形成用于传感的固定化生物层的组合物的制作方法

专利名称：形成用于传感的固定化生物层的组合物的制作方法
技术领域：
公开了用于形成固定化生物层的组合物。更具体地，本发明涉及用于形成固定化 生物层的重要的可固化组合物。
背景技术：
用于测量生物流体中生物学上重要的分析物种类的小型化传感器的开发正变得 越来越重要，这尤其是因为对容许在现场或在室内进行这类分析物种类测量的越来越小仪 器的需要。尽管在传感器制造领域已有进展，但在这类传感器的小型化和制造方面仍存在 主要的挑战。一种这类挑战是大量生产商业上可行的包含生物活性分子的传感器的复杂程 度。主要关注的是与现有半导体制造方法相关的固有苛刻的物理和化学过程与敏感的有机 化合物和不稳定的生物活性分子之间的相容性，敏感的有机化合物和不稳定的生物活性分 子两者包含功能性生物传感器的部分。围绕这类传感器的小型化和制造的另一主要挑战是 灵敏的并且能够以高度再现性大量制备的传感器的生产。因此，存在对形成考虑到传感器 中所用的生物活性分子的灵敏性的传感器的工艺的需要，以及对大量生产传感器时高度均 一的传感器的需要。附图简述根据下列非限制性图将更好地理解本发明，其中

图1显示在与参比电极组合的硅晶片上制造的血液尿素氮(BUN)传感器的拓扑立 剖面视图；图2 (a)-(c)如下显示在不同制造步骤的硅芯片(2mmX3mm)上的BUN传感器的平 面视图图2 (a)是银-氯化银裸电极353 ；图2 (b)就(a)而论具有微分散的铵离子选择性 膜355 ；图2(c)就(b)而论具有紫外线点固化的(spot-cured)丙烯酰胺脲酶层356。图3(a)-(C)如下显示成品BUN传感器的电子显微视图图3(a)显示通过常规的 ELVACE方法(由亲水区和疏水区构成的乙酸乙烯酯乙烯共聚物)形成的固定化酶层；图 3(b)具有所期望的均一圆顶形状的UV点固化丙烯酰胺脲酶酶层；和图3(c)UV泛光固化的 (flood cured)丙烯酰胺脲酶酶层；图4显示使用图14(a)中所述的组合物的丙烯酰胺BUN传感器由在校准流体中转 为在血液中的传感器输出数据(计时电位图)；图5显示图4中所示类型的丙烯酰胺BUN传感器(EIL)在用于加热的和未加热的 芯片的全血(WB)中的传感器相关数据与基于ELVACE (木胶)的酶固定化膜的比较；图6显示分散装置和UV点固化子系统的视图；图7显示点固化子系统和UV灯箱的细节；图8 (a)-(b)显示(a)分散子系统和(b)点固化子系统的细节；
图9显示分散与点固化的过程算法步骤和时间控制；图10是传感器套筒罩(cartridge cover)的等距顶视图；图11是传感器套筒罩的等距底视图；图12是用于传感器套筒的带形垫圈(tape gasket)的设计的顶视图；图13是传感器套筒底部的等距顶视图；图14(a)_(b)显示用于具有优选的实际混合物组合物的基质的试剂表，其中图 14(a)显示用于含脲酶的酶固定层的组分，其中脲酶为仅有的酶，并且图14(b)类似于 14(a)，只是添加了碳酸酐酶；图15(a)_(b)显示从使用以下物质产生的酶固定层所产生的信号的计时电位数 据(a)作为单体的丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酰胺(PEGA)和N-[3-( 二甲 氨基)丙基]-甲基丙烯酰胺(DMAPMA)和作为二聚体的1，4_双(丙烯酰)哌嗪；(b)作为 单体的丙烯酰胺和作为二聚体的1，4_双(丙烯酰)哌嗪、乙二醇二丙烯酸酯聚(乙二醇) 二丙烯酸酯(PEGDA)、N，N' -(1,2- 二羟亚乙基)双-丙烯酰胺(DHEBA)和三羟甲基丙烷 乙氧基化三丙烯酸酯(TMPETA)；图16显示暴露于不同强度和不同的时间的310nm的UV光后从基于丙烯酰胺/1， 4_双(丙烯酰)哌嗪的酶固定层产生的信号的电位计时数据，其未表明在此实验中使用的 暴露于UV光的时间和强度的范围的显著影响；图17显示具有不同的货架期和储存条件的不同浓度的湿润剂的影响的数据；并 且图18展示了 EIL膜的印刷厚度对使用5种不同的含水对照流体的传感器性能的 影响相对较小。发明概述本发明提供用于形成供传感器中使用的固定的生物层的组合物，所述传感器用于 测量生物流体中生物学上重要的分析物种类。在用于形成在大批次制造时具有更均一的性 能特征的仪器如传感器的方法中使用所述组合物。所述组合物可用于形成包括生物层的传 感器，所述生物层在与诸如例如校准(calibrant)流体、对照流体和血液这类的液体接触 时基本上耐溶胀。不受任何具体理论的限制，据信使用所述组合物生产的生物层耐溶胀，因 为在所述层中存在明显水平的交联。已发现以这种方式耐溶胀的膜是操作传感器所希望 的，因为表现出明显溶胀的生物层可能给出不一致的信号并且甚至从表面脱层。在一个实施方式中，本发明是针对酶固定组合物，所述酶固定组合物包含在基本 上均勻的含水混合物中的一种或多种酶、湿润剂、丙烯酸基单体、水溶性有机光引发剂和水 溶性丙烯酸基交联剂。所述一种或多种酶可以选自例如由以下组成的组葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、 肌酸酶、肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、触媒、碳酸酐酶、NAD (P)H氧化酶、胆固醇氧化酶、醇氧化 酶、胆碱氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化酶、吡哆醛氧化酶、D-氨 基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、脲酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。所述单体任选地选 自由以下组成的组丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-[3-( 二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、甲 基丙烯酸羟乙酯以及它们的组合。所述有机光引发剂任选地选自由以下组成的组2_羟 基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、2-羟基-3-(3，4- 二甲基-9-氧
5代-9H-噻吨-2-基氧基)-N，N，N-三甲基-1-氯化丙铵以及它们的组合。所述交联剂可选 自由以下组成的组1，4-双丙烯酰哌嗪、N，N’-(1，2-二羟亚乙基)双-丙烯酰胺、N，N’-双 (丙烯酰)胱胺、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二丙烯酸酯、(+)_N，N’ - 二烯丙基酒石 酰胺以及它们的组合。在一个方面，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种稳定组分pH 缓冲剂、丙烯酸基交联分子、二硫键还原剂、二价离子螯合剂、蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋 白、盐、糖和杀生物剂。在另一方面，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种 稳定组分TRIS缓冲剂、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸盐、蔗糖、抑肽酶、牛血清白蛋白、氯化 钠、氯化钾、叠氮化钠和甘油。所述组合物任选地包含选自由以下组成的组的PH缓冲剂巴比妥钠、HEPES, PIPES、MES、MOPS、曲辛(Tricine)、BIS-TRIS、磷酸盐、磷酸盐盐水、SSC、SSPE, TAPS、TAE、 TBE以及它们的组合。在一个方面，所述组合物还包含选自由以下组成的组的二硫键还原剂2_巯基乙 醇、盐酸三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇以及它们的组合。任选地，所述组合物还包含选自由以下组成的组的二价离子螯合剂乙二胺四乙 酸、柠檬酸钠、乙二醇四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺和它们的组合。在另一实施方式中，所述组合物还包含选自由以下组成的组的蛋白酶抑制剂抑 肽酶、鸡卵白半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken egg white cystatin)、抗蛋白酶、胱胺二 盐酸盐(cystarnine dihydrochloride)、胰凝乳蛋白酶抑制剂、3，4_ 二氯异香豆素、E-64、 依布硒、Gly-Gly-Tyr-Arg合成肽、亮抑酶肽、α 2_巨球蛋白、N-α -甲苯磺酰基-L-赖 氨酸氯甲酮盐酸盐、N- α对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲酮盐酸盐、胃蛋白酶抑制剂Α、 pesinostreptin, ε -氨基-正己酸、4_ (2_氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、抗凝血酶III、博 待啉(bdellin)、补体Cl酯酶抑制剂、3，4-二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸(diisopropyl fluorophosphage)、弹性蛋白酶抑制剂、甲磺酸加贝酯(gabexate mesylate)、亮抑酶 肽、α 2-巨球蛋白、N-乙酉先基-glu-ser-met-asp-al、N-乙酉先基-ile-gly-thr-asp-al、 二异丙基氟磷酸、Na-T-Boc-去乙酰亮抑酶肽、乙酰基-胃蛋白酶抑制剂、富组蛋白5、 Cbz-Leu-Leu-Phe-al、Cbz-Leu-Leu-Leu-B (OH) 2、乳胱素、clasto-乳胱素 β -内酯、二异丙 基氟磷酸、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂A、D-Hi s-Pro-Phe-Hi s-Leu-ps i- (CH2NH) -Leu-V al-Tyr、二亚乙基三胺五乙酸、1，10-二氮杂菲一水合物、膦酰二肽、二异丙基氟磷酸、N-乙 酰基_水蛭抑制剂C、甲磺酸加贝酯、蛭素、Na-(2-萘磺酰基甘氨酰)-4-脒基DL-苯丙氨 酸(pheylalanine)哌啶、D-Val-Leu-Lys-氯甲酮、对氨基苯甲脒二盐酸盐、大肠杆菌素、胰 蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂、Glu-Gly-Arg-氯甲酮以及它们的组合。所述组合物可以包含选自由以下组成的组的杀生物剂叠氮化钠、2-甲基-4-异 噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、硫柳汞、次氯酸盐以及它们的组合。所述湿润剂任选地选自由以下组成的组甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯、山梨醇、木 糖醇、麦芽糖醇、聚葡萄糖、皂角(quillaia)、乳酸、氯化锂、1，2_丙二醇以及它们的组合。任选地，所述组合物还包含选自由以下组成的组的盐氯化钠、氯化钾、磷酸钠、磷 酸钾以及它们的组合。组合物优选是稳定的，例如在冷冻形式下稳定。
