的核苷酸序列被描述为与指定的 第二核苷酸序列具有某一“百分比的互补度”。例如，一段核苷酸序列可以与指定的第二 核苷酸序列具有80%、90%或100%的互补度，这表明一段10个核苷酸的序列中有8个、9 个或者10个核苷酸与所述指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3' -TCGA-5' 与核苷酸序列5' -AGCT-3 ‘ 100%互补。另外，核苷酸序列3' -TCGA-与核苷酸序列
95' -TTAGCTGG-3'的一个区域100%互补或完全互补。参照图1，使用第一反应产物扩增子作为模板DNA进行第二扩增反应(3)。第二扩 增反应⑶，包括“通用”寡核苷酸引物，之所以这样称谓是因为该通用引物与在第一扩增反 应中使用的DOP的5'恒定DNA区段相同或者完全互补。通用寡核苷酸引物包含在第一扩 增反应中使用的DOP的5'恒定DNA区段，所述DNA区段位于该通用引物的3'末端。通用 寡核苷酸引物任选地在其5’末端含有其他连续的核苷酸。在一个具体的可选方案中，在通用寡核苷酸引物的5’端含有一个官能团，用于将 由第二扩增反应产生的扩增子连接至编码固体或半固体基底如编码颗粒。例如，在通用寡 核苷酸引物的5’端含有一个胺基团。在另一个可选方案中，可以对由第二扩增反应产生的 扩增子进行修饰，从而使其含有用于键合至固体或者半固体基底的官能团。修饰核酸从而 使其含有能够键合至固体或者半固体基底的官能团为本领域所熟知。在具体的实施方案中，与颗粒相连的每一个扩增子均含有与模板DNA序列的一个 随机部分相同的一个DNA区段。每一个扩增子均还含有一个恒定DNA区段，所述恒定DNA 区段同所述与模板DNA序列的一个随机部分相同的DNA区段毗邻的。扩增子的恒定DNA区 段任选地含有一个用于连接扩增子与编码颗粒的末端官能团。在一个具体的实施方案中， 扩增子的恒定DNA区段含有一个用于连接扩增子和编码颗粒的5'末端胺基团。如图1所示，将作为第二反应产物的扩增子固定于第一种多个编码颗粒上(4)。第 二扩增反应的扩增子与所述编码颗粒的结合可通过多种可有效地将核酸与固体或者半固 定基底相连的方法中的任何一种来实现，所述方法例如包括吸附和化学键合。扩增子可以 与编码颗粒的材料直接键合，或者与编码颗粒间接键合，例如通过键合至分布于颗粒上的 包衣或接头。可以合成扩增子，并且/或者在合成后对其进行修饰，从而使其含有一个用于 将扩增子键合到颗粒上的官能团。例如，扩增子可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基团、卤素、 酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、环氧基和/或甲苯磺酰基官能团。与扩增子相连的颗粒可以为扩增子可以与之连接的任何固体或者半固体颗粒，该 颗粒适合多重分析，并且在杂交和检测条件下是稳定且不溶的。颗粒可以为任何形状(如 圆柱形、球形等)、尺寸、组成或具有任何理化特征。可以对颗粒尺寸或组成进行选择，从而 使得颗粒可以在例如具有特定孔径的过滤器上或者通过一些其他的物理性质(如磁性)与 流体相分离。所使用的微粒如微球的直径可以小于一毫米，例如，直径的尺寸范围为约0. 1 至约1，000微米(包括端值)，如直径为约3-25微米(包括端值)，或者直径为约5-10 微米(包括端值)。所使用的纳米颗粒如纳米小球的直径可为约1纳米(nm)至约 100, OOOnm(包括端值)，例如，尺寸范围为约10-1，OOOnm(包括端值)，或者例如，尺寸范围 为200-500nm(包括端值)。在某些实施方案中，所使用的颗粒为小球，特别是微球和纳米小 球。举例来说，颗粒为有机或无机颗粒，如玻璃或金属颗粒，并且可以为合成的或者天 然的聚合物的颗粒，所述聚合物如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚硅酮(silicon)、尼龙、纤维素、琼 脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺。在具体的实施方案中，颗粒为乳胶小球。在具体的实施方案中，所使用的颗粒含有用于连接扩增子的官能团。例如，颗粒可 以含有羰基、胺、氨基、羧酸基团、卤素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、环氧基和
10/或甲苯磺酰基官能团。颗粒的官能团、对其的修饰及其与化学部分(如核酸)的连接为 本领域所熟知，例如如 Fitch, R. Μ. , Polymer Colloids :AComprehensive Introduction, Academic Press, 1997中所述。美国专利No. 6，048, 695描述了一种用于将核酸探针如扩增 子连接到基底如颗粒上的示例性方法。在另一个具体的实例中，1-乙基-3_[3-二甲基氨丙 基]碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC化学品)可以用来连接扩增子和编码颗粒。编码颗粒为基于某个特征可以与其他颗粒区分开的颗粒，所述特征例如包括光学 性质如颜色、反射指数和/或压印图案或光学可检测的图案。例如，可以使用光学标签、化 学标签、物理标签或者电子标签来编码颗粒。编码颗粒可以含有一个或者多个荧光团或与 之相连，所述荧光团可以通过例如激发和/或发射波长、发射强度、激发态寿命或这些的组 合、或者其他光学特征进行区分。可以使用光学条形码来对颗粒进行编码。在具体的实施方案中，一个颗粒系列的各颗粒均用相同的代码进行编码，从而使 得一个颗粒系列的各颗粒都可以与另一个颗粒系列的各颗粒区分开。在其他实施方案中， 可以对单个颗粒系列使用两种或者多种代码。例如，各颗粒都可以含有独特的代码。在某 些实施方案中，颗粒编码包括一个代码，但不包括颗粒与对基因组DNA特异的核酸探针之 间的联系，或者兼而有之。在具体的实施方案中，代码镶嵌在例如颗粒内部，或者以在杂交和分析期间稳定 存在的方式与颗粒相连。可通过任何可检测的方式提供代码，如通过全息编码，通过荧光性 质、颜色、形状、尺寸、光发射、量子点发射等，以鉴定颗粒，并由此鉴定固定于其上的捕获探 针。在一些实施方案中，代码不是由核酸提供的。一个示例性平台利用浸渍于聚合物颗粒内的荧光染料的混合物，作为鉴定固定有 特定俘获探针的颗粒系列的每个成员的工具。另一个示例性平台使用全息条码来鉴定圆 柱形玻璃颗粒。例如，Chandler等人(美国专利No. 5，981，180)描述了一种基于颗粒的 系统，其中不同的颗粒类型由不同比例的两种或多种浸渍于聚合物颗粒内的荧光染料的混 合物编码。Soini (美国专利No. 