专利名称：重组人hmbox1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人HMB0X1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用，属基因工程 技术领域。
背景技术：
人HMB0X1基因是一种功能性新基因，广泛表达在人体组织中，其中在脑、胰腺、胎盘、 前列腺、胸腺和睾丸组织中高表达。并且人HMB0X1基因和小鼠、大鼠、鸡、蟾蜍相比具有 较高同源性，所以在遗传上具有高度保守性。人HMB0X1蛋白由421个氨基酸组成，含有和 HNF (H印atocyte Nuclear Factor)相同的功能域，提示其功能可能与HNF相关。HMB0X1 是一种转录抑制因子，其与胰腺疾病具有相关性，并且与免疫杀伤功能有一定关系，但其具 体机制尚不清楚。人HMB0X1抗体可以与HMB0X1特异性结合，对于研究HMB0X1在人体中的
作用具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种重组人HMB0X1表达载体以及该载体表达产物及 其抗体与应用。
一种重组人HMB0X1表达载体，通过如下步骤构建制得
(1) 从人自然杀伤(NK)细胞系M92细胞中扩增得到人HMB0X1基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示；
(2) 将步骤(1)制得的人HMB0X1基因与pGEM easy T载体(购自Promega公司)连 接构建成pGEM-HMBOXl;连接方法参见pGEM easy T载体使用说明书。
(3) 以步骤(2)制得的pGEM-HMB0X1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5'端 和3，端设计BamH I和Hind III酶切.位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO. 2所 示；
(4) 将步骤(3)制得的扩增产物经BamH I和Hind III双酶切后与载体pET22b (购自 Novagen公司)连接，构建得到表达产物C端带有6XHistidine标签的pET22b-HMB0X1表 达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)中，得到重组人HMB0X1表达载体。连接方 法参见pET22b载体使用说明书。
上述步骤(3)中，引物序列如下
5，端引物为5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3，， 3，端引物为5， - CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。 上述步骤(3)中，PCR反应条件为
95。C变性60s, 58。C退火60s， 72。C延伸90s，循环25次。
上述重组人HMB0X1表达载体的表达产物，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。 上述重组人HMB0X1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下 (1)将重组HMB0X1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至ODeoo为0. 4后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopr叩yl e -D-thiogalactoside, IPTG)至终浓度lmM， 在3(TC继续诱导培养4小时，得诱导菌液；
(2)将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后 的HMB0X1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂 尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMB0X1表达载体的表达产物。
上述重组人HMB0X1表达载体的表达产物的制备方法步骤(2)中的具体步骤如下
1) 用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水。
2) 吸取2mlNTA-Resin树脂到空柱中(下端封闭)，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子， 使液体流出。
3) 依次用3ml蒸馏水、5ml 1 XCharge Buffer (50mMNiSO4)、 3ml 1 XBinding Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)过柱子，力卩载Ni离子。
4) 将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，最适流速10ml/h。
5) 然后依次用5ml 1 XBinding Buffer和5ml 1 XWash Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCI 60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗涤柱子。
6) 依次加入以下梯度尿素1 XBinding Buffer溶液6M尿素2ml、 5. 5M尿素lml、 5M 尿素lml、 4. 5M尿素lml、 4M尿素lml、 3. 5M尿素lml、 3M尿素lml、 2. 5M尿素lml、 2M尿 素lml、 1.5M尿素lml、 1M尿素lml、 0.5M尿素lml、 0M尿素2ml。
7) 力卩入5mllXWash Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol pH7.9)洗涤。
8) 力卩入4ml lXElute Buffer (0.5MNaCl 20mM Tris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脱，收