优选地，所述组合物能够被微分散至基本上平坦的表面并暴露于紫外辐射以引 起交联从而在所述表面上形成粘附的固定化酶层，例如，在所述表面上的粘附的非溶胀性 固定化酶层，所述表面优选包含电极，例如离子选择性电极、电流型电极(amperometric electrode)、电导电极或传感器。所述传感器任选地选自例如由以下组成的组光学传感 器、光纤传感器、声表面波传感器、消逝传感器(evanescent sensor)、表面等离子体共振传 感器和光波导传感器。所述组合物优选能够通过选自由以下组成的组的方法被施加至表面旋涂、浸涂、 喷涂、丝网印刷、喷墨印刷、激光印刷、涂抹和接触印刷；并被暴露于紫外辐射以引起交联从 而在所述表面上形成粘附的固定化酶层。发明详述在一个方面，本发明涉及酶固定组合物，所述酶固定组合物包含在基本上均勻的 含水混合物中的一种或多种酶、湿润剂、丙烯酸基单体、水溶性有机光引发剂和水溶性丙烯 酸基交联剂。塵本发明的组合物中所包含的一种或多种酶可以广泛地变化。在一些实施方式中， 所述一种或多种酶包含脲酶。脲酶特别地很适于掺入到在测定中定量血液尿素氮(BUN)含 量的生物传感器中。BUN测定用于测量血液中的尿素氮的水平，尿素氮是被肾清除的蛋白代 谢废产物。因此BUN测定评估肾的功能。临床上有用的BUN值为2-140mg/100mL(dL)。称 为氮血症的病症(即，BUN水平增加)可能指示肾功能受损、充血性心力衰竭、脱水、休克、 胃肠道出血、压力、急性心肌梗塞或蛋白吸收过度。可选择地，BUN值降低可能指示肝衰竭、 营养不良、促蛋白合成类固醇的使用、怀孕和乳糜泻(siliac disease)。全血中的尿素是以两步法检测的。首先，尿素经由不完全了解的机制在“脲酶反 应”中被酶促转化为产物NH4+和HC03_。检测尿素的第二步是通过NH4+离子选择性电极(ISE) 以电位法测定铵离子活性。参见，D. Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology(物理生物化学生物化学和分子生物学的应 用)第4章(第2版，1982)。BUN传感器反应，即由于NH4+浓度改变而引起的电位改变，是 在血液中尿素的已知水平校准的。由此可以使用传感器反应曲线图(作为时间的函数的以 毫伏为单位的计时电位图)来指示传感器膜内铵离子的浓度，这提供了对血液中尿素浓度 的间接估计。由于脲酶对尿素的酶促降解产生了作为HC03_分解的副产物的种类H+和C02，所以 可以使用检测H+或CO2改变的传感器来测定BUN含量。铵离子的检测是优选的，因为血液 中存在相对较低背景浓度的铵离子。相反，血液具有明显的H+、CO2和HCO3-背景。脲酶反 应期间离子的产生还增加了样品的电导率，该电导率可以用电导率传感器来检测。脲酶的理想性质是具有低残余水平的关联产物(铵离子< 0. 00001 μ mol/酶单 位)和其他含氮化合物。用于本发明的酶固定组合物中的脲酶理想地应不含污染性蛋白酶 并且应在25°C具有大于500U/mg蛋白的比活性。此外，该酶还应为高纯度的。在一些实施 方式中，脲酶应具有在约ImM至约IOOmM范围内的Km，例如约ImM至约50mM或约25mM至约 75mM,并且优选地为约50mM。此外，脲酶应具有大于16，000 (微摩尔/ml/min)的Vmax。最 后，脲酶应具有约5 X IO5Hiirr1或更大的Kcat。
在优选的实施方式中，脲酶为刀豆脲酶(E. C. 3. 5. 1. 5) (Biozyme Laboratories, San Diego, CA)。刀豆脲酶(E. C. 3. 5. 1. 5)的其他来源包括(i) Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville, Ontario, Canada) ； (ii)Toyobo (Tbkyo, Japan) ； (iii)Worthington Biochemical Corporation(Lakewood, NJ) ； (iv)Genzyme Diagnostics(Cambridge, MA)。在一些实施方式中，本发明的酶固定组合物包含碳酸酐酶和脲酶。碳酸酐酶将由 脲酶反应所形成的碳酸氢盐转化为二氧化碳，从而增加铵离子产率，如在美国专利申请系 列第11/216，041号中所述的，通过引用将其整体并入本文。用于这些组合物中的碳酸酐酶 理想地应具有低残余水平的含氮化合物，不含污染性蛋白酶并且应另外为高纯度的。此外， 碳酸酐酶应具有在O°C大于2500WiIbur-Anderson单位/mg蛋白的比活性(WiIber, K. M.和 N. G. Anderson, Journal of Biological Chemistry 176:147-154(1948))。在一些实施方 式中，碳酸酐酶应具有ImM至50mM之间的Km值，其中优选的Km为1至5。此外，碳酸酐酶 应具有大于50(微摩尔/ml/min)的Vmax，优选大于10，000 (微摩尔/ml/min)。最后，碳酸 酐酶应具有大于Τδπ ιΓ1的Keat值，优选大于5 X IO5Hiirr1tj在优选的实施方式中，碳酸酐酶是牛碳酸酐酶(E.C.4. 2. 1. 1) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville, Ontario, Canada ;Km 1. 31mM ；Vmax 64. 4 ^ /K /ml/min ；Kcat 76. 24min_1)。牛碳酸酐酶(E. C. 4. 2. 1. 1)的另一来源是 Worthington Biochemical Corporation(Lakewood, NJ)。尽管在一些优选的实施方式中，用于本发明的酶固定组合物的酶为脲酶，但是可 以单独或与另一种酶(例如，脲酶和碳酸酐酶)组合使用与固定组合物相容的任何其他 酶。在一些实施方式中，所述酶选自由以下组成的组葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、肌酸酶、 肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、触媒、NAD (P)H氧化酶、胆固醇氧化酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、甘 油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化酶、吡哆醛氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基 酸氧化酶、脲酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶以及它们的组合。可以理解所用的酶测定被 传感的分析物。因此，例如葡萄糖氧化酶可以在检测葡萄糖的传感器中使用；乳酸氧化酶可 用于检测乳酸根；并且脲酶和碳酸酐酶的组合可用于同时检测BUN含量。单体、光引发剂和交联剂如上面所讨论的，本发明的酶固定组合物包含丙烯酸基单体、水溶性有机光引发 剂和水溶性丙烯酸基交联剂。在一些实施方式中，丙烯酸基单体包括丙烯酰胺。在其他实 施方式中，所述单体包括甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酸酯、N-[3-( 二甲氨基)丙基] 甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯或它们的混合物。有机光引发剂可以为能够聚合单体的任何光引发剂。在一些实施方式中，光引 发剂选自由以下组成的组2，6_双(4-叠氮苯亚甲基)环己酮；2，6_双(4-叠氮苯亚甲 基)-4_甲基环己酮；4，4_ 二叠氮均二苯乙烯_2，2' - 二磺酸二钠盐；重铬酸铵；1-羟 基-环己基-戊基-酮(Irgacure 907) ；2-甲基_1[4_(甲硫基)苯基]_2_吗啉代丙 烧-1-酮(Irgacure 184C) ；2-羟基-2-甲基-1-苯基-丙烧-1-酮(Darocur 1173)；
Irgacure 184C 与 50wt % 的二苯甲酮的混合光引发剂(Irgacure 500) ；20wt% 的 Irgacure 184C 与 80wt % 的 Darocur 1173 的混合引发剂(Irgacure 1000) ；2-羟 基-l-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Irgacure 2959)；苯甲酰甲酸甲酯 (Darocur MBF) ； α , α - 二 甲氧基-α -苯基苯乙酮(Irgacure 651) ；2_ 节基 _2_( 二甲氨基)-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮(Irgacure 369) ；30wt % 的 Irgacure 369 与 Irgacure 651的混合引发剂(Irgacure 1300) ；二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰 基)-氧化膦(Darocur ΤΡ0) ；50wt% 的 Darocur TPO 与 50wt% 的 Darocur 1173 的混合引 发剂(Darocur 4265)；氧化膦；苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)(Irgacure 819) ；5wt% 的 Irgacure 819 与 95wt % 的 Darocur 1173 的混合弓I 发剂(Irgacure 2005) ；IOwt % 的 Irgacure 819 与 90wt % 的 Darocur 1173 的混合引发剂(Irgacure 2010) ； Irgacure 819 与 80wt% 的 Darcocur 1173 的混合引发剂(Irgacure 2020)；双(乙 5-2， 4_环戊二烯-1-基)双[2，6-二氟-3-(1!1-吡咯-1-基)苯基]钛(Irgacure 784)；含有 二苯甲酮的混合引发剂(HSP188)；以及它们的衍生物。在优选的实施方式中，光引发剂包 括2-羟基-l-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。在其他实施方式中，光引发 剂包括2-羟基-3- (3,4- 二甲基-9-氧代-9H-噻吨-2-基氧基)-N, N, N-三甲基-1-氯化 丙铵。另外，这些光引发剂可以组合使用。在优选的实施方式中，交联剂是能够促进由单体所形成的聚合物的交联的任何化 学实体。在一个实施方式中，交联剂包括1，4_双丙烯酰哌嗪(BAP)。在其他实施方式中，交 联剂包括N，N’ -(1，2-二羟亚乙基)双-丙烯酰胺、Ν，Ν’ -双(丙烯酰基)胱胺、Ν，Ν’ -亚 甲基双丙烯酰胺、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯、(+)_Ν， N' -二烯丙基酒石酰胺或它们的混合物。湿润剂、缓冲剂和其他组分除丙烯酸基单体、水溶性有机光引发剂和水溶性丙烯酸基交联剂外，酶固定基质 可以任选地还包含其他稳定组分，所述其他稳定组分包括例如，PH缓冲剂、二硫键还原 剂、二价离子螯合剂、蛋白酶抑制剂、白蛋白、盐、糖、杀生物剂、湿润剂和增塑剂。在优选的 实施方式中，酶固定基质包含TRIS缓冲剂、双丙烯酰胺、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸盐、蔗 糖、抑肽酶、牛血清白蛋白、氯化钠、氯化钾、叠氮化钠和甘油。参见图14。在一些实施方式中，本发明的组合物包含湿润剂。当添加湿润剂时，所述湿润剂 优选地选自甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇、聚葡萄糖、皂角、乳酸、 氯化锂和1，2_丙二醇。在一个实施方式中，组合物中湿润剂的浓度为约2-20%，例如约 2-15%、约2-10%或约2-8% (ν/ν) 0在一些情况下，已发现在过高浓度湿润剂能够降低产 品的货架期。添加如甘油的湿润剂是为了防止基质在微分散过程期间和固化步骤前干燥。 如果微分散的小滴干燥过快，则制剂的组分可能从溶液中沉淀出来，并且这会不利地影响 交联和固化。由于分散到基底上的小滴尺寸小，所以在低湿度制造环境中的微分散易趋于 快速干燥。因此，控制环境温度和湿度是重要的。此处所述过程的优选范围是4°C至25°C 和5%至30%的相对湿度。本发明的制剂优选地包含可用于维持和优化酶活性的生物化学缓冲剂组分。示 例性缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、巴比妥钠、4-(2_羟乙基)-1_哌嗪乙磺 酸(HEPES)、哌嗪二乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)、曲辛、BIS-TRIS、磷酸盐、磷酸盐盐水、柠檬酸钠盐水(SSC)、磷酸钠乙二胺四乙酸盐 水(SSPE)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、三羟甲基氨基甲烷(tris)乙酸 乙二胺四乙酸(TAE)、三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸(TBE)以及它们的混合物。在优 选的实施方式中，缓冲剂为TRIS。