5，028，545)描述了一种基于颗粒的多重分析系统，该系 统采用时间分辨荧光进行颗粒鉴定。Fulwyler(美国专利No. 4，499，052)描述了一种使 用通过颜色和/或尺寸区分的颗粒的示例性方法。美国专利申请公开文本20040179267、 20040132205、20040130786、20040130761、20040126875、20040125424 和 20040075907 描述 了由全息条码编码的示例性颗粒。美国专利No. 6，916，661描述了与纳米颗粒有关的聚合 物微粒，所述纳米颗粒具有为颗粒提供代码的染料。尽管本文详细描述的一个实施方案利用的是Luminex编码小球平台，但是也可以 使用其他类型的编码颗粒分析平台，如VeraCode小球和BeadXpress系统(Illumina Inc.， San Diego CA)、xMAP 3D (Luminex)等。可以使用磁性Luminex小球，该小球使得可以使用 板状磁铁和移液管而不使用过滤板和多头抽真空装置进行洗涤步骤。这其中的每一个平台 通常都以羰基小球的形式提供，但是也可以对其进行构建，从而使其含有不同的偶联化学 组成，如氨基-硅烷。通常，作为第二扩增反应的产物的扩增子是双链的，并且该双链的扩增子与颗粒 相连。因此，所述双链扩增子的两条链都呈现于每一个颗粒之上。在将扩增子固定于颗粒 之后使其变性成为单链，以进行制备，从而用于分析方法的具体实施方案中。任选地，在固 定之前使双链扩增子变性，然后将单链的扩增子与颗粒相连。
如所述，第一和第二扩增反应两者中的每一个扩增子均含有与模板DNA序列的一 个随机部分相同的一段核酸序列，结果使由第一扩增反应产生的扩增子合在一起基本上代 表完整的模板DNA序列，由第二扩增反应产生的扩增子合在一起基本上代表完整的模板 DNA序列。用于分析基因组DNA的第一颗粒系列和第一试剂为连接有扩增子的编码颗粒，所 述扩增子是第二扩增反应的产物，其合在一起基本上代表在第一扩增反应中用作模板的完 整基因组DNA序列。在具体的实施方案中，与颗粒相连的每一个扩增子的长度范围为约500-1200个 核苷酸(包括端值)。因此，通过所连的由所述模板扩增得到的相对较小的扩增子，相对较 大的模板核酸基本完整地呈现于一个系列的编码颗粒之上。如上文所述，各颗粒系列均含有连接有扩增子的编码颗粒，所述扩增子是第二扩 增反应的产物，其合在一起基本上代表在第一扩增反应中用作模板的完整基因组DNA序 列。含有扩增子的颗粒数目取决于诸多因素如模板尺寸、扩增子尺寸以及可用于将扩增子 连接到颗粒之上的结合位点的数目，所述含有扩增子的颗粒数目足以使得合在一起基本上 代表在第一扩增反应中用作模板的完整基因组DNA序列。通常，足以使得合在一起基本上 代表在第一扩增反应中用作模板的完整基因组DNA的颗粒数目的范围为约1-10，000 (包括 端值)O使用第二种基因组DNA模板进行扩增并将作为第二扩增反应的产物的扩增子(如 上所述)连接至第二种多个编码颗粒，形成了另外的颗粒系列。所述第二种多个编码颗粒 可检测地不同于所述第一种多个编码颗粒，从而形成用于分析基因组DNA的第二编码颗粒 系列和第二试剂。类似地，将第三种或后续的基因组DNA模板用于形成扩增反应的反应产物，并将 该反应产物连接至第三种或后续的多个编码颗粒。所述第三种或后续的多个编码颗粒的每 一种均可检测地不同于其他每一种的多个编码颗粒，从而获得用于分析基因组DNA的第三 或后续的编码颗粒系列和第三或后续的试剂。多重试剂某些实施方案提供了一种用于分析基因组DNA的多重试剂，所述多重试剂包含两 个或多个颗粒系列的混合物。在具体的实施方案中，每一编码颗粒系列的各个编码颗粒均 可检测地区别于其他每一编码颗粒系列的各个编码颗粒。每一编码颗粒系列均连接有扩增 子，所述扩增子为如本文所述的第二扩增反应的产物，并且合在一起基本上代表在第一扩 增反应中用作模板的完整基因组DNA序列，其中其他各编码颗粒系列相连的扩增子代表另 外不同的基因组模板。一个具体实施方案的一种多重试剂包括连接有扩增子的第一编码颗粒系列和连 接有扩增子的第二编码颗粒系列，所述与第一编码颗粒系列相连的扩增子合在一起基本上 代表插入第一细菌人工染色体中的完整模板DNA序列，而所述与第二编码颗粒系列相连的 扩增子合在一起基本上代表插入第二细菌人工染色体中的完整模板DNA序列。例如，与第一编码颗粒系列相连的扩增子含有与人13号染色体DNA的一部分相同 的核酸序列，而与第二编码颗粒系列相连的扩增子含有与人18号染色体DNA的一部分相同 的核酸序列。与第三或后续的编码颗粒系列相连的扩增子含有与人的另一染色体或染色体
12的另一非重叠区域的DNA相同的核酸序列。本文所描述的多重试剂可以在单个分析中同时分析多个靶标，如多个基因组座位 (genomic loci)0通过至少混合第一编码颗粒系列和第二编码颗粒系列形成用于分析基因组DNA 的多重试剂。图2示出了一种形成多重试剂的方法的一个实施方案。如图所示，任何数目“m” 的编码颗粒系列均可以包含在所述多重试剂中。因此，例如，“m”可以为至少2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或 200 个不同的编码颗粒 系列。一个系列连接有扩增子的编码颗粒与一个或者多个其他系列连接有扩增子的编码颗 粒联合形成用于分析样本中基因组获得和丢失的多重试剂。分析方法分析基因组DNA的方法包括提供连接有扩增子的编码颗粒，所述扩增子合在一起 基本上代表完整的模板基因组核酸。在具体的实施方案中，提供了连接有扩增子的编码颗 粒，所述扩增子合在一起基本上代表不止一个拷贝的完整的模板基因组核酸。准备用于分析基因组获得和/或丢失的基因组DNA样本用可检测标记进行标记。 参照DNA也用可检测标记进行标记，用于与样本DNA进行比较。样本和参照DNA可以用相 同的或者不同的可检测标记进行标记，这取决于所使用的分析安排。例如，在具体的实施方 案中，用不同的可检测标记所标记的样本和参照DNA可以在同一容器中一起使用，用于同 与编码颗粒相连的扩增子杂交。在其他实施方案中，用相同的可检测标记所标记的样本和 参照DNA可以在分开的容器中使用，用于同与颗粒相连的扩增子杂交。术语“可检测标记”指可提供可检测信号并且可以与核酸连接的任何原子或部分 (moiety)。所述可检测标记的实例包括荧光部分、化学发光部分、生物发光部分、配体、磁性 颗粒、酶、酶底物、放射性同位素和生色团。多种标记样本和参照DNA的方法中的任何一种方法均可以用于本分析中，如DNA 的缺口平移或化学标记。例如，通过使用如下的核苷酸进行聚合反应可以弓I入可检测标记， 所述核苷酸包括至少一些经修饰的核苷酸，如修饰后含有生物素、地高辛、荧光素或花菁的 核苷酸。在一些实施方案中，通过随机引物法和聚合反应引入可检测标记。