专利名称：：饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及词料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC技术进行检测的检测方法及所使用的试剂。
背景技术：
：动物源性饲料产品极易受到微生物污染，并随后污染畜禽产品，再通过食物链引发人类疾病。动物源性饲料产品如果来自疫区带菌、病死畜禽或未经严格消毒加工的副产品原料，常会造成动物疫病扩散和通过食物链导致人类患病。某些致病性和相对致病性细菌也可引起畜禽细菌性饲料中毒。微生物污染词料是人畜共患传染病传播的重要途径。微生物污染危害的评价指标通常主要有细菌总数、大肠菌群、致病菌和霉菌。常见的致病菌主要是指肠道致病菌(如沙门氏菌、志贺氏菌等)。饲料安全Ti生标准中一般对致病菌都做出"不得检出"的规定，以确保饲料的安全卫牛。传统检测方法中，细菌培养和鉴定是一项既耗时又复杂的工作，由于某些生化试剂、血清等质量不稳定、特异性不好等因素，经常给鉴定的结果带来差异。目前国内外针对沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测方法很多，如PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因芯片测试法、全自动细菌生化鉴定仪等，此外针对沙门氏菌的还有荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金免疫测试条等。尽管方法众多，但各种方法都存在各自的优势和缺点培养生化鉴定法受人为和试剂影响因素较大；细菌的自动生化鉴定仪器重现性较好，但由于只是局限在几个生化反应，相似的菌株间鉴别特别困难；荧光免疫检测法(VIDAS)检测成本极高，且存在着假性结果的问题；PCR-凝胶电泳检测技术虽然检测成本低，但存在着反应产物后处理极易造成污染的缺点；实时荧光PCR技术具有特异性强，灵敏度高等优势，但却存在着检测成本较高，荣光探针保存时间较短等不足；而基因芯片方法则缺乏实用性。实际检测中，对沙门氏菌、志贺氏菌检测时，由于该两种菌检验所用的增菌液不同，即使是对同一份标本也只能分别增齒，分别划线分离，分别鉴定，使实验室的工作量成倍增加，同时由于两者增菌时间不相同，沙门氏菌1824h，志贺氏菌68h，给检验工作安排带来相当大困难。鉴于此，本发明的发明人认为极有必要开发一种新的检测方法，以高效、快速、灵敏地地检测待测样品的沙门氏菌、志贺氏菌的染菌情况。
发明内容本发明首先提供用于同时快速检测词料中沙门氏菌和志贺氏菌的基于mPCR-DHPLC检测的试剂盒。本发明所述的试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris，Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/jliL及沙门氏菌和志贺氏菌引物对各10HM;其中，沙门氏菌和志贺氏菌的特异性引物序列如下菌株上下游引物序列(5'-3')_沙门氏菌GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATCATCGCACCGTCAAAGGAACC志贺氏菌GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTCGCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC本发明还提供了利用上述试剂盒检测饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的mPCR-DHPLC方法，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94'C变性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②将PCR扩增产物进行DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3pm;柱温50°C;流动相(体积比)O.Omin，48.0%缓冲溶液A，52.0%缓冲溶液B;0.5min，42.9%缓冲溶液A，57.1%缓冲溶液B;3.6min，38.8%缓冲溶液A，61.2%缓冲溶液B;6.8min，36.6%缓冲溶液A，63.4%缓冲溶液B;9.9min，35.2%缓冲溶液A，64.8%缓冲溶液B;13min，34.3%缓冲溶液A，65.7%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5jLlL。检测结朿后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。本发明采用mPCR-DHPLC技术，针对饲料中沙门氏菌和志贺氏菌建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测词料中沙门氏菌和志贺氏菌，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图4幅，图l.a是PCR-DHPLC检测沙门氏菌阳性吸收峰谱图；图l.b是PCR-DHPLC检测志贺氏菌阳性吸收峰谱图；图2.a是多重PCR-DHPLC检测复合增菌的沙门氏菌、志贺氏菌阳性吸收峰谱图2.b是多重PCR-DHPLC检测混合的沙门氏菌、志贺氏菌阳性吸收峰谱图。具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。本部分试验所用的主要培养基和试剂来源为营养肉汤培养基、SC增菌液、GN增菌液分别购自美国BD公司，并按其说明配制；细菌基因组DNA提取试剂(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)及ExTaq等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。