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在一些实施方式中，本发明的组合物任选地包含还原剂。示例性的还原剂包括二 硫苏糖醇(DTT)、2_巯基乙醇、盐酸三(2-羧乙基)膦、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽以及它们的 混合物。在优选的实施方式中，还原剂为DTT。添加还原剂至本发明的组合物中以防止组合 物中所包含的酶形成非活性的多聚体可能是有利的。在一些实施方式中，本发明的组合物任选地包含阳离子粘合剂，优选为二价阳离 子粘合剂。示例性的二价阳离子粘合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠、乙二醇四乙 酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺和它们的混合物。添加这种阳离子粘合剂作为金属螯合剂 以防止金属离子失活以及防止蛋白酶活化。在一些实施方式中，本发明的组合物包含蛋白酶抑制剂。示例性的蛋白酶抑制剂 包括抑肽酶、鸡卵白半胱氨酸蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶、胱胺二盐酸盐、胰凝乳蛋白酶抑制 剂、3，4-二氯异香豆素、E-64、依布硒、Gly-Gly-Tyr-Arg合成肽、亮抑酶肽、α 2-巨球蛋 白、N- α -甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲酮盐酸盐、N- α对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲酮 盐酸盐、胃蛋白酶抑制剂A、pesinostr印tin、ε -氨基-正己酸、4_(2_氨乙基)苯磺酰氟 盐酸盐、抗凝血酶III、博待啉、补体Cl酯酶抑制剂、3，4_ 二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸 (diisopropyl fluorophosphage)、弹性蛋白酶抑制剂、甲磺酸加贝酯、亮抑酶肽、α 2_巨球 蛋白、N-乙酰基-glu-ser-met-asp-al、Ν-乙酰基 _ile-gly-thr-asp-al、二异丙基氟磷酸、 Na-T-Boc-去乙酰亮抑酶肽、乙酰基-胃蛋白酶抑制剂、富组蛋白5、Cbz-Leu-Leu-Phe-al, Cbz-LeU-LeU-LeU-B(OH)2^L胱素、clasto-乳胱素β -内酯、二异丙基氟磷酸、苯甲基磺酰 氟、胃蛋白酶抑制剂 A、D-His-Pro-Phe-His-Leu-Psi-(CH2NH) -Leu-Val-Tyr、二亚乙基三胺 五乙酸、1，10-二氮杂菲一水合物、膦酰二肽、二异丙基氟磷酸、N-乙酰基-水蛭抑制剂C、甲 磺酸加贝酯、蛭素、Na-(2-萘磺酰基甘氨酰)-4-脒基-DL-苯丙氨酸(pheylalanine)哌 啶、D-Val-Leu-Lys-氯甲酮、对氨基苯甲脒二盐酸盐、大肠杆菌素、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白 酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂和Glu-Gly-Arg-氯甲酮。在优选的实施方式中，添加抑肽酶作为 在血样分析时可与膜接触以及也可能存在于影响产物货架期的基质制剂中的任何蛋白酶 的蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，本发明的组合物包含杀生物剂。示例性的杀生物剂包括叠氮 化钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、硫柳汞、次氯酸盐 以及它们的混合物。在优选的实施方式中，添加叠氮化钠作为杀生物剂以预防性保护制剂 在点固化前或点固化后免受微生物污染。在一些实施方式中，本发明的组合物包含增塑剂。示例性的增塑剂包括甘油、丙 二醇、聚乙二醇以及它们的混合物。在优选的实施方式中，增塑剂为甘油。应了解如甘油的 一些增塑剂可以作为增塑剂和湿润剂二者起作用，从而使本发明的组合物更柔韧。这防止 固化的丙烯酸树脂在温度改变期间和在可能将材料置于应力下的其他条件下开裂和脱层， 所述其他条件称为环境应力开裂(ESC)。在一些实施方式中，本发明的组合物包含盐。示例性的盐包括氯化钠、氯化钾、 磷酸钠、磷酸钾以及它们的混合物。发现低浓度的盐优选氯化钠和氯化钾的添加降低了脱 层率，即降低了随后接触校准流体或血样时膜粘附力的损失。尽管不受任何理论束缚，据信 这种改善是由于添加内源盐后样品与膜之间渗透浓度差的降低所致。由于离子选择性电极 (ISE)对钠离子和钾离子敏感，所以对该浓度进行优化以降低这种背景对ISE的影响。在一些实施方式中，盐浓度为约0. ImM至约140mM，例如，约30mM至约140mM、约0. ImM至约ImM、 约20mM至约50mM或约20mM至约40mM。在优选的实施方式中，使用包含0. 9mM KCl和35mM NaCl的本发明的组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物包含脱水保护剂(anhydrobiotic protectant)。示例性的脱水保护剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇和它们的混合物。在优选的 实施方式中，脱水保护剂为蔗糖。优选地添加蔗糖作为脱水保护剂以增强膜的稳定性从而 使其中包装传感器的测试套筒表现出延长的货架期，例如6-12个月或更长时间。还可以添 加牛血清白蛋白(BSA)，因为已观察到其增加筒的货架期并确保良好的膜粘附力。组合物的制备在一些实施方式中，将本发明的组合物混合、等分并且然后冷冻储存直到将等分 试样解冻并用于微分散。在优选的实施方式中，将单体(例如丙烯酰胺)和交联剂(例如 BAP)在溶液中混合在一起。向单体/交联剂溶液中添加光引发剂(例如，Irgacure 2959)。 在一些实施方式中，希望最后添加光引发剂，因为它是最具反应性的并且这种措施减少其 暴露于光。在优选的实施方式中，将样品在-60°C冷冻，并且发现其稳定达至少4个月。样 品冷冻可在-20°C至-120°C的范围内，其中较冷的温度是优选的。在这些深低温下，制剂可 以保持稳定达数年。尽管本发明的组合物优选地用于固定酶，本领域的那些技术人员将认识到它们还 可以用于固定其他生物活性材料而不是酶，或者其他生物活性材料以及酶，例如，抗体、抗 体片段、RNA、单链 DNA 禾口双链 DNA。参见，例如，Rehman 等人，1999，“ Immobilization of aeryIamide-modified oligonucleotides by co-polymerization (通过共聚固定丙烯酉先 胺改性的寡核苷酸)，"Nucleic Acids Research, 27 :649_655 (1999)，通过引用将其整体并 入本文。当配制本发明的酶固定组合物时，有必要考虑组合物的溶解性和缓冲作用。酶一 般需要接近PH 7的含水缓冲溶液，但是也有例外，例如，碱性磷酸酶。例如，据报道脲酶的 最适 pH 为 8. 0 (Wall & Laidler, The Molecular Kinetics of the Urea-Urease System IV The Reaction in an Inert Buffer (尿素-脲酶系统的分子动力学IV在惰性缓冲剂 中的反应)，Archives of Biochemistry and Biophysics 43:307—311 (1953))。然而，已 发现为了在本发明的组合物中获得最佳的酶活性，有利的是使用小于PH 8. 0的pH。在一些 实施方式中，本发明的组合物的PH为约6. 5至约7. 4。可以通过使用熟知的缓冲剂将组合 物的PH维持在该范围内。示例性的缓冲剂包括但不限于IOOmM TRIS，pH 7.6。10至200mM 范围内的TRIS缓冲剂也可用于约pH 6. 5至约8.0的pH范围。可用于本发明的其他缓冲 剂包括磷酸钠、磷酸钾、TRIS(三羟甲基氨基甲烷)，例如，TRIS-H2SO4, HEPES, TRIS-HCl缓 冲剂和巴比妥。 大部分光引发剂还在含水类溶剂中具有有限的溶解度。此外，丙烯酸树脂交联剂 也仅略溶于含水溶液。例如，发现光引发剂2-羟基-l-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲 基-1-丙酮在溶解于包含单体和交联剂的丙烯酸树脂溶液中时溶解度略高并且其可溶解 在含水溶液中。较高浓度的光引发剂是优选的。然而，重要的是光引发剂不从溶液中沉淀 出来。因此，鉴定合适的浓度范围是重要的。在一些实施方式中，光引发剂的浓度范围是约 0. 5%至约10%，例如约0. 5%至约5%或约0. 5%至约4. 0%。