其他实例包括 缺 口平移(Roche Applied Science, IndianapolisInd. ； Invitrogen, Carlsbad Calif.)禾口 化学标记(Kreatech ULS, Amsterdam NL)。对核酸的可检测标记为本领域所熟知，并且可 以使用适合标记基因组DNA的任何标记方法。在又另一个实施方案中，避免用可检测标记对样本和参照DNA单独地进行共价标 记。例如，未标记的基因组DNA样本与固定至编码颗粒的扩增子杂交。事先标记的报告序 列也在与所述扩增子的俘获探针序列相邻但不重叠的序列处与该扩增子_样本DNA复合物 和扩增子_参照DNA复合物杂交。所述经标记的报告序列可以在同一或者不同的杂交反应 中被杂交。通过这种方式，所述经标记的报告序列可以在更大规模的环境中被大量生产，与 在分析时单独地标记每一个样本相比，降低了每个分析的成本。“样本”和“参照”基因组DNA可以获自任何适合的来源。本文描述的具体方法包 括使用受试个体的样本基因组DNA。基因组样本和/或参照DNA可以从几乎任何的组织中 提取，所述组织包括但不限于血液、羊水、实体瘤、活检器官、颊部拭子、绒毛膜绒毛、胚泡和
13卵裂球、妊娠物、唾液、尿液等。从经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的病理学样本提取的 留存样本同样也是利用此方法分析的样本基因组DNA的来源。样本和/或参照基因组DNA 还可以获自体外来源如细胞系。从这些来源或其他来源获得基因组DNA的方法为本领域所 熟知。在具体的实施方案中，就待分析的样本DNA的具体特征来对参照DNA进行表征。 例如，如果打算对样本DNA进行分析，以检测具体基因或染色体座位的复制情况，则对参照 DNA进行表征，从而获知有多少个拷贝的该基因或者座位包含在参照DNA中。通常，使用来 自相同物种的样本和参照DNA。可以使用本文所述的分析来检测或者表征与染色体获得或丢失相关的障碍。先天 的或者天生的障碍包括全部染色体的三体性、较小基因组座位(大约200kb至20mb)的扩 增或缺失以及亚端粒区域或着丝粒区域的扩增或缺失。许多癌症的特征也在于可能与类 型、阶段、药物抗性或治疗响应有关的染色体获得和丢失。可以使用本方法就染色体稳定性 对实验室细胞系(包括干细胞系)进行表征。尽管本文所描述的方法和组合物主要涉及来源于人的核酸，但是可以理解的是， 也可以将本文所述的方法和组合物用于分析来源自许多生物体中的任一种的分析样本基 因组DNA，所述生物体包括但不限于非人类的灵长类、啮齿动物、兔、狗、猫、马、牛、猪、山羊 和绵羊。还可以分析非哺乳动物来源的样本DNA，举例来说，包括鱼和其他水生生物、鸟类、 禽类、细菌、病毒、植物、昆虫、爬行类、两栖类、真菌和分支杆菌。与编码颗粒相连的扩增子与受试个体的可检测地标记的样本基因组DNA杂交，由 此实现所述扩增子DNA与所述可检测地标记的样本基因组DNA的特异性杂交。此外，与编 码颗粒相连的DNA序列与可检测地标记的参照基因组DNA杂交，由此实现所述扩增子DNA 和所述可检测地标记的参照基因组DNA的特异性杂交。术语“杂交”是指互补核酸的配对和结合。出现在两个核酸之间的杂交程度因诸 如核酸的互补程度、核酸的解链温度Tm和杂交条件的严格度等因素而异，正如本领域所 熟知的那样。术语“杂交条件的严格度”指与具体的常用添加剂(如甲酰胺和Denhart’ s 溶液)相关的杂交介质的温度、离子浓度和组成条件。与特定核酸相关的具体杂交条件 的确定是常规的，并且为本领域所熟知，例如如J. Sambrook andD. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ； 禾口 F. Μ· Ausubel, Ed. , ShortProtocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002中所述。高严格度的杂交条件为仅允许基本互补的核酸进行杂交的那些杂交条 件。通常，互补度为约85-100%的核酸被认为是高度互补的，会在高严格度条件下杂交。中 严格度条件的实例有互补度居中(互补度为约50-84%)的核酸以及互补度高的核酸进行 杂交的条件。相反，低严格度的杂交条件为互补度低的核酸进行杂交的那些杂交条件。术 语“特异性的杂交”和“特异性地杂交”是指一具体的核酸与样本中的目标核酸进行杂交， 但基本不与目标核酸之外的核酸杂交。所述分析可以在任何合适的容器中进行。在具体的实施方案中，例如，在准备分析 多个样本时，可以使用多室容器。举例说来，多室容器包括多坑基底，如载玻片、硅片或硅盘 (silicon tray) 0在一些实施方案中，将每个样本放于多孔板不同的孔之中。例如，多孔板 可以是96-孔、384-孔或1024-孔分析板。
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还包括对第一信号的检测以及对第二信号的检测，所述第一信号指示所连接的 DNA序列与受试个体的可检测地标记的基因组DNA的特异性杂交，所述第二信号指示所连 接的DNA序列与可检测地标记的参照基因组DNA的特异性杂交。可以使用任何合适的方法来检测同与编码颗粒相连的扩增子杂交的样本和参照 DNA的可检测标记，举例说来，所述方法包括光谱法、光学法、光化学法、生物化学法、酶学 法、电学法和/或免疫化学法。通过评估一个或者多个可检测标记的信号，可以检测每个颗粒指示杂交程度的信 号。通常对颗粒逐个进行评估。例如，可以使颗粒通过流式细胞仪。示例性流式细胞仪包括 Beckman Coulter 公司(Fullerton Calif.)的Coulter Elite-ESP流式细胞仪或FACScan. TM.流式细胞仪，以及 Cytomation，Inc.，Fort Collins, Colo 的 M0FL0. TM.流式细胞仪。 除了流式细胞术之外，还可以将离心机用作颗粒分离和归类的工具。一个合适的系统为描 述于美国专利No. 5，926，387中的系统。除了流式细胞术和离心之外，还可以将自由流动电 泳装置用作颗粒分离和归类的工具。一个合适的系统为描述于美国专利No. 4，310，408中 的系统。还可以将颗粒置于表面上，并进行扫描或成像。所检测的第一信号指示与编码颗粒相连的DNA序列与受试个体的可检测地标记 的基因组DNA的特异性杂交。同时，检测的第二信号指示与编码颗粒相连的DNA序列与可 检测地标记的参照基因组DNA的特异性杂交。比较所述第一信号和所述第二信号，从而获得有关受试个体的基因组DNA与参照 基因组DNA相比较的信息。在具体的实施方案中，将与一个或者多个颗粒系列的扩增子杂交的参照DNA和样 本DNA的可检测标记的信号比用来评估该样本和参照DNA之间的差异，所述差异指示例如 基因组获得和/或丢失。