本部分试验所用的主要仪器和设备包括基因扩增仪(美国ABI公司)和变性高效液相色谱(简称DHPLC，美国Transgenomic公司)。本部分所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)或中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。实施例1、饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法的建立(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装菌株上下游引物序列(5'-3')_扩增片段沙门氏菌GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA284bpTCATCGCACCGTCAAAGGAACC志贺氏菌GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC629bp_GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC_上述引物委托宝生物工程(大连)有限公司合成。在此基础上，设计用于PCR-DHPLC检测的试剂盒该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris-Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/nL及沙门氏菌和志贺氏菌引物对各10pM;(2)PCR-DHPLC检测方法本检测方法使用本实施例建立的PCR-DHPLC检测的试剂盒，包括如下步骤①待检样品的制备采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组a.称取动物源性饲料样品25g,加入至225mL沙门氏菌、志贺氏菌通用增菌液中，经36。C、24h增菌培养后，取通用增菌培养液1.5mL，12000r/min离心lmin，吸弃上清液，取沉淀，采用细菌DNA提取试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)提取细菌DNA，保存于-20。C备用以待检其中，通用增菌液的制备方法是将蛋白胨20.0g、氯化钠lO.Og、十二水磷酸氢二钠18.0g和磷酸二氢钾3.0g加入1000mL蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2士0.1，12rC高压灭菌15min。b.标准菌株挑取单个菌落于营养肉汤中培养lS24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。；②PCR扩增取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒屮的检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C,3min;进入循环94'C变性60s，60。C退火60s，72'C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温50°C;流动相(体积比)O.Omin，48.0%缓冲溶液A，52.0%缓冲溶液B;0.5min，42.9%缓冲溶液A，57.1%缓冲溶液B;3.6min，38.8%缓冲溶液A，61.2%缓冲溶液B;6.8min，36.6%缓冲溶液A，63.4%缓冲溶液B;9.9min，35.2%缓冲溶液A，64.8%缓冲溶液B;13min，34.3%缓冲溶液A，65.7%缓冲溶液B;其屮，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。实施例2、mPCR-DHPLC检测方法特异性试验取表l中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。。然后以这些基因组DNA为模板，采用实施例所建立的方法进行PCR-DHPLC分析检测。检测结果显示，所有沙门氏菌使用均检测到了DHPLC的沙门氏菌阳性吸收峰(附图l.a)，出峰时间约6.3min，而非沙门氏菌检测结果均为阴性；志贺氏菌均检测到了DHPLC的志贺氏菌阳性吸收峰(附图l.b)，出峰时间为10.4min，而非志贺氏菌检测结果均为阴性。上述结果表明本试验采用的沙门氏菌和志贺氏菌检测引物均具有很好的鉴定特异性。表1菌株名称拉丁名福氏志贺氏菌痢疾志贺氏菌》宋氏志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌虔A群痢疾志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌广a姿贫A群痢疾志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌A群痢疾志贺氏菌姿贫B群福氏志贺B群福氏志贺C群鲍氏志贺D群宋内氏志贺D群宋内氏志贺肠炎沙门氏菌肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌妙/z/腳r/謂鼠伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌乙型副伤寒沙门氏菌丙型副伤寒沙门氏菌猪霍乱沙门氏菌猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种汤卜逊沙门氏菌圣保罗沙门氏菌海德堡沙门氏菌肯塔基沙门氏菌波那雷恩沙门氏菌阿伯丁沙门氏菌波那雷恩沙门氏菌都柏林沙门氏菌鸭沙门氏菌鸡沙门氏菌病牛沙门氏菌fe/zwoweZ/a6謂、附0尸折0朋波斯坦沙门氏菌山夫顿堡沙门氏菌&/腳"^/"5^w,w&rg旺兹沃思沙门氏菌阿德莱徳沙门氏菌伊思特本沙门氏菌&/腳"《〃"ea^6ow/77e火鸡沙门氏菌摩根氏摩根氏菌产酸克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌弗劳地柠檬酸杆菌阴沟肠杆菌阪崎肠杆菌大肠埃希氏菌产气肠杆菌金黄色葡萄球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌单核细胞增生李斯特氏菌空肠弯曲菌肠出血性大肠埃希氏菌0157:产肠毒素大肠埃希氏菌肠致病性大肠埃希氏菌肠侵袭性大肠埃希氏菌溶血性链球菌霍乱弧菌副溶血性弧菌溶藻性弧菌创伤弧菌拟态弧菌腊样芽孢杆菌产气荚膜梭菌普通变形杆菌Pra/e船ra/gan》奇异变形杆菌/V她ws附/raZ/to实施例3、复合PCR-DHPLC方法特异性试验取肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的复合通用增菌培养液，即两种标准菌株的混合培养增菌液提取DNA，按照实施例1所建立的方法进行PCR-DHPLC检测。