包含脲酶、2-羟基-l-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基丙酮、双丙烯酰哌 嗪和丙烯酰胺单体的优选基质的微分散层显示在图2(c)和3(b)中。将基质以足以覆盖铵 离子选择性膜的受控体积分散到该膜上(参见图2(b))，然后将其暴露于足够的UV辐射下 以形成粘附在该膜上的固定化脲酶层。微分散的基质的标称体积优选为约50nL，但是可以 使用广泛的体积范围。对于具有图2中所显示的尺寸的传感器，该范围优选为10-200nL。图3显示了图解使用不同方案产生的典型印刷物的扫描电子显微照片(SEM)。对 于点固化(参见图3(b))，在微分散事件后以预定的时间间隔将各微分散小滴暴露于UV下。 对于图3(b)，各单独的印刷膜的时间域的控制如下、分散膜，、施加UV，t2停止UV，其中 、至、为0.5秒，并且、至、为0.6秒。对于图3(b)中所显示的固定化酶层，UV辐射波 长为310nm并且UV强度为2W/cm2。优选地，分散膜基质步骤、至、的范围是约0. 05秒 至约2. 0秒，例如约0. 1秒至约1. 0秒。UV辐射步骤范围优选为约0. 05秒至120秒，例如 约0. 1秒至约60秒。UV辐射波长可以在例如约260nm至约360nm变化，并且优选地对光引 发剂具有特异性。优选地，对于2-羟基-l-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮 光引发剂，UV波长为310nm。UV辐射强度可以从约0. 005ff/cm2至约50W/cm2变化，例如，约 O.OlW/cm2至约lOW/cm2。UV辐射的强度和时间是该过程的相关特征，其中一个参数的减少 通常使另一个参数的增加成为必要。此外，较短的UV辐射波长可能对敏感的生物材料具有 负面影响。因此，约300nm以上的波长是优选的。通过比较，图3(c)描绘了使用UV泛光系统(flood UV system)的固化步骤。UV 泛光固化系统需要在执行泛光固化步骤之前所有基质小滴都被微分散到基底上，例如，晶 片上。这意味着较早的小滴干燥(或凝结(set-up))的时间长于较晚的小滴。这种延迟可 能导致时间依赖性的固化结构变化。由于印刷小滴的尺寸很小，所以它们能够快速干燥， 同时组分变为不可溶的并且因此不太容易被UV固化。为了比较，图3(a)显示了由常规的 ELVACE方法形成的酶层。“ELVACE”为由亲水区和疏水区构成的乙酸乙烯酯乙烯共聚物。 ELVACE方法不包括UV固化步骤。注意到使用ELVACE结构的可变表面可能不希望地促成性 能的可变性，图3(c)中所示的结构也如此。已发现UV点固化方法提供了最符合圆顶的结构，如在图3(b)中所示，并且惊奇地 且出乎意料地产生了优异的传感器性能特征。图4显示由在校准流体中转为在血液中的点 固化丙烯酰胺BUN传感器的典型传感器输出数据，并且图5显示在血液中点固化的丙烯酰 胺BUN传感器的典型传感器相关数据。注意这些具有优异的粘附力的结构与其他结构相比 在机械方面也更稳健。在图4中，计时电位图显示了当校准溶液在时间点200处测量时的电位差，然后在 时间点201将测试样品或在这种情况下具有低尿素浓度和高尿素浓度的两种不同的血液 样品添加至传感器。在传感器输出稳定的短时间之后，在时间点202测量电位差。可以使 用时间点202与时间点201之间的电位差来确定样品中的尿素浓度。这是基于能斯特方程 (Nernst equation)，其中由经验确定斜率和截距。可以将时间点202和201的电压改变对 分析物浓度的对数进行半对数作图从而得出电压基于分析物浓度的线性反应图。在图5中，比较了新的UV固化的酶固定层(EIL)与在ELVACE(也称为成膜乳胶) 中配制的现有技术酶。实验使用了两种不同的生物传感器芯片，一种是加热的(BCL4-5)，另 一种是未加热的(BCL3-5)。使用两种不同的血液供体样品169M(雄性)和658F(雌性)。一些样品在不用额外的尿素增敏(spiking)的条件下测试，而其他的样品通过添加尿素来 修正，识别为低增敏和高增敏。对于每种测试条件建立5个套筒，并且记录以mV为单位的 原始电位差。对于每种测试样品计算5个样品的标准偏差(SD)。这些数据显示了与现有技 术基于ELVACE的方法相当的标准偏差。重要的是，对于EIL方法，发现具有一致地再现的传感器的影响是精确度的增加、 印刷厚度的再现性、改进的制造容易性和改进的产物产率。例如，图18显示对于一定范围 内的印刷厚度，测量的电位差不受印刷厚度显著影响，证明了这种EIL方法的稳健性。CV1、 CV2、CV3、CV4和CV5是分别含有如下浓度的尿素的标准测试流体152. 5,57. 8、10. 7、5. 9和 3. 4mg/dL BUN。除了尿素之外，这些溶液还含有其他盐和缓冲组分。在图18中，测得印刷 厚度为57. 3,71. 4,97. 3 μ m并且进行作图。当配制包含在基本上均勻的含水混合物中的一种或多种酶、丙烯酸基单体、水溶 性有机光引发剂和水溶性丙烯酸基交联剂的酶固定组合物时，通常需要考虑溶解度和缓冲 作用二者。酶一般需要接近pH 7的含水缓冲溶液，但是也有例外，例如，碱性磷酸酶。大 部分光引发剂还在含水类溶剂中具有有限的溶解度。此外，丙烯酸树脂交联剂也仅略溶于 含水溶液。发现优选的1-[4_ (2-羟基乙氧基)_苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮 (由Ciba-Geigy制造，Irgacure 2959)在溶解于丙烯酸树脂溶液(单体和交联剂)中时溶 解度略高并且其可溶解在含水溶液中。较高浓度的光引发剂是优选的。然而，重要的是光 引发剂不从溶液中沉淀出来并且鉴定适当的浓度范围很重要。范围在约0. 5%至约4. 0% (w/v)的浓度是优选的。由于这种光引发剂对310nm的UV光敏感，发现其一般对室内光不 敏感，并且由此发现其可用于生产过程而不需要红室或黄室制造条件。图14(a)和(b)显示用于点固化的具有优选的实际混合物组合物的基质的试剂 表。第一个实例是仅有的酶为脲酶的点固化传感器(图14(a))，而第二个实例是脲酶与碳 酸酐酶组合的传感器(图14(b))。在优选的脲酶混合物中，混合次序如下 与本申请中优选采用的丙烯酸树脂制剂相比，通常用于电泳凝胶的丙烯酸树脂具 有高的单体与交联剂浓度比。电泳型树脂(例如，丙烯酰胺和双-丙烯酰胺)通常的单体 浓度和交联剂浓度分别为0. 2g/ml和0. 007g/ml，而本发明的优选基质具有单体浓度和交 联剂浓度分别为0. 05g/ml和0. 02g/ml的丙烯酸树脂制剂。认为这种较高的交联剂与单体 的比率有利于在固化和干燥期间减少微分散印刷的物理改变。在多个实施方式中，组合物 包括大于约0.04 1的交联剂与单体的重量比率，例如大于约0.1 1或大于约0.3 1。 这些比率还有利于传感器与生物样品(例如，血液)水合。为了实现所期望的单体交联 剂的比率和防止从溶液沉淀出来，在优选实施方式中用表现出较高的水溶性的1，4_双(丙 烯酰)哌嗪(BAP)代替典型的凝胶电泳交联剂双-丙烯酰胺。晶片制造和生物传感器优选使用硅晶片作为在其上产生生物传感器芯片的固体基底。其他材料如塑料氧 化铝和玻璃可代替硅，然而前者是用于高体积(例如每年数百亿的仪器)制造平坦结构的 方便材料。在硅上，在特定位置添加材料层以产生一组单个的芯片。这些方法是本领域的那 些技术人员所熟知的。对于本发明，优选通过热解在硅上形成二氧化硅薄层。然后将钛或 钛-钨合金溅射下来并且光形成(photoform)于二氧化硅层顶上。这用作粘附银和其他金
13属的层。在此实例中，使用熟知的方法将银和氧化银形成于芯片上，如图2(a)所描绘的。在 图2(a)中，用于连接至分析仪仪器的接触垫350与多个传感器和电连接器连接。具体地， BUN传感器353的下层含有银和氯化银。氯离子传感器352也具有银/氯化银层。接地电 极351是与样品具有多个接触点的光形成的氯化银电极。它形成接地电位以供芯片上其他 传感器的电测量。参比电极结构由354描绘，并且详细描述于美国专利第4，933，048号和 公开的美国申请第20070015977号中，通过引用将它们整体并入本文。这些层优选在它们 的处理中使用若干光可界定(photo-definable)的掩膜以容许材料在特定位置准确沉积。图2(b)描绘该过程中的下一步，其中将铵离子载体层355沉积在图2(a)所显示 的BUN银/氯化银沉积物顶上。铵离子载体层及其制备方法描述在美国专利第5，200，051 号中，通过引用将其整体并入本文。这之后是微分散图2(c)中所显示的氯离子(CL)传感 器352以及图14中所述组合物的基于UV的BUN EIL膜356。图1以拓扑方式描绘根据本发明的一个非限制性实施方式的BUN传感器的横切 层。所显示的BUN传感器包括附图2(a)-(c)中所表现的方法中所描述的参考传感器。硅 晶片320覆盖有二氧化硅层315，以及钛或钛-钨合金310，继而是银305和氯化银304。在 银/氯化银层之上印刷PVC离子载体组合物325，继而是含有脲酶酶的EIL酶层311。在图1中，参比电极也含有发现直到银/氯化银层304的所有上述层，但是还含有 电解质层312、气体透性膜308并且任选地经光致抗蚀帽(photoresist cap) 309处理。自动化集成的微分散和点固化系统在本发明的优选方面，本发明的微制造方法是自动化系统，该系统能够在感兴趣 的传感器中所用的平坦表面材料的选择区域微分散精确的且可编程的量的材料并且还通 过UV辐射的方法提供集成的固化，优选点固化。本方面中的关键概念是控制关于微分散步 骤的时间域以及随后UV暴露步骤的时间控制和持续时间。此处，时间域的控制通常为百分 之几秒。这与对于微制造的仪器所熟悉的高体积制造方法是一致的。在一个实施方式中，分散头包括具有基质储器的注射器针和用于控制来自注射器 并到达所选表面上的分散体积的排放器件。该装置还包括用于相对于分散头和所述UV辐 射源二者移动表面(例如硅晶片)的步进重复机构，从而使得能够在一组预选位置形成固 定化酶层阵列。优选地，被分散的受控体积在约InL至约10 μ L的范围内，例如，约5nL至约1 μ L 或约50nL至约0. 1 μ L，并且分散的体积将覆盖约10平方微米至约75平方毫米的范围内的 区域。优选地，此区域基本上为圆形的，其半径尺寸范围是约5μπι至约5mm。在优选的实施方式中，该系统提供了通过在表面上一组预选的位置分散一系列受 控体积的光可形成的基质(例如，本发明的上述酶固定组合物)在基本上平坦的表面上形 成固定化层的有组织的阵列的方法。这之后在基本上覆盖各预选位置的区域上施加UV辐 射束。重要的是，这是按顺序发生的，在分散每个受控体积后的预定时间开始并且以预定的 强度施加所述辐射一段预定的持续时间，从而形成固定化层的所述固定化阵列。优选地，预 定的时间在约0. 1秒至约10秒的范围内，并且预定的持续时间在约0. 1秒至约10秒的范 围内。优选地，该方法使用的UV辐射波长范围是约185nm至约400nm并且具有约IOOmW/ cm2至约lOW/cm2范围内的强度。如本领域的专业人士所已知的，固化可以通过在所选位点 产生特定剂量的UV辐射来实现。熟知的是时间、强度和距离参数全都会影响UV辐射剂量并且可以调节它们来产生特定的UV剂量。通常，高强度能够产生更多热并且能够对该过程 有其他影响。优选的方法还使用为硅晶片的平坦表面，并且预选的位置组为通常基于X-Y 阵列中的单元电池的所述晶片上的传感器阵列。关于印刷步骤后的UV暴露的定序，该方法 优选以如下的方式操作其中将UV辐射束施加至Nth负X预选位置同时分散发生在Nth预 选位置。通常，X等于从1至10的整数。在脲酶膜(311和356)的优选实施方式中，参数 UV暴露参数包括310nm波长、暴露于4. 2ff/cm2的辐射0. 56秒。图6图解根据本发明的一个实施方式的微分散系统。如所显示的，微分散系统包 括真空吸盘(vacuum chuck) 106和注射器102与105，它们的每一个都连接在单独器件上， 所述单独器件用于改变这些元件的垂直、水平、侧向或旋转移位中的一个或多个。出于经济 的原因，只要人们可以多个方向地改变真空吸盘的位置，则具有改变注射器垂直移位的器 件就足够了。两种元件的移动均可以经由个人电脑来控制。在一个方面，真空吸盘的位置 可能在士51微米内可再现或在χ和/或y方向的任一方向或两方向更佳，并且吸盘的平面 度在1微米之内。可以将本发明优选实施方式的基质制剂加载到微注射器组件102中用于以可控 方式建立层的目的。微注射器组件优选配备有25至30个内径为150 μ m且外径为300 μ m 的规针(gauge needle) 105。通常，包括细长构件和针尖的微注射器针105由金属材料制 成，例如像不锈钢。可以将额外的层涂覆到针上以改变其表面性质。此外，也可以采用诸如 合成的聚合物的其他材料来制造针的主体本身。依据电极表面的预处理和所应用的流体的 体积量，可以一致地获得厚度范围在约1 μ m至约200 μ m的膜层。UV固化微分散子系统(图6)任选地包括与管道连接的阀101，所述管道连接至针 夹持器和筒102以及针105。微分散的小滴可以使用显微镜100进行光学监测。微分散的 小滴使用来自聚焦透镜组件104的UV光进行固化，该聚焦透镜组件104使用来自任选的光 导纤维103的辐射。非限制性图7显示在使用来自光导纤维103的辐射的聚焦透镜组件104中聚焦的 辐射，该辐射是由UV灯箱150中的UV灯泡151产生的。如所显示的，光辐射的量和暴露时 间是使用灯箱150中的遮光器/缝隙(shutter/aperture) 152来控制。后者任选地使用电 脑算法来进行。微分散系统的一个非限制性实施方式还在图8 (a)中图解，其中气动阀101产生压 力用于系统沿管道132进入针夹持器和筒102。