在某些实施方案中，参照DNA和样本DNA与一个或者多个颗粒系 列的扩增子在同一个容器(如多孔板的一个孔)中杂交。杂交之后，两个标记在一起分析， 即在杂交物中同时检测两个可检测标记，或者，将杂交物分成两个(或者多个)部分，分别 地对每一个部分进行评估，从而对可检测标记进行检测。可以将评估结果用来提供所述两 个可检测标记的信号比。这种方法可以使用竞争性杂交来对各分析之间的任何变异进行标 准化在加入有相同颗粒的同一容器中同时分析参照和实验样本。任选地，可检测地标记的参照DNA和可检测地标记的样本DNA与一个或多个颗粒 系列在不同的容器(如多孔板的不同孔)中杂交。可以获得这两个可检测标记的信号比， 以评估所述样本DNA和参照DNA之间的差异。在使用这种方法时，几个或者多个实验样本 可以共用一个参照样本。对于每天涉及多个样本的实验，通过避免对多个双份正常样本进 行标记，可以节约试剂和人工成本。同时也没有必要对样本进行处理从而获得不同的部分 以便分别进行分析。每个样本都可以仅评价一次。在具体的实施方案中，通过其编码信息来对编码颗粒进行鉴定，从而将颗粒编码 情况与第一信号和第二信号联系起来。因此，例如，将第一和第二信号与含有人13号染色 体DNA的第一编码颗粒系列的编码颗粒关联。对所述与第一编码颗粒系列关联的第一信号 和第二信号进行比较，从而获得受试个体13号染色体DNA与13号染色体参照DNA相比较的 信息。类似地，将第一和第二信号与含有人18号染色体DNA的第二编码颗粒系列关联。对 所述与第二编码颗粒系列关联的第一信号和第二信号进行比较，从而获得受试个体18号
15染色体DNA与18号染色体参照DNA相比较的信息。本文的附图和描述对最佳方式进行了阐释，但是可以用许多备选材料和方法进行 替代。本领域的技术人员会认识到合适的备选材料和方法，并且无需进行过多试验即可制 备和使用所述的组合物和方法。多种缓冲液和其他分析组分的组成均可被替代。用于培养、纯化、扩增、变性、偶联、杂交、报告物连接、洗涤和小球处理的条件全都 可以由使用者来改变，从而适合具体类型的细胞、模板基因组DNA、样本、所选报告物等。使用少到30ng的样本DNA也可以很好地进行本文实施例部分的分析。在生物学来 源产生的用于所述分析的DNA不足的情况下，可以通过许多全基因组扩增(WGA)方法(如 DOP PCR或phi-29PCR)对样本进行扩增。使用WGA处理的样本时，可以以同样的方法对参 照DNA进行处理，从而使任何序列特异性扩增的偏差均可以基本由样本/参照的信号比来 校正。提供了用于分析DNA的试剂盒。在具体的实施方案中，提供了一种试剂盒，其含有 编码颗粒系列和/或两个或多个编码颗粒系列的混合物。任选地，试剂盒含有使用编码颗 粒系列和/或含有两个或者多个编码颗粒系列的多重试剂的说明材料。任选地，还含有辅 助试剂，如缓冲液、酶、洗涤溶液、杂交溶液、可检测标记、检测试剂等。下文的实施例对用于分析的组合物和方法的实施方案进行了阐释。提供这些实施 例的目的是进行说明，不能将其看作是对组合物和方法的范围进行限制。实施例实施例1用于基因组DNA分析的小球系列试剂的制备图IA示出了由单个BAC克隆制备BAC扩增子并将该扩增子作为探针固定到一个 系列的编码小球上的流程图。在此实施例中，该系列中的小球全都具有相同的ID代码。原料为活的BAC克隆材料(10)，即一段插入到大肠杆菌细菌细胞基因组内的长 (通常为100-200kb)的人DNA序列。取出一小片冷冻的BAC甘油储液材料，并将其用作标 准细菌细胞培养方法的原料(11)。根据标准的BAC培养方案，在37°C下于装有35ml培养基 的50ml管中过夜培养细胞，并用抗生素进行选择。然后在4°C下将培养得到的细胞离心20 分钟，使其离心到管底，取出并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含有RNase的缓冲液中，然 后使用LyseBlue (Qiagen，Valencia CA)和SDS裂解。以大约20，OOOg将裂解液(12)离心 (13)30分钟，并收集上清(溶液中含有DNA)，弃去沉淀。将上清液重复离心15分钟。收集 含有溶解的BAC DNA的澄清上清液，同时弃去离心到管底的细胞碎片、蛋白质和其他杂质。 使用Qiagen基因组-Tip 20/G柱纯化试剂盒，从上清液中提取和提纯BAC DNA (17)。此试 剂盒含有纯化柱(15)，以及洗涤和洗脱缓冲液(16)。洗脱之后，通过异丙醇(19)沉淀法将 现已高度纯化的BAC DNA进行沉淀并成为沉淀团块。产量通常是20至200ng的纯化BAC DNA(18)。可以将此BAC DNA以干燥沉淀物形式储存，或者重悬于水中，直接用于随后的步 骤中。然后，使用两轮聚合酶链式反应(PCR)扩增，制备基本上代表各BAC DNA的完整序 列物的大量PCR扩增子。第一轮PCR(20)是非特异性简并寡核苷酸引物(DOP)的PCR，其 使用DOP引物混合物(21) ,DOP PCR聚合酶(22)和DOP PCR缓冲液(23)，并将上面制备的
16BAC DNA(IS)用作模板。第二轮PCR扩增(25)利用针对DOP引物的已知序列基序的单个引 物。使用两轮PCR来产生产量为大约20 μ g的扩增子终产物(29)，用于随后将扩增子(29) 偶联(32)至编码小球(30)。如下制备扩增子。制备50 μ 1各BAC DNA的第一 DOP PCR混合物，其含有10XD0P PCR 缓冲液5. 0 μ 1IOmMdNTP' s (每一种)Ι.ΟμΙ50mM MgCl5. 0 μ 110 μ M DOP 引物混合物(每一种)10. 0μ 120 至 50ng BAC DNA 模板2. 0 μ 1Platinum Taq 聚合Sl0. 5 μ 17jC21. 5μ 1总体积50. Ομ DOP PCR 缓冲液(23)含有 20mM Tris HCL(pH 8. 4)、50mMKCl 禾口 5mM MgCl。 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&it 力 200 μ Μ。 Platinum TAQ M^B (Applied BioSystems)的浓度为 5 单位/μ 1。DOP 引物混合物(21)，参见 Fiegler et al. 2003, GenesChromosomes Cancer, 36 (4) :361_74，包括三个系列具有以下 22-mer 序列 的简并寡核苷酸(Operon Biotechnologies, Huntsville AL)，其中N代表随机的核苷酸5' CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA 3‘ SEQ ID No. 15' CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG 3‘ SEQ ID No. 25' CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG 3‘ SEQ ID No. 3其中N表示随机的核苷酸。使用Qiagen基因组-Tip 20/G柱纯化试剂盒，将溶于水的BACDNA模板(18)通过 柱纯化法(17)纯化。Platinum Taq 聚合酶(22) (Invitrogen, Carlsbad CA)的浓度为 5 单 位 / μ 1 ο根据以下温度/时间条件，在GeneAmp 9700热循环仪(AppliedBioSystems, Foster City CA)中进行第一轮扩增(20)3.0分钟94 0C
