专利名称：一种分离纯化抗真菌脂肽的方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物所产生的抗真菌脂肽的分离纯化，具体的说是一种从海洋 枯草芽孢杆菌发酵液中分离纯化防治植物真菌病害脂肽的方法。
背景技术：
植物真菌病害常常导致农业生产上的巨大损失，轻则造成农作物的减产，严重时 可能导致颗粒无收，经济损失十分严重。但是目前国内外还都主要是通过化学合成的农药 来防治真菌病害，尽管化学农药在病害防治方面起到了一定的效果，但是在农药的使用过 程中造成了生态环境的严重破坏，如环境污染，农药残留以及致病菌的抗药性等等。因此寻 找一些对环境友好的真菌病害防治方法已经日益受到人们的重视，其中开发能够拮抗病原 真菌的生物农药、微生物农药即是一条行之有效的途径。据国内外文献报道，芽孢杆菌(Bacillus)能够产生许多种不同结构的抗菌物质， 其中由非核糖体合成的脂肽类抗菌物质是其中重要的一类。这些抗菌脂肽具有对动植物无 害、对环境友好、不易产生交叉抗性等特点，因而在生物防治由真菌引起的病害中起着十分 重要的作用。而在筛选到活性优良的菌种后，建立一种快速、有效且成本低廉的分离纯化工艺 是将抗真菌脂肽应用于实际生产的关键。目前已有许多学者在进行抗菌肽分离纯化的研 究，例如《植物病理学报》2007，37 (4)，403-409报道高芬等人将蜡状芽孢杆菌BC98-1发 酵液依次进行酸沉淀、甲醇提取、乙醚萃取、SephadexG-100, DEAE52柱层析处理，得到抗菌 肽；《中国油料作物学报》2006，28 (4)，453-456报道江木兰等人将枯草芽孢杆菌BY-2发酵 液依次进行酸沉淀、甲醇提取、Sephadex G_层析、HPLC处理，得到抗菌物质；《福建热作科 技》2006，31(1)，5-7报道张鹏等人将蜡状芽孢杆菌041381的发酵液依次采用硫酸铵分级 盐析、DEAE-Sephadex A_25柱层析、Sephadex G_50柱层析得到抗菌物质；《四川工业学院 学报》2002，21 (2), 60-62报道陈祥贵等人利用蜡状芽孢杆菌S-1菌株的发酵液依次采用酸 沉淀、甲醇提取、乙醚萃取、透析、Sephadex G-100层析、硅胶薄层层析后，得到纯化的抗菌 物质。这些方法虽然可以纯化抗菌肽，但往往存在着纯化步骤较繁琐、工艺条件控制复杂， 或者纯化效果不好、处理后活性有所损失等等问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种简单、快速的从海洋枯草芽孢杆菌发酵液中分离纯化抗 真菌脂肽的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种分离纯化抗真菌脂肽的方法，将能够产生抗真菌脂肽的海洋枯草芽孢杆菌 3512A在发酵培养基中培养后，通过离心、酸沉淀、甲醇提取从海洋枯草芽孢杆菌3512A发 酵液中制备粗脂肽，得到的粗脂肽上硅胶色谱柱、以甲醇/ 二氯甲烷洗脱液进行减压梯度 洗脱，洗脱液中甲醇体积浓度从0至100%呈阶梯性变化，分别收集各阶梯段的洗脱组分，
3以病原真菌玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani为检测靶菌，其中的活性部分进行RP-HPLC 分析并制备，分别收集色谱峰，得到抗真菌脂肽ALP1和ALP3。用于产生抗植物病原真菌脂肽的海洋枯草芽孢杆菌3512A(BaCilluSSubtiliS 3512A)，分离自中国南海柳珊瑚；已于2007年4月23日交至中国典型培养物保藏中心保 藏，地址是中国.武汉.武汉大学，菌种保藏号为CCTCC No.M 207051。海洋枯草芽孢杆菌3512A发酵培养基的重量组成如下，蔗糖2%，KH2P040.3%, Na2HP04l %, NH4N030 . 2 %, MgS04 7H20 0. 02 %,酵母粉 0. 02 %, CaCl20. 7 u g/lOOml, MnS04 H20 lu g/lOOml, pH 7. 0-7. 2，余量为水；罐装发酵培养条件为在罐温26-30°C下，罐压0.03-0.06Mpa，通风量为5-7L/ min，搅拌速度为180-210rpm，通气搅拌发酵46-50小时即可放罐，此发酵液可用于制备抗