如所显示的，针夹持器和筒102由握持注射 器130的注射器壳体131握持。注射器130容许微分散的小滴穿过针105传递。UV聚焦透镜组件104的任选实施方式还在图8(b)中图解，其中经由光导纤维103 将UV光通过光导管(light guide) 405提供给集中器壳体(concentrator housing) 401 集中器壳体401是使用固定架400附连至光导纤维103。在此实例中，光是用两个透镜403 聚焦的，这两个透镜由透镜架402中的透镜定位架(lense spacer)404保持在适当位置。一 个透镜可能就足够，但是其他任选的透镜是任选的并且为本领域的那些技术人员所理解。用于微分散和UV固化的任选的电脑控制过程可以通过图9中所描绘的算法进行， 其中针上移并远离X-Y盘，X-Y盘继而被置于第一印刷位置。针下移到极接近于印刷位置， 然后产生印刷压力达一段短暂的时间。然后在印刷压力完成分散微滴后将针升起。与微分 散过程同时发生的是，一旦X-Y盘将其本身设置在新的印刷位置，拖动的UV固化过程便开始并在X-Y盘再次移动之前完成。在每个印刷位置重复这个过程直至所有的位置都被印刷 和固化。可以被再现地分散的小滴大小在广泛的范围内延伸。对于约5至约500纳升(nL) 之间的体积大小，可以优选地应用具有约5%的精确度的小滴。具有0. 精确度等级的螺 线管足以用于此目的。取决于待分散的体积，传感器上方注射器针尖的高度优选在约0. Imm 至约Imm之间。一般地，小滴体积越小，则针距离传感器的上升高度就越低。注射器针与传 感器预选区域的精确对准可以借助于照相机和十字线(reticle)从光学上实现。这种操作 可以通过操作员手动进行或借助于视觉识别系统自动进行。后者是优选的。当单个流体滴形成并被排出针时，考虑所涉及的动力学是有用的。随着更多流体 从针尖排出，小滴尺寸将增大直到作用于小滴质量的重力超过维持小滴与针尖接触的反作 用力。这些反作用力包括针尖与流体或液体之间的粘附力和液体自身的表面张力。已经充 分确定在完全形成不连续的小滴的低液体流速下，小滴体积是固定的。然而，可以通过改变 上面所讨论的任何流体相关参数或通过改变针尖的直径由此改变用于流体粘附的可用表 面积来改变该体积。例如，将疏水的聚四氟乙烯(PTFE)涂层施加于针尖通过降低小滴与针 尖之间的粘附力而降低含水类基质材料的天然小滴尺寸。在其中必须将受控体积微分散到 表面上的情况下，有可能使微注射器尖设置在平坦的表面上方一段高度上，该高度不容许 小滴完全形成(并且然后在重力的影响下落到表面)，但是部分形成的小滴实际上接触表 面并且液体与表面之间的新的粘附力开始使小滴展开。如果现在针尖在Z-方向上远离表 面缩回一段足够的距离，则液体的内聚力被克服并且小于固定小滴尺寸的液体体积保持与 表面接触。这种技术可以用于从千分之一或更大的固定小滴大小再现性地分散任何体积的 液体。纯液体与其汽相之间的表面张力可以通过添加试剂来改变。例如，添加至水中的 脂肪酸降低表面张力，而添加的盐则可增加表面张力。本发明的可微分散的流体组合物优 选被制备成具有受控的优化的表面张力。在需要时可使用合适的添加剂。流体的疏水性或 亲水性以相同的方式被控制。当需要固化膜作为终产物时，优选地小心调节固体含量和挥 发性溶剂含量。此外，还使用这些组分的比率来控制粘度。用于铵离子传感器的优选的可微分散的组合物包含PVC聚合物、增塑剂、离子载 体和溶剂，其粘度一般高于用于膜的平面浇注(例如，旋涂)的那些组合物的粘度。这些较 高粘度的组合物固化或干燥而不使膜层变形。这些组合物还减轻了相关的问题，例如，确保 高粘度基质的均勻性并由此防止一段时间后(即，关于货架期的考虑)材料的相分离。还 使用其他添加剂来防止膜的长期降解。除了与具有优化的表面张力(与指定的组合物相关)的流体的受控体积分散有关 的上述因素外，调整基底或表面(其上分散流体)的表面自由能提供了对所得层的最终尺 寸尤其是厚度的控制。所得的方法是高度多用的，容许具有不同组合物和效用的层的阵列 的沉积。为了确定膜厚度(例如，40-60 μ m厚)，优选地调整表面使得微分散的流体与该表 面所成的接触角很大。例如，在微分散含水类酶基质之前，可以首先对表面进行等离子体处 理以给出受控的接触角。对于优选的脲酶基质，四氟化碳等离子体步骤产生50° -70°范 围内的接触角。此处所述的微分散系统的改良方面是自动的点固化部件的集成。EXFO OmnicureUV系统是集成所优选的，因为其能够连续地监测和调节光缝隙来确保整个过程中辐射强度 保持一致。这通过使用50%强度作为设置点而改善了典型的UV灯泡强度随其寿命(约 2000工作小时)而降低的问题。因为在固化时间和灯泡强度之间存在关联，所以需要相当 高的设置来降低产物处理时间。UV固化方法的另一方面是希望将光束聚焦在特定传感器以避免UV暴露于其他传 感器。需要适当的聚焦光束以避免过于有限。这是因为用于对准被处理的各传感器的显像 系统需要足够的柔性来确保在它们没有被准确对准的情况下的稳健过程。强度与UV光束 距固化位点的距离相关，因此，通过更接近固化位点增加强度并且降低产物处理时间。尽管本发明主要从具有微制造的离子选择性电极的硅晶片方面来描述，但是可以 制造其他类型的传感器来掺入到表面，本公开的组合物可以被分散或涂布到所述表面上。 这些传感器包括光学传感器、光纤传感器、声表面波传感器、消逝传感器、表面等离子体共 振传感器和光波导传感器。它还包括各种基部传感器(base sensor)，例如，电极、离子选择 性电极、电位测定电极、电流型电极、电导电极、酶电极、生物传感器、光学传感器、光纤传感 器、声表面波传感器、消逝传感器、表面等离子体共振传感器和光波导传感器。用于传感器 的制造的基本上平坦的表面可以包括硅晶片、氧化铝晶片、液晶基底、玻璃基底和塑料基底 以及柔性塑料基底。在优选的实施方式中，将成膜组合物暴露于足以引起明显交联的UV辐 射中，从而在表面上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。优选地对集成的微分散和UV固化仪器自动编程以便优化制造过程的时间并实现 UV固化。微分散和UV固化的步骤优选地串联进行。在优选的方面，UV固化步骤进行约0.5 秒，而微分散步骤进行约0. 3至0. 4秒。因此，微分散步骤的速率通常受印刷位点之间约0. 1 秒的转位时间(indexing time)限制。微分散和UV固化子系统优选地在相同的时间段内 在两个不同但相邻的物理位置操作，其中微分散步骤在UV固化操作之前和前面进行。图9 提供了优选的操作算法。具有集成的UV辐射源的分散装置优选地具有套准和对准器件，该套准和对准器 件能够将辐射光束聚焦到基本上覆盖基质滴所分散的位置的区域上。电脑器件能够打开和 关闭UV辐射，并且这在基质被分散后在预定的时间发生并且持续一段预定的时间(并且还 以预定的强度进行)。套准和对准器件容许光束被聚焦在所述表面的所选区域并照射约10 平方微米至约75平方毫米范围内的区域。每个晶片优选地用多个芯片制造(通常在5英寸的晶片上约1000个芯片)，每个 芯片含有一个或多个传感器并且在此情况下每个芯片含有BUN传感器。希望这些传感器在 晶片上以均一的X-Y布局排列。对于优选实施方式中的晶片处理，芯片优选地是通过如下 产生的首先将胶带置于晶片背面，然后使用例如金刚石切割机(diamond dicing saw)将 晶片裁切成单个芯片。此过程引起与芯片在晶片上的原始位置相比轻度的移位和不均勻的 布局。为了补偿此现象，使用如图6中所描绘的显微镜100连同视觉识别软件一起再次对准 用于微分散过程的芯片。对于UV固化系统的初始对准和套准来说，使用UV敏感性纸来确 定正确的对准。可选择地，可以在光导管103上方插入可见光源来代替UV光源151以便对 准和聚焦UV固化位点。又一替代方法是使用具有焦点的UV检测仪器(辐射计)并且使用 强度和活性来对准和聚焦UV位点。注意，可选择地，切割步骤可以在分散和点固化之后进 行，然而需要小心以确保用于切割刀片的水冷却剂不会产生损坏固化膜的切割粉尘。在基底是塑料的而非硅晶片时，切割是通过更简单的切削过程进行的，其中粉尘损坏不是问题。 此处优选在分散和点固化之后切割。使用改良的传感器的套筒构建然后将上述切割的硅芯片优选地用作一次性塑料套筒的子部件。各套筒通常含有 若干部件，这些部件容许其用分析仪器处理患者样品并测定样品中分析物如尿素的存在或量。参考附图，用于接受本发明的芯片的套筒包含罩(两个视图)，图10、图11 ；基部 (base)，图13 ；以及设置在基部和罩之间并将它们固定在一起的薄膜粘附垫圈，图12。具 体地，图10中所显示的罩的背侧与图12的垫圈的暴露面匹配，并且垫圈的背侧与图13的 基部的暴露面匹配。现在参考图10，罩1由刚性材料优选塑料制成并且能够在柔性铰链区 (flexible hinge region) 5、9、10反复变形而不开裂。罩包括盖子2，盖子2通过柔性铰链 9附连至罩的主体。在操作中，将样品引入样品保持室34中之后，可以将盖子固定在样品 进入口 4的入口上方，借助于可变形的密封件11防止样品泄露，并且盖子通过钩3保持在 适当位置。罩还包括两个可相对于罩的主体移动的桨6、7，这两个桨通过柔性铰链区5、10 附连在罩上。在操作中，当通过泵器件运转时，桨6对气囊施加力以在套筒的管道内移动流 体，所述气囊由薄膜垫圈21所覆盖的腔43构成。当通过第二泵器件操作时，桨7对可以变 形的垫圈21施加力。套筒适于插入到读数装置中，并且因此为了此目的具有多个机械连接 和电连接。还应明显的是对套筒进行手动操作是可能的。因此，将套筒插入读数装置中后， 读数装置将压力传送到位于腔42中装有约130 μ L的校准流体的含流体箔包上，在钉38上 使包装破裂，并将流体排入管道39中，管道39经由在基部的短横切管道连接至传感器管道 16。当校准流体接触传感器时，传感器润湿并建立与流体中的校准离子或分子的量相关的 信号。参考图12，薄膜垫圈21包含多个洞和裂缝以促进基部和罩中的管道之间的流体 转移，并容许垫圈在需要时在压力下变形。洞30和33容许在切去部分(cutaway) 35或37 中所容纳的一个或多个尿素传感器和一个或多个参比电极与管道16中的流体接触。参考图13，管道34是在组装的套筒中连接样品进入口 4与第一管道16的样品保 持室。切去部分35和37是接纳本发明的芯片的壳体中的位置。任选地，它们还容纳用于 测定空气_液体边界位置的电导传感器。凹处42容纳含流体的包装，如可破裂的袋，该包装 在组装的套筒中由于插入读数装置中时施加在桨7上的压力而被钉38刺穿。来自被刺穿 的包装的流体在39处流入第二管道，然后流入管道16。气囊由凹处43构成，凹处43在其 上表面被垫圈21密封。气囊是泵器件的一个实施方式，其通过施加于桨6上的压力开动， 桨6排放管道40中的空气，从而将样品从样品室34排放入管道16。形成和固定膜阵列的改良方法在一个实施方式中，制造BUN传感器的方法需要两个独立的印刷事件。第一步包 括NH4+离子选择性电极(ISE)印刷步骤，随后是脲酶层印刷步骤。如上文所述，印刷过程优 选地使用气动泵和阀，并且在X-Y台顶上面具有细规针以将小滴准确地微分散到晶片上的 特定位置。几种可控因素有利于整体传感器的性能。这些因素包括(i)在所期望的位置上 印刷的小滴的准确套准、( )小滴的适当粘度和表面张力、(iii)相关的表面疏水性、(iv) 小滴的高度和宽度(或体积)、(ν)小滴在表面上干燥后的高度、以及(vi)良好的粘附力。