1.5分钟94 0C
2.5分钟30°C，9个循环
0.10C/ 秒72 0C (斜率)
3.0分钟72 0C
1.0分钟94 0C
1.5分钟62°C, 30个循环
2.0分钟72 0C
8.0分钟72 0C4.0°C (稳定状态)然后，将第一轮DOP PCR(20)的扩增子产物(24)用作第二轮PCR(25)的模板。第 二轮中的单一引物(26)具有针对第一轮(20)中使用的DOP引物的共有序列部分的特异
17性。此引物(26)经胺修饰，从而使所得扩增子(29)还在一个末端具有胺基团，以有助于在 下一步中简单地偶联至编码小球(32)。
0135]如下进行第二轮PCR。
0136]制备100μ 1各BAC扩增子模板的第二 PCR混合物，其含有
0137]10 X PCR 缓冲液10. Ομ
0138]IOmMdNTP' s (每一种)2. 0 μ 1
0139]50mM MgCl10. 0 μ 1
0140]10 μ M 胺引物15. Ομ
0141]模板(来自PCR#1)2. 0μ 1
0142]Platinum Taq0. 5 μ 1
0143]/K58. 5μ 1
0144]总体积100. Ομ
0145]PCR 2 缓冲液(28)含有 20mM Tris HCL(pH 8.4)、50mM KCl 禾口 5mM MgCl。 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&it 力 200 μ Μ。 Platinum TAQ
Applied BioSystems)的浓度为 5 单位 / μ 1。
0146]与胺相连的引物(Operon)具有以下序列。
0147]5' -GGAAACAGCCCGACTCGAG-3‘ SEQ ID Ν0. 4
0148]反应(25)中的模板为来自上一轮DOP PCR(20)的DOP扩增子。根据以下温度/ 时间条件，在GeneAmp 9700热循环仪(AppliedBioSystems)上进行第二轮扩增(25)
0149]10 分钟 95 °C
0150]1.0 分钟 95 °C
0151]1.5分钟 60 °C，35个循环
0152]7.0 分钟 72 °C
0153]10 分钟 72 °C
0154]4.0°C (稳定状态)
0155]然后，使用基于磁性小球的试剂盒(9)(PCR Clean Beads, Agencourt Bioscience Corp. , Beverley ΜΑ)，根据制造商的方案，纯化此第二 PCR产物(29)。随后将经纯化的扩 增子(29)重悬于40μ1水中，并于-20°C下储存，直至用于下文所述的小球偶联步骤中。
以50 μ 1的标准小球浓度的规模，在Luminex羧基小球(30) (Luminex, Austin TX) 上进行编码小球偶联过程(32)，以将所述扩增子产物(29)作为探针DNA固定到编码小球 的表面之上，得到大约650，000个小球。所述小球由聚苯乙烯制备，直径大约为5. 6 μ m， 并由受控量的两种或者多种荧光染料编码，从而有助于在专用流式细胞仪读取装置上检 测其小球ID。将50 μ 1的悬浮小球(30)(全都具有一个小球ID或区域)，从送递它们的 Luminex管中转移到一个1. 5mlEppendorf管进行偶联(32)，并通过涡旋和超声处理来确保 悬浮。然后，以12，000RPM将小球离心3分钟，并在不干扰小球沉淀物的情况下除去小球 缓冲上清液。将25μ1 MES缓冲液加入各小球管，然后进行涡旋和超声处理。另外地，将 10 μ g各BAC的PCR 2扩增子(29)加入第二系列的1. 5ml离心管中，随后将各管中的DNA 在 SpeedVac (ThermoFisher Scientific, Waltham ΜΑ)中彻底干燥。然后，将一份小球悬液 转移到各DNA管中，并将各管涡旋和超声处理5秒钟进行混合，仔细地跟踪与各BAC有联系的小球ID (区域)。接下来，将1. 5 μ 1刚溶解的EDC (31) (1_乙基_3_ [ 二甲基氨丙基]_碳二亚胺盐酸 盐，Pierce，Rockford IL)以10mg/ml的浓度加入各管中，立即涡旋，并在室温下避光(目 的是保留Luminex小球的荧光编码)孵育30分钟。在15分钟时再次混合。然后再一次地 重复EDC添加、孵育和再次混合。然后，将500 μ 1 TNT 缓冲液(0. IM Tris ρΗ 7. 5,0. 15Μ NaCl, 0. 02% Tween 20) 加入各管中并进行涡旋。然后在微型离心机上以12，OOORPM将所述管离心4分钟，使小球 分布到底部，并小心地除去上清液。接下来，加入500 μ 1 0. 1% SDS，并且再以12，OOORPM 将小球离心4分钟，小心地除去上清液。最后，将50μ 1 IXTE缓冲液(IOmM Tris ρΗ 7.5， ImM EDTA)加至各管，并进行涡旋。该小球系列(33)——固定有扩增子探针(29)——可以作为用于基因组DNA分析 的多重小球系列的一个组分纳入。实施例2DNA分析用多重编码小球系列试剂的制备图2是示出将m个不同的编码小球系列(各自具有各自的固定的BAC-扩增子探 针DNA)混合在一起来制备多重编码小球系列的流程图。通过超声处理、旋转管容器、涡旋或类似方法，将编码小球系列34、35、36和37制 成悬液。然后，使用移液管将各小球系列的整分试样转移到另一个容器中，各个小球系列在 该容器中合并和混合，然后变性(38)，从而有助于随后在分析中与固定在所述小球上的探 针DNA的杂交。在一个详尽的实施例中，将各50 μ 1的2个或多个小球系列——每一系列在一个 单独的管子里，每一编码小球系列均固定有探针DNA(33)——分批地合并到一个1. 5ml离 心管内。在合并大约10个小球系列之后，将管离心，并小心除去上清液，目的是减少体积。 