真菌粗脂肽用。粗脂肽的制备方法包括如下步骤(1)离心除菌体于能够产生抗真菌脂肽的3512A菌株发酵培养结束后，将发酵培 养液用NaOH溶液调pH至8. 0-8. 5，然后离心，除去菌体及其它固形物；(2)酸沉淀将步骤(1)所得上清液用6-8mol/L盐酸调pH至2. 0-2. 5，于0_4°C 冰箱内放置过夜，次日于离心收集沉淀，并用pH 2. 0-2. 5的稀盐酸反复洗涤2-5次，以除去 表面残余上清；3)甲醇提取将步骤(2)所得沉淀物用甲醇浸提，反复提取2-5次，然后将甲醇提 取液在30-35°C旋转蒸发仪上旋转蒸发除去甲醇，即得到粗脂肽。硅胶色谱柱快速洗脱过程为将600目硅胶填充于色谱柱内，然后称取粗脂肽样 品上样，依次以 0/100，1/99，2/98，5/95，10/90，20/80，30/70，50/50，100/0 的甲醇 / 二氯甲
烷洗脱液减压洗脱；然后分别收集各洗脱组分，旋干后称重并检测抗真菌活性，保留具有活 性组分。应用RP-HPLC制备方法将经过硅胶快速色谱洗脱后得到的抗真菌活性部分，用 甲醇0.05% TFA水溶液=75 25 (v/v)溶解，然后采用YMC 0DS-A半制备柱进行制备， 色谱条件为流动相为甲醇0. 05% TFA水溶液=75 25 (v/v)，流速2. 5ml/min，进样量 250 u 1，检测波长210nm ；分别收集流出的色谱峰，分别检测它们的抗真菌活，旋干溶剂后 即得到抗真菌脂肽纯品。所述检测靶菌玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani。本发明具有如下的优点1.分离纯化流程简单、快速、操作方便，成本低。2.抗真菌脂肽的纯化效果好，得到的抗真菌脂肽纯度高。3.分离纯化过程处理温和，不破坏脂肽的生物活性，活性不易丧失。
图1为抗真菌脂肽的分离纯化流程图。图2为ALP1 (峰1)禾P ALP3 (峰3)的RP-HPLC图。色谱条件色谱柱YMC 0DS-A(250mmX 10mm)；流动相为甲醇0. 05 % TFA 水溶液=75 25 (v/v)，流速 2. 5ml/ min，检测波长210nm。
本发明所采用的海洋枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌3512A(BaCilluSSubtiliS 3512A)。2007年4月23日交于中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国.武汉.武 汉大学，保藏号为CCTCC No.M 207051。该菌株分离于中国南海柳珊瑚，具有典型枯草芽 孢杆菌特征，菌体为杆状或短杆状，革兰氏染色阳性；芽孢呈柱状、中生、不膨大；菌落呈 淡黄色、不透明、干燥、表面粗糙，边缘不规则。海洋枯草芽孢杆菌3512A能够产生脂肽 类的抗真菌物质，该抗真菌脂肽对多种病原真菌，如黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum. sp. Cucumerinum)，玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，禾谷键刀菌(F. grammcarum)，白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，小麦赤
(Gibberella zeae), MM^'M'MM (Colletotrichum nigrum)，H才古, (F. oxysporum. sp. Benincasae)，# 胃 If 冑 _ 胃(Botryosphaeria berengriana)，^ 胃 轮纹病菌(B. berengriana f. sp. Piricola)，大豆根腐病菌(F. solani)，棉花枯萎病菌 (F. oxysporum. sp. Vasinfectum)，棉花黄枯病菌(Verticilliu dahliae)，棉花幼苗立枯病 菌(R. solani)，黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuligine)等都具有很强的抑制作用，盆栽 实验表明施用于农作物可以有效地防止植物真菌病害的发生，且对作物生长无不良影响。