18此外，晶体的形成(分割)或已干燥的微滴的开裂可能不利地影响传感器性能。现有技术的酶膜(参见，例如美国专利第5，200，051号)是由成膜乳胶优选 ELVACE (Forbo Adhesives Synthetic Polymers,Morris, Illinois)构成。然而，这禾中不均 勻材料可能易于干燥并且阻塞微分散针尖，这可能对制造具有不利影响。ELVACE的表面张 力还可能产生不规则形状的结构，这可能影响传感器的性能。参见图3(a)。此外，ELVAC为 由亲水区和疏水区构成的乙酸乙烯酯乙烯(VAE)共聚物，它可能随时间降解，最可能产生 使材料酸性更强的乙酸根。这种时间依赖性过程降低了材料的使用寿命。结果，希望用实 质上更稳定的组合物代替这种不均勻基质，所述更稳定的组合物优选地为均勻含水基质， 所述均勻含水基质可以光形成的并且为酶如脲酶提供稳定的固定环境。本发明解决了几种寿命问题，包括原材料的寿命、印刷前含水基质的寿命以及在 成品传感器中的印刷基质和固化基质的寿命。它还经受得住与终产物中血样的接触而不会 溶解掉。这提供了对于可靠的传感器性能所高度希望的良好粘附特征的证据。对于可靠的制造方法来说最重要的是，本发明提供了在约4°C至约35°C范围内的 储存温度下保持在溶液中而没有亚组分沉淀的可微分散的基质。它还可以冷冻储存，并融 化以供使用而无有害作用。有利的是，基质组合物在延伸至约至少200 μ m的范围内的厚度 下印刷还具有足够的UV透射以便在整个基质中具有高聚合物转化度。本发明是有利的，因为基质在印刷过程中以低粘度状态存在并且然后通过UV辐 射被可控地转化为凝胶状态或固定状态。这种使用UV固化过程的受控方法需要在制剂中 掺入UV光引发剂。这还需要可以产生导向至被固化的部分的受控的UV辐射的固化系统。 这种UV固化系统的这种具体说明需要提供(i)简单的自动化；(ii)对与印刷系统相容的 短循环时间的操作；(iii)避免固化过程期间破坏切割的晶片；(iv)避免对烘箱或热固化 步骤的需要；和(V)避免对连续的基质混合的需要。此外，希望避免不必要的材料浪费。如 先前所提到的，从制造观点来看，如果大批量的材料被制备、预等分并以冷冻形式储存，本 发明也是有用的。本发明容许稳健的制造工艺。稳健制造工艺的方面容许在该工艺中的每一步骤都 具有某个精确度范围，同时产生一致的产物结果。对于该工艺的一个步骤，印刷厚度可以略 微不同。从数据(参见图18)有利地发现平均电位信号不依赖于印刷厚度。此外，在许多 晶片中这些值的标准偏差完全不依赖于印刷厚度。这容许有广泛范围的酶层厚度而不影响 产物的性能。可以使用多种UV系统，包括光棒(light wand)、具有或不具有烘箱步骤的UV泛光 固定以及光导管系统。UV激光也可以用于这种工艺以将聚焦的辐射束传递至印刷的传感器 位点。对于在硅晶片或诸如玻璃和塑料的类似基底上固化印刷膜的过程，需要将光棒设置 在每个印刷位置上。这可以将固化步骤时间增加nxt，其中η是芯片/印刷位置的数目并 且t是每个UV固化步骤的以秒计的时间。在一个实施方式中，UV固化步骤是由将光棒准 确地移动到各连续的印刷位置的系统提供。光棒的移动结合有每个印刷位置的印刷事件。对于其中UV源的移动不依赖于印刷头的系统，基质首先由印刷针印刷在特定位 置。印刷针移动远离表面，优选在Z方向上。然后UV源移至位置中，随后是在该印刷位置 的UV固化暴露。在其中UV源拖动一段距印刷位点的固定偏移时，印刷针以打字机型印刷过程的方式印刷(例如，由左至右，然后返回左侧并且转换到印刷位点的下一行，再次从左至右处 理)。UV源位于远离印刷针位置的一个或多个印刷位点η。印刷针印刷第一印刷位点，然 后印刷另一印刷位点直至其到达η个印刷位点。跟随在印刷针后的是UV源。一旦UV源 位于左侧第一印刷位点，远离印刷针η个位点，则UV源暴露并固化印刷位点。当印刷针移 至下一印刷位点时，UV源也移至下一位点，并且当印刷针分散基质时，UV源暴露印刷位点。 这种印刷和拖动UV固化过程持续到印刷针到达平坦表面的右侧。为了完成UV固化过程， 针继续向右移动，UV源随之移动继续固化剩余的η个位点。可以对印刷针编程以停止印刷 剩余的印刷位点。将印刷针和UV源转换到待印刷的下一行并且在平坦表面的左侧开始设 置。本领域的那些技术人员应了解印刷针和UV源可以被固定在它们的位置，并且可以移动 支持平坦表面的台以实现印刷针和UV源移动至各单独印刷位点。本领域的那些技术人员 将认识到可以使用其他工程套准器件来实现确保时间域的一致控制的目的，以使得各分散 层在印刷后固定的时间且以固定的方式被固化。在优选的实施方式中，使用光导管。光导管为有效地用于光的导管，其中光被聚焦 到小的晶片区域上并且其中光不是从UV源以直线传递的。UV辐射由光纤连接沿光导管指 引。这具有光棒系统的优点，在光棒系统中，灯和滤器被包含在电源盒中并且“闪光灯”使 用在固化位点位置处的极小的足印。此外，UV辐射含有较少的来自红外辐射的附加热，并 因此保持固化的部分冷却。在基质中存在的特定光引发剂需要特定的辐射波长时，这通过选择适于那种特定 光引发剂的特定UV灯泡来达成。大部分的标准UV灯泡产生多种波长，一些是希望的而一些 未必是希望的。在具有生物材料的应用中，优选的是具有特定辐射波长而在其他波长处没 有额外的无关辐射。注意，在科学文献中熟知的是UVC辐射的生物损害性低于UVA或UVB。 因此，避免或限制这些波长对于生物样品是优选的。在使用Irgacure 2959的优选基质制 剂中，优选的辐射波长为约310nm。常见的UV灯泡使用汞(“H”型)和金属卤化物(“D”)， 它们都可用于固化，因为它们产生含Irgacure 2959光引发剂的基质所需的UVA和UVB辐 射。然而，“H”灯泡具有较少的无关辐射波长并且是优选的。对于UV系统有益的是具有集成的滤光器，该滤光器容许特定波长的非离子辐射 通过同时阻止不希望的波长透射。在优选的实施方式中，光引发剂需要近310nm的辐射。作 为限制传感器暴露于有害波长的辐射的手段，可使用诸如有效地仅容许约300nm至340nm 波长的 Gilway and International Light Technologies 公司(Peabody，MA)Narrowband Filter NS313的窄带滤器用于优选的实施方式。单独使用或组合使用影响对于某些其他光 引发剂特异的合适辐射波长的其他滤光器对于本领域的那些技术人员来说将是明显的。在优选的实施方式中，光导管系统(图6、7和8b)具有点固化能够将光导向特定 位置的优点。此外，它可以被容易地过滤，并且不产生在过滤红外(IR)辐射的基于泛光暴 露的系统中所发现的热。它也不需要单独的遮光器系统，因为这种部件已经集成到了仪器 中。这种方法对于集成微分散系统来说也是期望的，因为可以将电源设置在微分散壳体的 外侧，仅将光导管和集中器壳体及其相关透镜插入微分散单元内部以使足印达到最小。期望UV可固化的酶基质具有下列特征(i)与酶的相容性，并且尤其对于优选的 实施方式与酶脲酶的相容性；(ii)表现出适当的流动性和粘度以便具有良好的印刷特征； (iii)与可以支持高产率制造工艺的可靠化学制剂的相容性，例如掺入用于改善基质货架期的抗微生物剂和用于稳定酶的试剂；(iv)为支持生物试剂的基于水的技术；(V)UV固化 步骤后得到对表面的可靠粘附力；(Vi)当与传感器结合使用时，提供快速的润湿；(vii)在 形成作为支持和保持酶反应的层时表现出适当的酶底物透性和透水性；(viii)当与电化 学传感器一起使用时表现出良好的电气特征；以及(ix)在室温下或在冷藏时显示出大于 约6个月的延长的后处理寿命，例如与真正的商购产品要求相符。图14中所述的组合物具 有这些希望的特征。本文所述的UV固化系统可以与各种UV可固化的制剂一起使用以表征许多操作参 数，包括固化膜尺寸的精确度和准确度以及膜对表面的粘附力。然后可以将传感器在套筒 中测试以测定对于给定的基质和固化组合的传感器性能。这可以包括晶片内和晶片间变 动，其中每个晶片可以包含多至一千个传感器。在图16中是辐射对基于图14(a)的基质的传感器性能的作用。使用泛光灯法和 具有辐射剂量分别为190,380,760和1140mJ的0. 5s、ls、2s和3s点固化UV辐射的方法制 备了多个批次的传感器。这些数据显示所述方法是稳健的，且不同的辐射条件给出可接受 的测试结果。图15展示含有替代单体和交联剂的组合物产生了与测试溶液类似的传感器信 号。测试的单体包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、聚(乙二醇)丙烯酸酯(PEGA)和N-[3-( 二 甲氨基)丙基]_甲基丙烯酰胺(DMAPMA)。此外，测试的交联剂包括1，4_双(丙烯酰) 哌嗪、聚乙二醇二丙烯酸酯聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)、N，N' -(1，2-二羟亚乙基) 双-丙烯酰胺(DHEBA)和三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯(TMPETA)。图17显示在加速的寿命储存条件(例如，30°C或40°C )下缺乏湿润剂甘油时对性 能有影响的实验。通过向已有的基质(参见图14中的组合物)中添加甘油，得到了具有良 好的性能和货架期的方法。在一个方面，本发明的目的是改善BUN(血液尿素氮)传感器的制造。新BUN传 感器的优选实施方式是使用薄膜微制造方法与微分散技术的组合制造的。它包括与美国 专利第4，933，048号(通过引用将其并入本文)中所述类型的薄膜银-氯化银参比电极 的组合操作的薄膜银-氯化银指示电极。更优选的参比电极描述于公开的美国申请第 20070015977号中，通过引用将其整体并入本文。在初始步骤中，通过热氧化用二氧化硅绝缘层覆盖硅基底晶片。随后将钛与 钨的合金(TiW)的金属层和银金属层沉积到二氧化硅基础晶片上，然后使用光刻技 术将其图案化。然后将诸如聚酰亚胺聚合物或另外的二氧化硅的电绝缘层光图案化 (photo-patterned)以隔离相邻的传感器电路。银-氯化银指示电极(直径约200微米) 是在存在氯离子的条件下使用标准技术由图案化的银制备的，所述标准技术例如电化学、 氯气等离子体和通过诸如Cr2O72-或Fe3+的无机氧化剂对Ag°进行的氧化。BUN电极的剩余层包括两个厚膜结构(i)半透性膜的膜，其包含有机聚合物层 (例如，聚(氯乙烯)-PVC)和铵离子离子载体；和(ii)最外侧的生物层，其在此具体传感 器中包含点光固化的丙烯酰胺脲酶层，该丙烯酰胺脲酶层任选包含碳酸酐酶。这些层通过 美国专利第5，554，339号中所述的微分散技术沉积，通过引用将该专利并入本文。然而在 本发明中，对‘339专利中所描述的微分散部件进行了实质性改良以使其包括集成的紫外
21点固化组分系统从而使得能够在受控的时间域内自动的印刷和固化，如上文所描述的。厚膜的铵离子敏感结构包含聚(氯乙烯)(PVC)粘合剂、作为增塑剂的三(2-乙基 己基)磷酸酯和作为离子载体的无活菌素。可以通过使用相同的(或类似的)粘合剂和增 塑剂组合物但用不同的离子载体使指示电极对不同的离子具有选择性。例如，缬氨霉素、莫 能菌素和(甲基)莫能菌素、以及三(十二烷基)氯化铵已被分别用于制备钾离子、钠离子 或氯离子选择性电极。其他离子载体可以包括但不限于冠醚、三烃基胺或磷酸酯以及类似 物。可选择地，除PVC外可使用其他聚合物粘合剂材料。这些聚合物可以包括例如，硅橡 胶、聚四氟乙烯塑料或含有可电离的官能团(例如，羧酸根)的PVC衍生物。适合于在本发 明中使用的其他增塑剂可以包括但不限于三(2-乙基己基)磷酸酯、硝基伞花烃、2-硝基 苯基辛醚、癸二酸二丁酯、己二酸二乙酯、邻苯二甲酸酯、碳酸亚丙酯、5-苯基戊醇或它们的 混合物。本领域的那些技术人员可以知道还有其他的粘合剂和离子载体组合，它们在本发 明的范围内。所得的半透性离子选择膜可以具有约2微米至约200微米，优选约10微米至 约30微米范围内的厚度。在优选的实施方式中，选择铵离子选择性膜溶剂系统以提供适 当的表面张力和稳定性。增塑剂、PVC聚合物和离子载体的固体含量(wt% )优选分别为 60-80% U5-40% ^P 0. 5-3 %。可以使用多种方法来限定平坦基底上的层。如果需要厚层(约5微米至约200微 米)，则一般优选粘稠的基质的微分散，例如上述的光可固化的脲酶基质。用于在平坦基底 上限定层的其他方法包括但不限于旋涂、浸涂、喷涂、丝网印刷、喷墨印刷、激光印刷、涂抹 和接触印刷，它们是替代性方法并且可以更好地适用于不同的应用。例如，可以在特定的时 间(t = 0)在单次运行中将优选的脲酶光可形成的基质丝网印刷到晶片上。丝网任选具有 300 μ m直径的开口，其中将各开口套准以便与晶片上的铵离子选择性膜的阵列对准。在印 刷步骤之后，在t = 1时进行晶片的UV泛光暴露。与上述点固化方法类似，此方法也对各 单个基质给出了从印刷到UV步骤的时间域控制。在这个实施方式中，t = 1优选被自动设 置在t = 0后的2-20秒。用于将晶片从印刷地点移动到暴露地点的自动化设备是制造领 域内所熟知的。还可以用制造领域内广泛使用的方式将优选的脲酶基质旋涂和用掩膜进行 光图案化。现在参考图1中的拓扑图解，基底晶片320是硅，其具有覆盖的二氧化硅绝缘层 315。此外，具有聚酰亚胺层301，该层具有用于限制印刷的层的两个圆环形印刷孔(302， 303)。第一金属层310为TiW，并且它发挥着导体和对晶片的粘附层的功能。随后的层305 和304是银和氯化银层。在图1的左侧，指示电极的剩余层包括(i)半透性膜的膜325，其 包含有机聚合物层(例如，聚氯乙烯(PVC))和铵离子的离子载体；和(ii)最外侧的生物层 311，其在此具体实施方式
