一种植物双价表达载体及其构建方法

专利名称：一种植物双价表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体的说是到一种将雨生红球藻中的胡萝 卜素酮化酶基因(bkt)和胡萝卜素羟化酶基因(CrtR-B)同步转化植物双价表达载体及
其构建方法。
背景技术：
虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。单细 胞绿藻雨生红球藻在环境胁迫条件下可以合成并积累虾青素，含量高达细胞干重的4%， 是其它生物的一到几个数量级，成为目前首选的天然虾青素合成工具。雨生红球藻的虾 青素是在一系列酶的作用下合成的，其中胡萝卜素酮化酶和胡萝卜素羟化酶是 两个关键酶，它们共同作用转化胡萝卜素形成虾青素(GrunewaldK等，2000，Plant Physiol，122: 1261-1268)。这两个酶皆是双功能酶，3 _胡萝卜素酮化酶能分别以
胡萝卜素和玉米黄素为底物，在C4和C4'位上引入酮基(FraserPD等，1998，Eur J Biochem, 252 229-236) ； 0 -胡萝卜素羟化酶能分别以胡萝卜素和角黄质为底 物，在 C3 禾PC3'位分别引入一个羟基(Linden H，1999，BiochimBiophys Acta, 1446 203-212)。在玉米、花生等植物中一般不合成虾青素，所以要利用其它植物中的前体物 质合成虾青素，0 -胡萝卜素酮化酶和0 -胡萝卜素羟化酶是必不可少的。现已将雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中的bkt基因(GenBank序列号 D45881)和crtR-B基因(GenBank序列号AF162276)克隆出来，这使得运用代谢工 程手段在高等植物中合成生产大量天然虾青素成为可能，现在已经有科研人员在这一领 域进行了尝试。Mann等将克隆到的0 -胡萝卜素酮化酶基因与番茄pds基因启动子结 合转入烟草后，植株叶片中类胡萝卜素成分及含量没有改变，但在花的蜜腺有色体中积 累了高浓度的虾青素，使花的颜色从黄变红(Mann V等，2000，Nat Biotechnol, 18: 888-892)。结构分析显示，转基因烟草形成的虾青素与雨生红球藻形成的天然虾青素具 有相同的空间螺旋特性。Ralley等将0 -胡萝卜素酮化酶和0 -胡萝卜素羟化酶基因与 导肽融合，并在烟草花叶病毒的CaMV35S启动子的驱动下转入番茄和烟草，也成功地在 番茄及烟草的叶片中得以表达(Ralley L，2004，The Plant Journal, 39: 477-486)。然而 这些工作主要是将bkt或crtR-B中的单一基因转进植物，或是将两个基因连接在同一启动 子下启动，而当将两个基因构建在同一载体上并分别由两个启动子启动调控时是否能提 高虾青素的含量还不得而知，因此构建含有胡萝卜素酮化酶基因和胡萝卜素羟化 酶基因的植物双价表达载体，使两个基因同时转入植物，对通过基因工程手段提高转化 植物中虾青素合成量的研究具有重要意义。