集流出液，为复性蛋白，即重组人HMB0X1表达载体的表达产物。
该重组人HMB0X1表达载体的表达产物主要是以包涵体的形式存在，该表达产物具有SEQ ID NO. 3序列特征。
上述重组人HMB0X1表达载体的表达产物的抗体，通过如下步骤制备
(1) 用重组人HMB0Xl表达载体的表达产物免疫8周龄BALB/c小鼠，首次每只50ug， 每间隔两周免疫一次，每次25ug，腹腔注射，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到l:l X105时，取免疫小鼠脾细胞，备用；
(2) 复苏SP2/0骨髓瘤细胞，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤筛选， 保持HGPRT缺陷，得备用骨髓瘤细胞；
(3) 取8周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种到恥孔的孔板上，静置 24小时，备用；
(4) 取步骤(1)制得的免疫小鼠脾细胞与步骤(2)制得的备用骨髓瘤细胞混合，加 入50%的PEG4000进行细胞融合，然后加入到步骤(3)制备好的含有饲养细胞的96孔的孔 板上，培养10-14天后，取培养上清，用间接ELISA检测抗人HMB0X1抗体效价,对抗人HMB0X1 抗体效价高的阳性孔进行三次单克隆培养，直至所有克隆孔均成阳性，得单克隆抗体杂交瘤 细胞溶液，该单克隆抗体杂交瘤细胞溶液每毫升含有1乂106个单克隆抗体杂交瘤细胞；
(5) 先用石蜡油腹腔注射BALB/c小鼠，词养一周，得备用小鼠；
(6) 取步骤(4)制得的单克隆抗体杂交瘤细胞溶液0.5ml，腹腔注射步骤(5)制得的 备用小鼠，2-3周后收集小鼠腹水，12000r/min离心20min后收集上清，即为含有抗HMB0X1 的单克隆抗体，经过饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和纯化后，得到重组人HMB0X1表达载
5体的表达产物的抗体。
上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产
叩o
利用重组人HMBOXl表达载体和重组人HMBOXl表达载体的表达产物可以进一步了解 HMBOXl的生化性质和特点，深入研究HMBOXl的蛋白三级构象。利用重组人HMBOXl表达载 体的表达产物制备的抗人HMBOXl蛋白抗体不仅可以用于研究人HMBOXl蛋白在人体各组织中 的表达情况，还可以对HMBOXl在疾病中的差异表达作进一步分析。另外，此抗体可应用于 HMBOXl在细胞信号传导中的机制研究，阐明HMBOXl蛋白的结合位点以及和其它转录因子的 相互作用。
图1为人HMBOXl cDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳。M为Marker, 1为目的基因。 图2为pET22b-HMBOXl载体构建的PCR和双酶切验证。Ml和M2为DNA marker, 1-4为 载体的四个克隆菌株质粒。左边四道为PCR验证结构，右边四道为BamH I和Hind III双酶
切验证结果。
图3为pET22b-HMB0Xl载体在大肠杆菌Rosseta (DE3)中的表达。M为蛋白质分子量 marker, C为pET22b空质粒诱导组，1-7为pET22b-HMBOXl质粒载体诱导组，箭头所指处为 表达的目的蛋白。
图4为重组HMB01蛋白复性的非还原SDS-PAGE和western blot验证。左图为非还原 SDS-PAGE验证结果，右图为western blot验证结果，M为蛋白质分子量marker, 1为包涵 体未复性蛋白，2为复性蛋白。结构显示，复性蛋白的迁移速度稍快，并有二聚体形成。
图5为竞争ELISA检测抗体的特异性。
图6为western blot检测单克隆抗体的特异性。分别展示了 HMBOXl蛋白在大肠杆菌 Rosseta (DE3)、 HEK293T细胞中的表达。1为HEK293T细胞，2为服K 293T (SiRNA)细胞， 3为RoseUa (pET22b) ， 4为Rosetta (pET22b/腿0Xl) ， 5为纯化的融合蛋白HMBOXl-6His。 结果显示单克隆抗体能检测到HMBOXl在HEK 293T细胞中表达，并且经HMBOXl特异性SiRNA 干扰，HMBOXl表达水平下降；而且单克隆抗体能检测原核系统中HMBOXl的表达。
图7为免疫组织化学检测单克隆抗体的特异性。展示了 HMBOXl蛋白在HEK293T细胞中 的表达，并且经HMBOXl特异性SiRNA干扰，HMBOXl表达水平下降。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本 发明。
实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。 实施例
1、目的基因的获得和含有目的基因克隆载体的构建
以人自然杀伤(NK )细胞系NK92细胞的cDNA为模板，用5'端引物 5, -GGTACCGGATATTGATCCGCCTCATG-3，和3，端引物5， -CTCGAGGGTGCTACGTCTMACTMGTT -3'进行PCR扩增人HMBOXl基因，其中5'端引物含有Kpn I酶切位点，3'端引物含有Xho I酶切位点。PCR反应条件为95。C变性60s， 57'C退火60s， 72'C延伸120s，先循环6次； 然后94。C变性60s, 50. 5。C退火60s， 72。C延伸90s，再循环30次。扩增产物经0. 8%琼脂 糖凝胶电泳，显示为一条1300bp左右的特异性扩增条带，与预期1336相符(如图1所示)。将扩增得到的HMBOXl片段切胶回收纯化并定量后与pGEM easy T载体(Promega公司产品) 连接构建成pGEM-HMBOXl ，然后转化大肠杆菌DH5 a 。转化子经PCR和双酶切验证，筛选获 得有目的基因片段的菌株。经测序证明与GeneBank序列一致，该基因序列为SEQ ID NO. 1 所示。
2、 含有目的片段的重组表达载体的构建
以 pGEM-HMBOXl 为模板进行 PCR 扩增，5， 端引物为 5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3， ， 3， 端引物为 5，-
CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。其中5，端引物含有BaraH I酶切位点和起始密码， 3'端引物含有Hind III酶切位点并使终止密码突变。PCR反应条件为95C变性60s， 58 。C退火60s， 72-C延伸90s，循环25次。扩增产物经双酶切连接到表达载体pET22b,构建 表达产物C端带有6XHistidine标签的pET22b-HMBOXl表达质粒载体。将重组质粒载体转 化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，转化子经PCR和双酶切验证(如图2所示)，筛选获得有目 的基因片段的菌株，并且经测序证明与GeneBank序列一致，该基因序列为SEQ ID NO. 2所 示。
3、 目的蛋白的诱导表达与亲和纯化
含有重组HMBOXl基因的大肠杆菌Rosetta(DE3)接种到放入含氨苄青霉素的LB培养基中 培养，培养至0De。。为0. 4后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopr叩yl P -D-thiogalactoside， IPTG)至终浓度lmM诱导，在30。C继续培养4小时，取lml诱导菌液进行SDS-PAGE分析。 与空载体诱导株和pET22b-HMBOXl未诱导株相比，发现pET22b-HMB0Xl诱导菌株在60kD左 右有特异性条带的表达(如图3所示)，说明pET22b-HMBOXl在宿主菌Rosetta (DE3)中表 达了重组HMBOXl融合蛋白，其序列为SEQ ID NO. 3所示。由于表达的HMBOXl重组蛋白含有 6XHistidine标签，可以利用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化,可依次用3ml蒸馏 tK、 5ml 1 XCharge Buffer (50mMNiSO4)、 3ml 1 XBinding Buffer (0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)过柱子，加载Ni离子，然后以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过 柱子，流速10ml/h，然后再用5ml 1 XBinding Buffer和5ml lXWash Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗涤柱子，最后用4ml 1 XElute Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol 6M尿素pH7.9)洗脱，收集流出液，即为纯化蛋白，为了验 证纯化蛋白是否是人HMBOXl蛋白，在纯化蛋白透析除盐后，进行6XHistidine亲和标记的 western blot鉴定，并且经Q-T0F2质谱测序，有5个肽段与人HMB0X1蛋白完全一致，证 明所获得的蛋白序列正确。
4、 重组HMB0X1蛋白的复性
将步骤3制得的纯化蛋白再一次进行Ni-NTA琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降 低变性剂尿素的浓度，梯度浓度为(IX Binding Buffer溶液)6M尿素2ml、 5.5M尿素lml、 5M尿素lml、 4. 5M尿素lml、 4M尿素lml、 3. 5M尿素lml、 3M尿素lml、 2.5M尿素lml、 2M 尿素lml、 1.5M尿素lml、 lM尿素lml、 0. 5M尿素lml、 0M尿素2ml，然后加入5ml 1 XWash Buffer (0,5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol)洗涤，最后加入4ml 1 X Elute Buffer (0.5M NaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol pH7.9)洗脱，收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMBOXl 表达载体的表达产物。复性蛋白经透析除盐，超滤浓缩，得到浓度为lmg/ml的复性HMBOXl 蛋白。复性HMBOXl蛋白经非还原SDS-PAGE验证，证明其构象恢复，并且有二聚体形成(如 图4所示)。5、 抗人HMB0X1多克隆抗体的制备
(1) 新西兰兔免疫选择体重2kg以上的健康兔，采用背部皮下多点注射，初次免疫 每只200ug，以后每两周注射一次，每只100ug，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到 1: 1乂104时，可采血分离血清。
(2) 采血分离血清最后一次加强免疫后的第七天采血。采血前禁食12小时，但不禁 水。动物麻醉固定，从颈动脉一次性放血，血液37r放置l小时，再放4"过夜，使血清充 分析出。离心取上清，分装-8(TC保存。
6、 抗人HMB0X1单克隆抗体的制备
(1) 小鼠免疫用复性的重组人HMB0Xl蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠(购自中国上海 斯莱克实验动物有限公司)，首次每只50ug，每间隔两周免疫一次，每次25yg，腹腔注射， 用间接ELISA测定血清抗体效价，达到1:1X105时，取免疫小鼠脾细胞以备融合。
(2) 细胞融合筛选细胞融合前复苏SP2/0鼠骨髓瘤细胞(购自上海麦莎生物科技有 限公司)，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤筛选，保持HGPRT缺陷。融合 前一天取8周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种到96孔的孔板上。 一天后取 免疫小鼠脾细胞与上述培养的SP2/0细胞混合，加入50M的PEG4000进行细胞融合，加入到 预先制备好的含有词养细胞的96孔的孔板上。培养14天后，观察融合细胞克隆生长，取培 养上清，用间接ELISA检测抗人HMB0X1抗体效价。对抗人HMB0X1抗体效价高的阳性孔进行 三次单克隆培养，每次用ELISA检测抗体效价，直至所有克隆孔均成阳性， 一共得到2株针 对融合HMB0X1蛋白不同抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞系，即2A5F4和4A4F2，抗体亚 型为IgG亚类。