中包含上文所述的优选组合物的丙烯酰胺光固化的脲酶层。单元电池的参比电极部分可以由如图1中所示的覆层结构构成。在这个具体的实 施方式中，参比电极的金属层和氯化的层被电解质层覆盖，该电解质层可以包含能够保持 高盐浓度的任何材料，但该材料优选为光可形成的。在此方面，聚乙烯醇(PVA)制剂是优选 的材料，并且可以首先被光图案化并形成透水性基质，该透水性基质可以随后用诸如氯化 钾的盐饱和。还可以存在单独的透气性膜，该透气性膜用于减少总分析样品的电解质或盐 的损失但容许在开始样品分析之前参比电极的快速润湿(即，水或其他小气体分子通过) 参比电极。图案化方法可以是美国专利第4，933，048号和公开的美国申请第20070015977号中所述的方法，通过引用将它们并入本文。可选择地，可以使用这样的参比电极结构其 中在液体交汇处与银/氯化银表面之间的距离足够大以便使在紧邻Ag/AgCl结构的电解质 浓度在一段时间内基本上恒定，在该段时间内足以进行指示电极与参比电极之间的电位差测量。现在参考图2，指示电极和相邻参比电极各自通过过钝化的(overpassivated)信 号线连接至接触垫。过钝化层(聚亚酰胺层)包括形成为同心圆的印刷孔302和303。单 元电池被界定在矩形的区域内，该区域在单个硅晶片上在阵列中重复数百次。在本发明的具体实施方式
中，其他指示电极可以存在于单元电池中以便除铵离子外还同时测量其他种 类(例如，Na+、K+、Cl_)。为了制造BUN基部传感器，将之前已经用浓硫酸和过氧化氢的混合物小心清洁过 的具有二氧化硅表层的硅晶片放置到等离子体沉积系统中并且将TiW层(0. ιμπι)和银层 (Ο.δμπι)连续地溅射到晶片表面。然后处理银-钛双层使其定位于在最终的仪器中充当铵 离子传感器的区域中。该过程是通过标准的平板印刷技术达成的，在该技术中用正型光致 抗蚀剂(Shipley AZ 1370SF)旋涂晶片。在光致抗蚀剂通过掩膜UV暴露和显影(Shipley AZ 351)后，通过作为蚀刻剂的硝酸铁水溶液(0.9mM)移除暴露的银。然后借助于相同的 光刻步骤处理下面的钛层，但是使用硝酸(3. 9M)和氢氟酸(0. 78M)的含水混合物作为蚀刻 剂。然后使用N-甲基吡咯酮溶剂来移除剩余的光致抗蚀剂以暴露所需的银结构(直径约 150 μ m)。为了钝化信号线，将光可界定的聚酰亚胺(DuPont 2703)旋涂到晶片上。一旦晶 片被暴露于UV并用溶剂显影后，将聚合物在350°C的烘箱中在惰性气氛下烘烤30分钟，并 使其冷却至150°C，然后移出。尽管用于图案化的掩膜限定了层的周界，其也限定了印刷孔 302和303。这些随后被用于控制两个对应的微分散膜的尺寸。然后优选通过将整个晶片浸入重铬酸钾(12mM)和盐酸(60mM)的含水溶液中来将 银氯化。然后洗涤晶片并部分切割。在这些图案化的氯化银电极之上放置铵离子敏感的膜。 通过如下制备膜材料将低分子量PVC (Sigma)和高分子量羧化PVC (Type Geon, Goodrich) (1 1 w/w)溶解在环己酮、苯丙酮和N-甲基吡咯烷酮(1:1:1 ν/ν/ν)的溶剂系统中 至总固体含量为10g/dL的溶液。溶解是通过在70°C下加热混合物30分钟来完成的。向该 混合物中添加增塑剂三(2-乙基己基)磷酸酯(Fluka)以提供35g/dL的总固体含量。然 后使所得混合物冷却至45°C并以等于混合物中总固体的2%的量添加无活菌素(Fluka)。 在室温下，将IO-IOOnL的这种终材料微分散到在晶片上的每个氯化银指示电极上，在四面 八方重叠至少约30 μ m。优选使用印刷孔302来限定周界。固化是通过将晶片放置在60°C 热板上30分钟来完成。此过程产生了厚度为约15 μ m的稳定的粗糙结构。在最后的步骤中，将上述优选的脲酶基质微分散到单个膜上并使用该装置进行UV 点固化。优选使用印刷孔303来限定周界。如上面所提到的，在优选的制剂中，在使用前将 组分混合在一起并在深低温冰箱中冷冻。这容许逐日一致地制备产物并且在微分散前具有 长储存寿命。这种制剂还可以在微分散事件之前进行质量控制(QC)测试，因为可以使用标 准的参考方法利用分光光度计测定混合物的酶活性。这降低了在制造过程中制备产品的成 本和浪费。关于优选的标准测定方法，来自融化的冷冻制剂的等分试样的脲酶酶活性是使用
23Kaltwasser & Schlegel 的改良方法评估("NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and other ammonia-producing systems (脲酶禾口其他产氨系统的 NADH-依赖性的 偶联酶测定)，"Analytical Biochemistry 16:132-138(1966))。该方法在与脲酶偶联的 谷氨酸脱氢酶测定中测量了 340nm时NADH至NAD+的分光光度改变。使用改良的BUN传感器的套筒分析在优选的实施方式中，随后将含有传感器的成品芯片组装到测试套筒中并用来进 行血液中的BUN测量。本发明的套筒的一个实施方式显示在图10-13中。套筒优选地适于插入到读数装置中，并且因此为了此目的具有多个机械连接和电 连接。还应明显的是套筒的手动操作是可能的。因此，在将套筒插入读数装置中后，读数装 置将压力传送到位于腔42中的装有约130 μ L的校准流体的含流体箔包中，在钉38上使包 装破裂，并将流体排入管道39中，管道39经由在基部中的短横切管道连接至传感器管道 16。当校准流体接触传感器时，传感器润湿并建立与流体中校准离子或分子的量相关的电 信号。参考图12，薄膜垫圈21包含多个孔和裂缝以促进基部和罩中管道间的流体转移， 并容许垫圈在需要时在压力下变形。孔30和33容许在切去部分35或37中所容纳的一个 或多个尿素传感器和一个或多个参比电极与管道16中的流体接触。参考图13，管道34是 在组装的套筒中连接样品进入口 4与第一管道34的样品保持室。切去部分35和37任选 地容纳用于测定空气_液体边界位置的电导传感器。凹处42容纳含流体的包装，如可破裂 的袋，该包装在组装的套筒中由于插入读数装置中时施加在桨7上的压力而被钉38刺穿。 来自被刺穿的包装的流体在39处流入第二管道，然后流入管道16。气囊由凹处43构成，凹 处43在其上表面被垫圈21密封。气囊是泵器件的一个实施方式，其通过施加于桨6上的 压力开动，桨6排放管道40中的空气，从而将样品从样品室34移入管道16。在优选的实施方式中，BUN传感器被包装到美国专利第5，096，669号中所公开的 类型的套筒中，该套筒还含有校准溶液。校准溶液被包含在校准包装(cal-包)中，该校准 包装在血样分析期间破裂。典型的事件顺序包括cal-包破裂，然后校准溶液流到传感器 上并润湿传感器。通常，现有技术套筒的cal-包含有下列离子钠离子、钾离子、钙离子、氯 离子和碳酸氢根离子并且还含有HEPES缓冲剂、葡萄糖、乳酸根、尿素、肌酸和肌酸酐。作为 用于研究目的的诊断测试，用氨来代替尿素。这容许研究铵离子载体的性能而不依赖于含 脲酶的酶固定层。新的BUN传感器的cal-包的优选组成优选地包括钠、钾、钙、氯、尿素、 HEPES缓冲剂、葡萄糖、乳酸根、肌酸和肌酸酐。用于尿素的电位测定化学传感器可以被看成是由功能上不同的部件构建的系统。 在血液尿素氮(BUN)传感器的一个实施方式中，与分析物溶液接触的最外层容许尿素运 输，同时还用于固定活性酶分子。如上所述，这些酶催化尿素水解为氨。在中性PH值下，由 此产生的氨主要以铵离子存在。通过插入在含酶层和银-氯化银指示电极之间含有对铵 离子具有高敏感性和选择性的离子载体的单独分层结构，可以测量电极界面处的铵离子浓 度。在这种类型的测量中，记录指示电极与参比电极之间的电位差。如电化学测量领域内 所熟知的，这是用在连接两个电极的仪器(分析仪)中的电位测定电路进行的。测量的分 析值是源自如下的事实电位差的量值通过Mcolsky方程与分析物的浓度相关，在这种情 况下分析物为尿素
E = E。+RT/nF log [Α+ Σ (a, b)k(a, b)B]其中E是测量的电动势(信号)，R是气体定律常数，T是绝对温度，η是分析物种 类a上的电荷的绝对值(例如，对于铵离子，n= 1)，F是法拉第常数，A是分析物种类a的活 性，B是干扰化学物种类b的活性，k (a, b)是与化学物种类b的存在对分析物种类a的活性 的电化学电位测定的影响相关的干扰系数，并且E。是独立于T、A或B的常数。参见Amman， D. ,Ion-Selective Microelectrodes (离子选择性微电极)，Springer，Berlin (1986)第 68 页以及其中所引用的参考文献，通过引用将其并入本文。图4、5和15-18中所示出的数据是使用这些原理记录和/或分析的。这些数据使 用商业的BUN测试系统来呈现以供比较。新传感器的性能优于已确立的技术。
实施例实施例1通过将0. Olg的抑肽酶溶解于50mL去离子水来制备抑肽酶溶液，产生0. 02%浓度 的储备溶液。通过添加下列物质来制备酶缓冲溶液4. 32g的甘油、130g的去离子水、130g WpH 7. 6 的 IM TRIS、2. 6g 的 pH 8. O 的 0. 5M EDTA、13g 上述 0. 02% 的抑肽酶储备溶液、 0. 2g ^ 1,4- 二硫赤藓糖醇、2. 7g的氯化钠、0. 097g的氯化钾、0. 05g的叠氮化钠、92. 8g的 蔗糖和29g的BSA。漩涡混合物直至完全溶解。然后制备含有丙烯酸树脂组分的溶液，该 溶液包含72. 2g的丙烯酰胺、150g的去离子水、29. 4g的1，4-双(丙烯酰)哌嗪和2. 5g的 活性炭。混合这种丙烯酸树脂溶液直至在溶解状态中并使用0. 2 μ m滤器过滤到干净的容 器中。向此溶液中添加17. Sg的1-[4-(2_羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙 烷-1-酮，混合并将溶液保持在用铝箔包裹的容器中来防止过度暴露于光。最后，将40g的 脲酶添加至约333g的上述经过滤的溶液中并混合。添加约44g的去离子水，最后添加184g 的丙烯酸树脂溶液(如上所制备的)。保持材料以铝箔覆盖并且混合直至在溶解状态中。 对于长期储存，将此溶液等分成Iml的部分并在-60°C下冷冻。实施例2在脲酶的另一实施方式中，酶固定层包含酶碳酸酐酶。混合次序如下通过将 0. Olg的抑肽酶溶解于50mL的去离子水来制备抑肽酶溶液，产生0. 02%浓度的储备溶液。 通过添加下列物质来制备酶缓冲溶液4. 32g的甘油、130g的去离子水、130g的pH 7. 6的 IM Tris,2. 6g的pH 8. 0的0. 5MEDTA、13g的上述0. 02 %的抑肽酶储备溶液、0. 2g的1， 4- 二硫赤藓糖醇、2. 7g的氯化钠、0. 097g的氯化钾、0. 05g的叠氮化钠、92. 8g的蔗糖、29g 的BSA，并将其漩涡直至内含物完全溶解。然后制备含有丙烯酸树脂组分的溶液，该溶液包 含72. 2g的丙烯酰胺、150g的去离子水、29. 4g的1，4-双(丙烯酰)哌嗪和2. 5g的活性炭。 混合这种丙烯酸树脂溶液直至在溶解状态中并使用0. 2μπι滤器过滤到干净的容器中。向 此溶液中添加17. Sg的1- [4- (2-羟基乙氧基)_苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮， 混合并使用铝箔来防止溶液过度暴露于光。最后，将40g的脲酶和14mg的碳酸酐酶添加至 约333g的上述过滤的酶溶液中并混合。添加约44g的去离子水，并且最后添加184g的以 上所制备的丙烯酸树脂溶液。保持材料以铝箔覆盖并且混合直至在溶解状态中。将此溶液 等分成Iml的部分并在_60°C下冷冻。关于任何公开的实施方案所述或要求的任何特征可以在任何组合中与关于任何其他公开的一个或多个实施方案所述或要求的任何一个或多个其他特征相组合，其程度为 这些特征不必在技术上不相容，并且所有这些组合均在本发明的范围内。此外，下面所附的 权利要求列出了在本发明范围之内的特征的一些非限制性组合，但是在任何可能的组合中 任何两个或多个权利要求的主题的所有可能的组合也涵盖在本发明的范围内，只要该组合 不必在技术上不相容即可。