具体实施例方式实施例1采用500ml容积的三角瓶3个，每瓶装100ml发酵培养基(蔗糖2%，KH2P040. 3%， Na2HP04l %, NH4N030 . 2 %, MgS04 7H20 0. 02 %,酵母粉 0. 02 %, CaCl20. 7 u g/lOOml, MnS04 ‘ H20 1 u g/100ml，pH 7. 0-7. 2，余量为水)，121°C灭菌30分钟，冷却后分别接种一环 新鲜的活化好的抗真菌脂肽产生菌海洋枯草芽孢杆菌3512A，置于28°C摇床内、180rpm振 荡培养24小时，培养结束取出取出镜检无杂菌即可作为种子液。将培养好的种子液按体积比5%的接种量接种于内装6L灭菌发酵培养基的10L 发酵生物应器中，在罐温26-30°C下，罐压0. 03-0. 06Mpa,通风量为5-7L/min，搅拌速度为 180-210rpm，通气搅拌发酵46-50小时即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽。发酵结束后，用质量浓度2%的NaOH溶液调发酵液的pH至8. 0，然后在常温下于 4000rpm离心30min，除去菌体及其它固形物；所得到的发酵上清液用6mol/L盐酸调pH至 2.0，于4°C冰箱内放置过夜，次日于4000rpm离心30min，收集沉淀，并用pH 2. 0的稀盐酸 反复洗涤沉淀三次，以除去表面残余上清。所得沉淀物用甲醇浸提，反复提取三次后将提取 液旋转蒸发除去甲醇，干燥后即得到粗脂肽。准确称取4g所得粗脂肽，上硅胶色谱柱(60mmX 100mm)，依次以0/100，1/99， 2/98，5/95，10/90，20/80，30/70，50/50，100/0 的甲醇 / 二氯甲烷洗脱液各 400ml 进行减压
(压力为-0. 1至-0. 85MPa)快速洗脱。然后收集各洗脱组分，旋转蒸发干燥后称重并取少 量配成lmg/ml的水溶液以管碟法检测抗菌活性(徐积恩，朱明珍主编，《抗生素》，北京科学 出版社，1982，152)，保留其中含有抗真菌脂肽、即具有抗真菌活性的的组分(以玉米纹枯 病菌Rhizoctonia solani为检测靶菌)。经减压快速洗脱得到的活性部分用流动相溶解后进行RP-HPLC分析并制备，采用 YMC 0DS-A半制备柱(250mmX 10mm)，色谱条件为流动相为甲醇0.05% (v/v)TFA水溶 液=75 25(v/v)，流速2. 5ml/min，进样量250111，检测波长21011111。分别收集各色谱峰(图2)，旋干，抗真菌活性检测，得到抗真菌脂肽ALP1和ALP3纯品。
抗真菌活性检测方法采用滤纸片法方法是在PDA平皿中央接种病原菌玉米纹枯 病菌Rhizoctonia solani的菌丝块，待真菌长到菌丝直径约2. 5cm左右时，取出备用；将直 径为1cm的无菌滤纸片放于一无菌平皿内，于其上滴加30 u 1 ALPUALP2和ALP3的甲醇溶 液，挥干其上的甲醇后放入PDA平皿的病原菌菌丝块周围，然后28°C恒温培养18-24h，测定 抑菌圈的大小，记录实验结果，ALP1和ALP3样品出现抑菌圈，表明其具有抗真菌活性。
权利要求