(3) 单克隆抗体的大量制备
将一定量的杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，注射前一周预先用石蜡油腹腔注射此小 鼠。2-3周后收集小鼠腹水，离心后收集上清，即为含有抗HMB0X1的单克隆抗体。然后进 行饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和纯化。
(4) 单克隆抗体的特异性检测
① ELISA:免疫阳性血清或杂交瘤细胞株的培养上清能与重组HMB0X1蛋白反应，而未免 疫阴性血清不能与重组蛋白反应。说明多克隆抗体和单克隆抗体特异性针对重组HMB0X1蛋 白(如图5所示)。
② Westernblot:分别用重组HMB0X1蛋白和细胞系蛋白作为检测样品，经western blot 鉴定，结果在47kD左右有一条特异性条带，进一步验证了多克隆抗体和单克隆抗体能够特 异性结合重组HMB0X1蛋白，并且可以和天然蛋白特异性结合，用于western blot鉴定(如 图6所示)。
③ 免疫组织化学利用制备的抗体检测HEK 293T细胞(包括经SiRNA干扰的HEK 293T 细胞)，免疫组织化学结果显示HMB0X1蛋白在此细胞中有表达，而且表达水平有差异，证明 制备的抗体可与天然构象的HMB0X1蛋白结合，用于免疫组织化学的检测(如图7所示)。
8SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
〈120〉重组人HMBOXl表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用
〈160> 3
<170〉 Patentln version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 1348
〈212〉 DNA
<213> 人
〈400〉 1
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〈210〉 2
〈211〉 1282
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<213〉 人
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Asp Leu Leu
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Arg
30
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Ser Ser Thr
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Pro Glu Trp Arg 260 Arg
Phe 230 Ser
215 Tyr
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Arg Trp Tyr Arg
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Phe Arg Leu 275
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Lys 305 Gly
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Gly Tyr
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Phe 295 Asn
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Lys Pro 320 Val Tyr 335
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Ala Ala Ala Leu Glu His His 435
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His 440
Ala 425
His His His
Trp 430
Leu Ala 400 Arg Gin 415
Lys Leu
1权利要求
1、一种重组人HMBOX1表达载体，通过如下步骤构建制得(1)从人自然杀伤细胞系NK92细胞中扩增得到人HMBOX1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)制得的人HMBOX1基因与pGEM easy T载体连接构建成pGEM-HMBOX1；(3)以步骤(2)制得的pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5’端和3’端设计BamH I和Hind III酶切位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO.2所示；(4)将步骤(3)制得的扩增产物经BamH I和HindIII双酶切后与载体pET22b连接，构建得到表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到重组人HMBOX1表达载体。
2、 如权利要求1所述的重组人HMB0X1表达载体，其特征在于，上述步骤(3)中，引 物序列如下5，端引物为5， -CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3，， 3，端引物为5， — CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC -3，。
3、 如权利要求1所述的重组人HMB0X1表达载体，其特征在于，上述步骤(3)中，PCR 反应条件为95。C变性60s, 58。C退火60s, 72'C延伸90s,循环25次。