权利要求
一种酶固定化组合物，所述酶固定化组合物包含在基本上均匀的含水混合物中的一种或多种酶、湿润剂、丙烯酸基单体、水溶性有机光引发剂和水溶性丙烯酸基交联剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种酶为脲酶。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组葡萄糖 氧化酶、乳酸氧化酶、肌酸酶、肌酸酐酶、肌氨酸氧化酶、触媒、碳酸酐酶、.NAD (P)H氧化酶、 胆固醇氧化酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、硫胺素氧化酶、丙酮酸氧化 酶、吡哆醛氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、脲酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物 酶。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述单体选自由以下组成的组丙烯酰胺、甲基丙 烯酰胺、N-[3-( 二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的组合。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述有机光引发剂选自由以下组成的组2_羟 基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、2-羟基-3-(3，4- 二甲基-9-氧 代-9H-噻吨-2-基氧基)-N，N, N-三甲基-1-氯化丙铵以及它们的组合。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述交联剂选自由以下组成的组1，4_双丙烯酰 哌嗪、N，N’ -(1，2_ 二羟亚乙基)双-丙烯酰胺、N，N’ -双(丙烯酰基)胱胺、N，N’ -亚甲 基双丙烯酰胺、乙二醇二丙烯酸酯、(+)_N，N’ - 二烯丙基酒石酰胺以及它们的组合。
7.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种 稳定组分PH缓冲剂、丙烯酸基交联分子、二硫键还原剂、二价离子螯合剂、蛋白酶抑制齐U、 牛血清白蛋白、盐、糖和杀生物剂。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物包含选自由以下组成的组的pH缓冲 剂巴比妥钠、HEPES、PIPES、MES、MOPS、曲辛、BIS-TRIS、磷酸盐、磷酸盐-盐水、SSC、SSPE、 TAPS、TAE、TBE以及它们的组合。
9.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种 稳定组分TRIS缓冲剂、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸盐、蔗糖、抑肽酶、牛血清白蛋白、氯化 钠、氯化钾、叠氮化钠和甘油。
10.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的二硫键还 原剂2-巯基乙醇、盐酸三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇以及它们的组合。
11.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的二价离子 螯合剂乙二胺四乙酸、柠檬酸钠、乙二醇四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺和它们的组I=I O
12.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的蛋白酶抑 制剂抑肽酶、鸡卵白半胱氨酸蛋白酶抑制剂、抗蛋白酶、胱胺二盐酸盐、胰凝乳蛋白酶抑制 剂、3，4-二氯异香豆素、E-64、依布硒、Gly-Gly-Tyr-Arg合成肽、亮抑酶肽、α 2-巨球蛋白、 N- α -甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲酮盐酸盐、N- α对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲酮盐酸 盐、胃蛋白酶抑制剂A、pesinostr印tin、ε -氨基-正己酸、4_(2_氨乙基)苯磺酰氟盐酸 盐、抗凝血酶III、博待啉、补体Cl酯酶抑制剂、3，4_ 二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸、弹性 蛋白酶抑制剂、甲磺酸加贝酯、亮抑酶肽、α 2-巨球蛋白、N-乙酰基-glu-ser-met-asp-al、 N-乙酰基-ile-gly-thr-asp-al、二异丙基氟磷酸、Na-T-Boc-去乙酰亮抑酶肽、乙酰 基-胃蛋白酶抑制剂、富组蛋白 5、Cbz-Leu-Leu-Phe-al、Cbz-Leu-Leu-Leu-B (OH) 2、乳胱素、clasto-乳胱素β-内酯、二异丙基氟磷酸、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂A、D-His-Pro-Phe-His-Leu-psi-(CH2NH) -Leu-Val-Tyr、二亚乙基三胺五乙酸、1，10-二氮杂菲一水合物、 膦酰二肽、二异丙基氟磷酸、N-乙酰基-水蛭抑制剂C、甲磺酸加贝酯、蛭素、Na-(2-萘磺 酰基甘氨酰)-4_脒基DL-苯丙氨酸哌啶、D-Val-Leu-Lys-氯甲酮、对氨基苯甲脒二盐酸盐、 大肠杆菌素、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂、Glu-Gly-Arg-氯甲酮以及 它们的组合。
13.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组的杀生物剂叠 氮化钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、硫柳汞、次氯酸 盐以及它们的组合。
14.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的湿润剂 甘油、丙二醇、三乙酸甘油酯、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇、聚葡萄糖、皂角、乳酸、氯化锂、1， 2_丙二醇以及它们的组合。
15.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的盐氯化 钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾以及它们的组合。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在冷冻的形式下是稳定的。
17.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到基本上平坦的表面上并 暴露于UV辐射以引起交联从而在所述表面上形成粘附的固定化酶层。
18.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到基本上平坦的表面上并 暴露于UV辐射以引起交联从而在所述表面上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
19.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到电极上并暴露于UV辐射 以引起交联从而在所述电极上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
20.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到离子选择性电极上并暴 露于UV辐射以引起交联从而在所述电极上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
21.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到电流型电极上并暴露于 UV辐射以引起交联从而在所述电极上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
22.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到电导电极上并暴露于UV 辐射以引起交联从而在所述电极上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
23.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到传感器上并暴露于UV辐 射以引起交联从而在所述传感器上形成粘附的非溶胀性固定化酶层。
24.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够被微分散到选自由以下组成的组的 传感器上光学传感器、光纤传感器、声表面波传感器、消逝传感器、表面等离子体共振传感 器和光波导传感器；并暴露于UV辐射以引起交联从而在所述传感器上形成粘附的固定化 酶层。
25.如权利要求1所述的组合物，所述组合物能够通过选自由以下组成的组的方法被 施加至表面旋涂、浸涂、喷涂、丝网印刷、喷墨印刷、激光印刷、涂抹和接触印刷；并暴露于 UV辐射以引起交联从而在所述表面上的形成粘附的固定化酶层。全文摘要
本发明涉及酶固定组合物，所述酶固定化组合物包含在基本上均匀的含水混合物中的一种或多种酶、湿润剂、丙烯酸基单体、水溶性有机光引发剂和水溶性丙烯酸基交联剂。本发明还涉及用于形成包含这类组合物的传感器的方法并且涉及用于通过将这类组合物分散到基底上而在传感器的阵列上形成固定化层的阵列的装置。
文档编号C12P19/04GK101970676SQ200880126787
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月19日 优先权日2007年12月20日
发明者A·C·内梅特, A·王, G·B·科利尔, J·A·麦克劳德 申请人:雅培医护站股份有限公司