再次重复，直至合并所有的小球系列(例如，Luminex 200系统至多支持100个编码小球ID 或区域)。在将所有的小球系列合并成为一个多重小球系列之后，将固定的探针DNA变性。 在对小球进行离心并除去上清之后，加入500 μ 1 0. INNaOH，并在室温下孵育2分钟。然后 对小球进行离心，并小心地除去上清。加入500 μ 1 IOmM Tris、15mM NaCL.O. 2% Tween 20， 涡旋该管，然后对小球进行离心，并除去上清液。然后重复进行此洗涤步骤。最后，用IXTE 缓冲液将体积调整为500 μ 1，并将此多重小球系列(39)在4°C下避光保存，直至用于分析 中。实施例3多重基因组获得和丢失分析图3A为展示一个实施方案的流程图，所述实施方案包括使用多重编码小球系列 对η个样本进行多重基因组获得和丢失分析。在此实施例中，平行分析了两个DNA样本和两个参照。事实上，可以同时地以微量 板形式平行分析几十个样本。也可以平行分析比此数目更多或者更少的样本和参照。在此实施例中，将四个DNA样本(40和41代表两个参照，而42和43代表两个分析 样本)用生物素进行酶学标记并纯化。参照样本通常为正常男性和女性的合并样本，如人
19类女性基因组DNA和人类男性基因组DNA (Promega，Madison WI)。将各DNA样本和参照与 生物素标记的核苷酸(45) (PerkinElmer，Boston ΜΑ)、非标记核苷酸(49) (PerkinElmer)、 随机引物(47) (Operon, Biotechnologies, Huntsville AL)和 Klenow 片段聚合酶(46) (Epicentre Biotechnologies,Madison WI)合并起来。孵育(44)之后，使用 DNA 柱纯化试 剂盒(49)(如 Purelink DNA Mini Kit(Invitrogen))纯化(50)反应产物。大约 5 μ 1 的 约200ng/y 1经标记的样本用于此分析随后的杂交。然后，使各生物素标记的样本或参照(51-54)与固定在多重编码小球系列(56)的 小球上的探针杂交(55)。使用了每个小球系列(各探针类型)的大约500个小球；在此55 重实施例中，使用了总共大约55X500 = 27，500个小球/杂交。因为编码情况，各编码小球系列的小球可以区别于其他编码小球系列每一系列的 小球。此55个小球系列中的每一系列均含有多个编码小球，与所述编码小球相连的扩增子 基本上代表完整的模板基因组DNA片段。各小球系列的模板DNA代表图9所列的一个基因 组座位。杂交反应中包括含有Cot-IDNA、甲酰胺、硫酸葡聚糖和1.9XSSC的杂交缓冲 液。总体积大约为15μ1，且反应在PCR型硬质微量板如Bio-Rad HSP 9631 (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)的孔中进行。使用铝箔封口机(MSF 1001，Bio-Rad)严密地 封住该板，将蒸发降至最低。在1150rpm的微量板振荡培养箱(Wallac NCS Incubator, PerkinElmer)中于50°C下过夜进行杂交孵育(55)。在杂交孵育(55)之后，与四个样本杂交的四个多重小球系列(58-61)就可以进 行杂交洗涤(63)，然后与荧光报告物(65) —起孵育，再进行报告物洗涤(67)。首先，将 ΙΟΟμ 1洗涤缓冲液a(2XSSC，50%甲酰胺)加入各孔之中，然后重新封闭该板，并在振荡培 养箱(转动速率为1150rpm)于50°C下孵育20分钟。然后将各孔内含物转移到Millipore 0. 46 μ m HT 过滤板(Millipore,Billerica MA)。之后，使用 Millipore MSVMHTS00 多头抽 真空装置从各孔中真空除去液体。接下来，将100 μ 1洗涤缓冲液b(2XSSC，0. 1% Igepal 清洁剂)加入各孔，然后在50°C下再进行一次为期20分钟的振荡孵育，并进行真空抽吸。 随后，将100 μ 1洗涤缓冲液c (0. 2 X SSC)加入各孔，并在50°C下重复为期20分钟的振荡孵 育，然后进行真空抽吸。然后，将100 μ 1 IXPhycoLink SA溶液(链亲和素-藻红蛋白报告物)(64)加入 各孔。此报告物溶液是通过将 2 μ 1 500 XPhycoLink SAPJ13S (Prozyme, San Leandro CA) 混合到Iml报告物稀释液中形成，其中所述稀释液为1XPBS、0. BSA和0. 05% Tween 20。将此报告物溶液与多重小球系列在1050RPM的振荡培养箱中于25°C下孵育30分钟。 孵育之后，使用如前面的洗涤步骤中的多头抽真空装置从过滤板的孔中吸出溶液。然后用洗涤缓冲液d(66)将小球洗涤两次(67)，所述洗涤缓冲液d为含0.01% Tween 20的1XPBS。将100 μ 1加入过滤板的各孔中，然后通过板孔底部的过滤器真空抽 吸掉液体。再一次加入100 μ 1，并在1050RPM的振荡培养箱中于25°C下孵育2分钟。所述 第二次洗涤并不进行抽吸，而是用来悬浮小球以进行读数。之后，本实施例中的四个小球系列(68-71)即可在Luminex 200系统(Luminex Corporation, Austin TX)上读数(72)。依次读取各孔中的小球的信号和小球ID，并记录 下各孔或样本的各小球ID (小球区域)的前50个小球的荧光强度中值，并输出到在一个数
20据文件(73)中。没有发现小球交联；设定Luminex读数仪，使其分析各区域的50个小球， 并且并未记录到失败。图4是96孔SBS标准微量板(80)的示意图，其示出用于平行地对46个样本进行 分析的两份参照和两份样本的示例性位置。各标记样本的两份重复杂交可用于确保孔密封 失败情况下的数据形成，所述孔密封失败会导致试剂从单个孔蒸发。在双份重复没有受到 影响时，该样本仍然形成数据。使用此微量板和编码小球方法，实验员单人即可同时分析例 如46个样本和2个参照，并且全都双份重复进行，在第一天进行标记，杂交过夜，并在第二 天进行洗涤和读数。或者，分析可以不重复进行或者不止两个重复地进行。所示出的是双 份的两个参照(81和82)以及双份的样本，样本的一个实例在83处标示出。图5是使用男性的13号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本形成数据的一 个实例。示于图5底部的数字1-55列在图9中。此数据由通过Luminex读数仪获得的各小球区域的中间荧光值计算得到。从所有 其他信号中减去阴性对照小球29、54和56的平均值(参见图9)。然后，求出来自九个常染 色体克隆的信号与来自男性和女性参照DNA的相应克隆信号的比值。