4、 一种如权利要求1所述重组人HMB0X1表达载体的表达产物，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
5、 一种如权利要求4所述重组人HMB0X1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下(1) 将重组HMBOX1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至ODeo。为 0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度lmM，在30'C继续诱导培养4小时，得诱导菌液；(2) 将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后 的HMB0X1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂 尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMBOXl表达载体的表达产物。
6、 如权利要求5所述的重组人HMB0X1表达载体的表达产物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的具体步骤如下1) 用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水；2) 吸取2ml NTA-Resin树脂到空柱中，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子，使液体流出；3) 依次用3ml蒸馏水；5ml 1 XCharge Buffer,含有50mMNiSO4; 3ml 1 XBinding Buffer 含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9;过柱子，力tl载Ni离子；4) 将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，流速10ml/h;5) 然后依次用5ml lXBinding Buffer和5ml lXWash Buffer含有0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 60mM imidazol 6M尿素pH7.9，洗涤柱子；6) 依次加入梯度尿素lXBinding Buffer溶液；7) 力卩入5mllXWash Buffer含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 60mM imidazol,洗涤；8) 加入4ml lXElute Buffer含有0.5MNaCl 20mMTris.HCl 1M imidazol pH7.9，洗脱， 收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMB0X1表达载体的表达产物。
7、 如权利要求6所述的重组人HMB0X1表达载体的表达产物的制备方法，其特征在于， 所述步骤6)中的尿素的浓度梯度分别为6M尿素2ml 、 5. 5M尿素lml 、 5M尿素lml 、 4. 5M尿素lml 、 4M尿素lml 、 3. 5M尿素lml 、 3M尿素lml、 2. 5M尿素lml、 2M尿素lml、 L5M尿素lml、 1M尿素lml、 0.5M尿素lml、 OM尿素2ml。
8、 一种如权利要求4所述的重组人HMB0X1表达载体的表达产物的抗体，通过如下步骤 制备(1) 用重组人HMB0Xl表达载体的表达产物免疫8周龄BALB/c小鼠，首次每只50ug， 每间隔两周免疫一次，每次25pg，腹腔注射，用间接ELISA测定血清抗体效价，达到l:l X105时，取免疫小鼠脾细胞，备用；(2) 复苏SP2/0鼠骨髓瘤细胞，保证融合时细胞处于对数生长期，并用8-氮鸟嘌呤筛 选，保持HGPRT缺陷，得备用骨髓瘤细胞；(3) 取8周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种到96孔的孔板上，静置 24小时，备用；(4) 取步骤(1)制得的免疫小鼠脾细胞与步骤(2)制得的备用骨髓瘤细胞混合，加 入50y。的PEG4000进行细胞融合，然后加入到步骤(3)制备好的含有饲养细胞的96孔的孔 板上，培养10-14天后，取培养上清，用间接ELISA检测抗人HMB0X1抗体效价，对抗人HMB0X1 抗体效价高的阳性孔进行三次单克隆培养，直至所有克隆孔均成阳性，得单克隆抗体杂交瘤 细胞溶液，该单克隆抗体杂交瘤细胞溶液每毫升含有1乂106个单克隆抗体杂交瘤细胞；(5) 先用石蜡油腹腔注射BALB/c小鼠，饲养一周，得备用小鼠；(6) 取步骤(4)制得的单克隆抗体杂交瘤细胞溶液0.5ml，腹腔注射步骤(5)制得的 备用小鼠，2-3周后收集小鼠腹水，12000r/min离心20niin后收集上清，即为含有抗HMB0X1 的单克隆抗体，经过饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和纯化后，得到重组人HMB0X1表达载 体的表达产物的抗体。
全文摘要
本发明涉及重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用，属基因工程技术领域。本发明详细阐述了人HMBOX1表达载体的构建、HMBOX1表达产物的制备及、HMBOX1表达产物的抗体的制备，可以进一步了解HMBOX1的生化性质和特点，深入研究HMBOX1的蛋白三级构象。利用重组人HMBOX1表达载体的表达产物制备的抗人HMBOX1蛋白抗体不仅可以用于研究人HMBOX1蛋白在人体各组织中的表达情况，还可以对HMBOX1在疾病中的差异表达作进一步分析。另外，此抗体可应用于HMBOX1在细胞信号传导中的机制研究，阐明HMBOX1蛋白的结合位点以及和其它转录因子的相互作用。
文档编号C12P21/02GK101555484SQ200910015258
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者建 张, 军 戴, 田志刚 申请人:山东大学