结果如附图2.a所不，在6.3min和10.4min分别检测到沙门氏菌和志贺氏菌的出峰。作为对比，实施例同时将肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌各自单一的PCR扩增的产物各取2.5pL混合后在同一条件下进行DHPLC检测，结果如附图2.b所示，沙门氏菌和志贺氏菌也分别检测出了各自的阳性吸收峰，且出峰时间与上述相同。为/证实复合PCR-DHPLC检测的阳性吸收峰为肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的基因片段，我们分别将DHPLC的两个阳性吸收峰产物各自回收后进行丫克隆和测序，结果分别与genbank中肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌基因序列比对，证明了复合PCR-DHPLC的两个阳性吸收峰分别为肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的基因片段。实施例4、mPCR-DHPLC检测灵敏度试验取肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的复合通用增菌培养液，用比浊法定量所培养的沙门氏菌和志贺氏菌的复合菌液浓度。首先用麦氏比色管试剂盒制作ODs5o值——每mL菌液里的细菌个数的标准曲线，再测定所培养菌液的OD550值，将OD55o值代入标准曲线，得到所培养菌液的浓度，单位为CFU/mL。把菌液稀释成lxl(^CFU/mL、lxl02CFU/mL、lxl03CFU/mL、lxl04CFU/mL、1><105CFU/mL、lxl(^CFU/mL等梯度。按照实施例1建立的方法提取DNA，每个梯度各取2做为模板，进行PCR-DHPLC的灵敏度检测。当肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌复合增菌后的模板为lxl02CFU/mL和lx103CFU/mL所提取的DNA时，加入2的模板DNA依然能经PCR-DHPLC检测出典型的阳性吸收峰，而模版为lxl01CFU/mL时则未检测出阳性吸收峰。结果表明，本方法的灵敏度很高，可以达到lxl(^CFU/mL左右。实施例5、应用于实际样品的检测试验将实施例1建立的PCR-DHPLC方法用于肉粉、肉骨粉、鱼粉、血浆粉、明胶、虾壳粉及乳清粉等动物源性饲料样品的沙门氏菌和志贺氏菌实际检验，同时采用国家标准方法(GB/T4789.5-2003，)和检验检疫行业标准(SN/T0184.1-2005，)，以进行对比。在476份陆续检验的样品中，经本方法陆续检测出9份样品为沙门氏菌阳性，l份样品为沙门氏菌和志贺氏菌均为阳性。与采用国家标准方法(GB/T4789.5-2003，)和检验检疫行业标准(SN/T0184.1-2005，)检测的结果完全一致。结果表明复合PCR-DHPLC高通量检测方法准确度为100%，显示该方法具有较好的准确性和适用性。本实施例中，采用国家标准方法(GB/T4789.5-2003，)和检验检疫行业标准(SN/T0184.1-2005，)的方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)96h，检测耗时(不包括样品制备)94h;使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)25h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。权利要求1、饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及沙门氏菌和志贺氏菌引物对各10μM；其中，沙门氏菌和志贺氏菌的特异性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2、饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环:94"C变性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②将PCR扩增产物进行DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3|am;柱温50°C;流动相(体积比)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。全文摘要饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及沙门氏菌和志贺氏菌引物对各10μM；使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测饲料中沙门氏菌和志贺氏菌，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101624624SQ20091001079公开日2010年1月13日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者曹际娟申请人:曹际娟