计算标准化因子，从 而在将该因子应用到所有的常染色体克隆信号之时，其使得平均的常染色体比值为数值1。 然后，将此标准化因子应用到所有的样本信号。将所得比值作图，并示于图5。请注意，13号染色体的克隆的比值全都在范围1.3 至1. 6之间，而18和21号染色体的克隆以及其他常染色体克隆除了有一个之外全都低于 1.2。13号染色体中的三体性很容易显现。同样地，样本与男性参照相比的比值图(方块数 据点)对于X和Y性染色体实际上都是平坦的。此乃男性样本所应有的反应。样本与女性 参照相比较的图(菱形数据点)，对于X而言下移，而对于Y而言上升，这同样也是男性样本 应有的反应。图6是使用男性的18号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本所形成的数据 的一个实例。如针对图5所述的那样，形成数据并作图。图7是使用女性的21号染色体上具有三体性的Coriell DNA样本所形成的数据 的一个实例。如针对图5所述的那样，形成数据并作图。图8是使用X染色体5-拷贝扩增的Coriell DNA样本所形成的数据的一个实例。 如针对图5所述的那样，形成数据并作图。图9为一张图表，其示出具有用于在示例性分析中形成扩增子的人基因组DNA插 入物的BAC克隆、其染色体和cyto条带位置、阴性对照寡核苷酸的序列以及各扩增子探针 所固定的小球系列的小球ID(Luminex小球区域)。将图5-8中χ轴上顺序编号的作图点与 图9中自上而下列出的BAC关联。将图5-8中χ轴上顺序编号的作图点与图9中自上而下 列出的BAC关联。BAC RP11-186J16被固定到两个不同的小球区域(42和86)。与人基因组没有序列同源性的一个寡核苷酸被选择作为阴性对照。所使用的具体 阴性对照寡核苷酸为5' GTCACATGCGATGGATCGAGCTC 3‘ SEQ ID No. 5 ；5' CTTTATCATCGTTCCCACCTTAAT 3' SEQ ID No. 6 ；5' GCACGGACGAGGCCGGTATGTT 3' SEQ ID No. 7。对与阴性对照寡核苷酸相连的三个小球区域29、54和56所形成的信号取平均值，并从所有其他小球信号中减去，然后再计算比值。本说明书中提及的任何专利或出版物均通过援引纳入本文，其程度就如同每一份 出版物都逐一特别地被指出通过援引纳入。以下申请均通过援引全文纳入本申请2006年 12月22日提交的流水号为11/615，739的美国专利申请和2008年3月26日提交的流水号 为12/055，919的美国专利申请；以及2007年12月5日提交的流水号为60/992，489的美国 临时专利申请、2005年12月23日提交的流水号为60/753，584的美国临时专利申请、2005 年12月23日提交的流水号为60/753，822的美国临时专利申请、2006年2月3日提交的流 水号为60/765，311的美国临时专利申请和2006年2月3日提交的流水号为60/765，355 的美国临时专利申请。本文描述的组合物和方法以示例的方式代表本发明的某些实施方案，而并无意于 限制本发明的范围。本领域技术人员可以想到其改变以及其他用途。在不背离本发明权利 要求所列出的范围的情况下，可以作出所述改变和其他用途。
权利要求
一种分析DNA样本的方法，包括提供包含连接有扩增子的编码颗粒的第一编码颗粒系列，所述扩增子包含合在一起基本上代表完整的第一种模板DNA序列的随机核酸序列；使所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样本DNA杂交；使所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的参照DNA杂交；检测指示所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样本DNA特异性杂交的第一信号，以及指示所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的参照DNA特异性杂交的第二信号；并且比较所述第一信号和所述第二信号，以检测所述第一信号和所述第二信号之间的差异，所述第一信号和第二信号之间的差异指示所述样本DNA和所述参照DNA之间的差异，由此分析所述DNA样本。
2.权利要求1的方法，其中所述扩增子的长度范围为约500-1200个核苷酸，包括端值。
3.权利要求1的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA是获自受试个体的可检测地 标记的DNA。
4.权利要求3的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA是获自受试个体的可检测地 标记的基因组DNA。
5.权利要求1的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA是人DNA。
6.权利要求1的方法，还包括提供包含连接有扩增子的编码颗粒的第二编码颗粒系列，所述扩增子包含合在一起基 本上代表完整的第二种模板DNA序列的随机核酸序列；使所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样本DNA杂交； 使所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的参照DNA杂交； 检测指示所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的样本DNA特异性杂交的 第一信号，以及指示所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检测地标记的参照DNA特异性杂 交的第二信号；并且比较指示所述第二编码颗粒系列的扩增子的特异性杂交的所述第一信号和指示所述 第二编码颗粒系列的扩增子的特异性杂交的所述第二信号，以检测所述第一信号和所述第 二信号之间的差异，所述第一信号和第二信号之间的差异指示所述样本DNA与所述参照 DNA之间的差异。
7.权利要求6的方法，其中所述第一和第二编码颗粒系列以混合物的形式提供，并且 还包括将所述第一编码颗粒系列的编码情况与指示所述第一编码颗粒系列的扩增子与可检 测地标记的样本DNA特异性杂交的所述第一信号以及指示所述第一编码颗粒系列的扩增 子的特异性杂交的第二信号联系起来；并将所述第二编码颗粒系列的编码情况与指示所述第二编码颗粒系列的扩增子与可检 测地标记的样本DNA特异性杂交的所述第一信号以及所述第二编码颗粒系列的扩增子的 特异性杂交的所述第二信号联系起来。