一种分离纯化抗真菌脂肽的方法，其特征在于从海洋枯草芽孢杆菌3512A发酵液中制备粗脂肽，得到的粗脂肽上硅胶色谱柱、以甲醇/二氯甲烷洗脱液进行减压梯度洗脱，洗脱液中甲醇体积浓度从0至100呈阶梯性变化，分别收集各阶梯段的洗脱组分，以病原真菌为检测靶菌，其中的活性部分进行RP-HPLC分析并制备，分别收集色谱峰，得到抗真菌脂肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于产生抗植物病原真菌脂肽的海洋枯 草芽孢杆菌3512A (Bacillus subtil is 3512A)，分离自中国南海柳珊瑚；已于2007年4月 23日交至中国典型培养物保藏中心保藏，地址是中国.武汉.武汉大学，菌种保藏号为 CCTCC No. M 207051。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于海洋枯草芽孢杆菌3512A发酵培养基的重量组成如下，蔗糖2 %，KH2P040.3 %, Na2HP04l %, NH4N030 . 2 %, MgS04 7H20 0. 02 %,酵母粉 0. 02 %, CaCl20. 7 u g/lOOml, MnS04 H20 lu g/lOOml, pH 7. 0-7. 2，余量为水；罐装发酵培养条件为在罐温26-30°C下，罐压0. 03-0. 06Mpa,通风量为5-7L/min，搅 拌速度为180-210rpm，通气搅拌发酵46-50小时即可放罐，此发酵液可用于制备抗真菌粗 脂肽用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于粗脂肽的制备方法包括如下步骤(1)离心除菌体于能够产生抗真菌脂肽的3512A菌株发酵培养结束后，将发酵培养液 用NaOH溶液调pH至8. 0-8. 5，然后离心，除去菌体及其它固形物；(2)酸沉淀将步骤(1)所得上清液用6-8mol/L盐酸调pH至2.0-2. 5，于0_4°C冰箱 内放置过夜，次日于离心收集沉淀，并用pH 2. 0-2. 5的稀盐酸反复洗涤2-5次，以除去表面 残余上清；3)甲醇提取将步骤(2)所得沉淀物用甲醇浸提，反复提取2-5次，然后将甲醇提取液 在30-35°C旋转蒸发仪上旋转蒸发除去甲醇，即得到粗脂肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于硅胶色谱柱快速洗脱过程为将600目硅胶填充于色谱柱内，然后称取粗脂肽样品上 样，依次以 0/100，1/99，2/98，5/95，10/90，20/80，30/70，50/50，100/0 的甲醇 / 二氯甲烷洗脱液减压洗脱；然后分别收集各洗脱组分，旋干后称重并检测抗真菌活性，保留具有活性组 分。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于应用RP-HPLC制备方法将经过硅胶快速 色谱洗脱后得到的抗真菌活性部分，用甲醇0.05%TFA水溶液=75 25(v/v)溶解，然 后采用YMC 0DS-A半制备柱进行制备，色谱条件为流动相为甲醇0.05%TFA水溶液= 75 25(v/v)，流速2.5ml/min，进样量250iU，检测波长210nm;分别收集流出的色谱峰， 分别检测它们的抗真菌活，旋干溶剂后即得到抗真菌脂肽纯品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测靶菌玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani0
全文摘要
本发明涉及海洋微生物抗真菌脂肽分离纯化，具体的说是一种分离纯化抗植物真菌病害脂肽的方法，(1)采用的海洋枯草芽孢杆菌3512A在适宜条件下进行发酵培养；(2)发酵培养结束后通过离心、酸沉淀、甲醇提取得到脂肽粗提物；(3)采用硅胶快速色谱收集具有抗真菌活性组分；(4)利用RP-HPLC制备得到抗真菌脂肽纯品。本发明能有效提供一种从海洋枯草芽孢杆菌的代谢产物中分离纯化具有抗植物病原真菌脂肽的方法，具有操作快速简便、纯化效果好、活性不易丧失、成本低等优点。
文档编号C12P21/02GK101851654SQ20091001102
公开日2010年10月6日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者刘丽, 徐杨, 潘华奇, 王书锦, 王楠, 胡江春 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所