8.一种分析样本DNA的方法，包括提供一种多重试剂，其包含经编码的两个或更多个编码颗粒系列的混合物，从而使每一编码颗粒系列的各个颗粒均可检测地区别于其他每一编码颗粒系列的各个编码颗粒，所 述编码颗粒连接有由模板DNA序列扩增得到的扩增子，将各编码颗粒系列的每一种相比， 所述每一编码颗粒系列连接有由不同的模板DNA序列扩增得到的扩增子； 使所述连接的扩增子与可检测地标记的DNA杂交； 使所述连接的扩增子与可检测地标记的参照DNA杂交； 检测指示所述扩增子与可检测地标记的DNA特异性杂交的第一信号； 检测指示所述扩增子与可检测地标记的参照DNA特异性杂交的第二信号； 鉴定所述编码颗粒，从而将颗粒编码情况与所述第一信号联系起来； 鉴定所述编码颗粒，从而将颗粒编码情况与所述第二信号联系起来；和 比较各编码颗粒系列的所述第一信号和所述第二信号，其中所述第一和第二信号的差 异指示所述样本和参照DNA之间的差异，由此分析DNA。
9.权利要求8的方法，其中与各编码颗粒系列相连的所述扩增子含有合在一起基本上 代表完整的模板DNA序列的随机核酸序列，其中所述完整的模板DNA序列比各个连接的扩 增子都要大。
10.权利要求9的方法，其中所述完整的模板DNA序列的长度范围为约20-300kb，包括 端值，并且各个连接的扩增子包含与所述模板DNA序列的一部分相同的DNA序列，并且其长 度范围为约500-1200个核苷酸，包括端值。
11.权利要求8的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA为获自受试个体的可检测地 标记的DNA。
12.权利要求11的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA为获自受试个体的可检测 地标记的基因组DNA。
13.权利要求8的方法，其中所述可检测地标记的样本DNA为人DNA。
14.一种制备用于分析DNA的编码小球系列的方法，包括a)使用一个DNA模板和第一种反应寡核苷酸引物进行第一扩增反应，从而产生含有第 一扩增子的第一反应产物，多个所述第一种反应引物中的每一个都包含一段可变的非特异 性简并DNA序列和一段毗邻的恒定DNA序列，其中各个第一扩增子均包含一段与所述DNA 模板的一个随机部分相同的DNA序列以及一段与所述第一种反应引物的所述恒定DNA序列 相同的DNA序列；b)使用所述第一扩增子的至少一部分作为模板DNA，并使用第二种反应寡核苷酸引物 进行第二扩增反应，从而产生含有第二扩增子的第二反应产物，所述第二种反应寡核苷酸 引物包含所述第一种反应引物的所述恒定DNA序列，其中各个第二扩增子含有一段与所述 DNA模板的一个随机部分相同的DNA序列以及一段与所述第一种反应引物的所述恒定DNA 序列相同的DNA序列；c)将所述第二扩增子与第一种多个编码颗粒相连，从而产生用于分析DNA的编码颗粒 系列。
15.权利要求14的制备用于分析DNA的试剂的方法，其中所述第二种反应寡核苷酸引 物还含有用于与编码颗粒反应的官能团。
16.权利要求14的制备用于分析DNA的试剂的方法，还包括重复a)-c)但其中使用 第二种DNA模板并将由此获得的第二种扩增子与第二种多个编码颗粒相连，从而产生用于分析DNA的第二编码颗粒系列，所述第二种多个编码颗粒与所述第一种多个编码颗粒具有 可检测差异。
17.权利要求16的制备用于分析DNA的试剂的方法，还包括混合所述第一编码颗粒系 列与所述第二编码颗粒系列。
18.权利要求16的制备用于分析DNA的试剂的方法，还包括重复a)-c)但其中使用 第三种或后续的DNA模板，并将由此产生的第三种或后续的扩增子与第三种或后续的多个 编码颗粒相连，从而产生用于分析DNA的第三种或后续的编码颗粒系列，所述第三种或后 续的多个编码颗粒中的每一种均以可检测方式不同于其余各种多个编码颗粒。
19.权利要求18的制备用于分析DNA的试剂的方法，还包括混合所述第一编码颗粒系 列、所述第二编码颗粒系列、所述第三编码颗粒系列和/或后续的编码颗粒系列。
20.一种用于分析DNA的试剂，包括连接有由模板DNA序列扩增得到的扩增子的多个编码颗粒，各个连接的扩增子均包含 一段与所述模板DNA序列的一个随机部分相同的DNA序列，其中所述扩增子合在一起基本 上代表所述完整的模板DNA，并且其中各个扩增子的与所述模板DNA序列的一个随机部分 相同的核酸序列比所述完整的模板DNA要短。
21.权利要求20的试剂，其中所述完整的模板DNA序列的长度范围是约20-300kb， 包括端值，并且各个连接的扩增子均含有与所述模板DNA序列的一个随机部分相同的一段 DNA序列，其长度范围为约500-1200个核苷酸，包括端值。
22.一种用于分析DNA的多重试剂，包括两种或者更多种多个经编码的颗粒的混合物，这样编码使得每种多个颗粒的颗粒均可 检测地区别于其他每种多个颗粒的颗粒，所述编码颗粒连接有由模板DNA序列扩增得到的 扩增子，将各种多个编码颗粒的每一种相比，所述每种多个编码颗粒均连接有由不同的模 板DNA序列扩增得到的扩增子，各个连接的扩增子均包含一段与所述模板DNA序列的一个 随机部分相同的DNA序列。
23.一种用于分析DNA的试剂盒，含有两种或者更多种多个经编码的颗粒的混合物，这样编码使得每种多个颗粒的颗粒均可 检测地区别于其他每种多个颗粒的颗粒，所述编码颗粒连接有由模板DNA序列扩增得到的 扩增子，将各种多个编码颗粒的每一种相比，所述每种多个编码颗粒均连接有由不同的模 板DNA序列扩增得到的扩增子，各个连接的扩增子均包含一段与所述模板DNA序列的一个 随机部分相同的DNA序列。
24.一种基本如本申请所述的用于分析DNA的方法。
25.—种基本如本申请所述的用于分析DNA的试剂。
26.—种基本如本申请所述的用于分析DNA的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种针对染色体获得和丢失的编码小球多重分析，所述分析的益处是可将复杂的大型模板DNA来源(例如BAC DNA)作为探针材料，而没有小球交联或其他分析性能问题。本文描述了用于分析DNA的试剂，所述试剂含有连接有由模板DNA序列扩增得到的扩增子的多个编码颗粒。每个连接的扩增子均含有与模板DNA序列的一个随机部分相同的一段核酸序列，其中所述扩增子合在一起基本上代表完整的模板DNA，并且其中每个扩增子的与模板DNA序列的一个随机部分相同的核酸序列要比所述完整的模板DNA短。
文档编号C12Q1/68GK101918596SQ200880125035
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月24日 优先权日2007年12月5日
发明者K·E·阿得勒, M·J·舍默尔 申请人:珀金埃尔默·拉斯公司