发明内容
本发明的目的在于提供将雨生红球藻中的胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和 胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)同步转化植物双价表达载体及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为1.植物双价表达载体序列表SEQ ID No.l中的碱基序列所示，其为3 _胡萝卜素 酮化酶基因(bkt)和胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)共同插入到pCAMBIA1301表达载 体上，得到的植物双价表达载体。2.所述植物双价表达载体总长度为12727bp，bkt和crtR_B基因的表达均由各自 上游的CaMV35S启动子启动。3.首先，从雨生红球藻中克隆0 -胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和0 -胡萝卜素羟 化酶基因(crtR-B)；其次，将得到的bkt和crtR-B分别连接在两条pET_28a(+)载体上 得到 pET-28a(+)_bkt 和 pET_28a (+)-crtR-B 载体；再次，以 pET_28a (+)-bkt 为模板， Pi和P2为引物PCR扩增，产物经BamHI和SacI酶切回收片段和pBI221载体用T4DNA 连接酶连接，得到pBI221-bkt中间载体，之后再用Hindlll、EcoRI双酶切该中间载体和 pCAMBIA1301载体，并用T4DNA连接酶连接得到pCAMBIA1301_bkt中间载体；最后， 以pET_28a(+)-crtR-B为模板，P3和P4为引物PCR扩增，产物和pCAMBIA1301_bkt中 间载体经Bglll和BstEII酶切，回收的片段由T4 DNA连接酶将crtR-B基因正向连接到酶 切后的pCAMBIA1301-bkt载体上，即得序列表SEQ ID No.l中的碱基序列所示的植物双 价表达载体。4.所述P” P2、P3、P4 引物分别为Pi 5' AAAGGATCCATGCACGTCGCATC 3 ‘ 、P 2 5 ‘ AACGAG C T C TCATGCCAAGGCAG 3 '、 P 3 5 ‘ CCCAG AT C TATGCTGTCGAAGCTGC 3 ‘ 、P 4 5' AAAGGTCACCCTACCGCTTGGACCA 3'。5.所述bkt基因上游具有35S启动子，下游具有NOS终止信号，构建成 35S-bkt-NOS片段，该片段反向插入到pCAMBIAl301载体上；crtR-B基因上游具有 35S启动子，下游具有NOS终止信号，构成35S-crtR-B-NOS片段，该片段正向插入在 pCAMBIA1301 载体上。本发明所具有的优点1.本发明通过将从雨生红球藻中克隆出来的胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和 胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)构建到同一载体上，以使bkt和crtR-B两个基因通过农
杆菌为介导转入植物中，使植物中同时表达胡萝卜素酮化酶和胡萝卜素羟化酶， 进而克服了将两个基因分别导入植物体而造成的两种酶不能同步表达的问题，同时可以 充分利用植物中胡萝卜素前体物质高效合成虾青素，本发明与两个基因分别构建载 体再转化植物相比转化方法更为简单。2.本发明的另一优点在于两个基因上游都有相应的35S启动子启动，与一个启 动子启动两个基因相比，基因转录表达效率更高；并且本发明双价表达载体上表达的雨 生红球藻羟化酶是双功能酶，既能以胡萝卜素为底物又能以角黄质为底物，在C3和 C3'位分别引入一个羟基，催化生成玉米黄素和虾青素，而玉米黄素又可作为酮化酶的 底物，同时本发明双价表达载体上表达的雨生红球藻羟化酶是双功能酶，既能以胡 萝卜素为底物又能以玉米黄素为底物，在C4和C4'位上分别引入一个酮基，催化生成角 黄质和虾青素，而生成的角黄质又可作为羟化酶的底物。3.高等植物中本身不具备相关的酶基因而不能在体内合成虾青素，将本发明表达载体转化植物后，使其拥有了藻类中的羟化酶和酮化酶基因从而能够在体内合成虾青 素，改造了植物的胡萝卜素代谢途径，使其合成了高附加值的产物。4.利用本发明载体转化高等植物所产生的虾青素和雨生红球藻及其它细菌中的 天然虾青素具有相同的空间构型，克服了利用化学合成的方法不能生成具有天然构型的 虾青素的问题。5.本发明双价表达载体上克隆的基因均来自真核生物雨生红球藻，这与从细菌 等某些原核生物克隆相关基因相比，在转化真核高等植物时，被转入的外源基因沉默的 概率更低。


图1为pBI221_bkt中间载体构建流程图。图2为pCAMBIA1301_bkt中间载体构建流程图。图 3 为 pCMBIA1301-bkt 中间载体图。图 4 为 pCAM[BIA1301-bkt-crtR_B 中间载体图。图5为pCAMBIA1301-bkt-crtR_B双价载体构建流程图。图6为表达载体pCAMBIA1301-bkt-crtR-B中bkt基因的PCR检测。图 7 为表达载体 pCAMBIA1301-bkt-crtR-B 中 crtR-B 基因的 PCR 检测。
具体实施例方式在下面的实例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实验材料及试剂盒所有DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，LaTaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合 酶，均购自大连TakaRa公司，小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、植物总基 因组提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。实施例1植物双价表达载体序列表SEQIDNo.l中的碱基序列所示，其为0 _胡萝卜素酮 化酶基因(bkt)和胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)共同插入到pCAMBIA1301表达载体 上，得到的植物双价表达载体。序列表SEQIDNo.lATGCTGTCGAAGCTGCAGTCAATCAGCGTCAAGGCCCGCCGCGTTGAACTA GCCCGCGACATCACGCGGCCCA AAGTCTGCCTGCATGCTCAGCGGTGCTCGTTAGTTCGGCTGCGAGTGGCAG CACCACAGACAGAGGAGGCGCTGGGAACCGTGCAGGCTGCCGGCGCGGGCGATGAGCACAGCGCCGATGTAG CACTCCAGCAGCTTGACCGGGCTATCGCAGAGCGTCGTGCCCGGCGCAAACGGGAGCAGCTGTCATACCAGG CTGCCGCCATTGCAGCATCAATTGGCGTGTCAGGCATTGCCATCTTCGCCACCTACCTGAGATTTGCCATGCACA TGACCGTGGGCGGCGCAGTGCC
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ACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTC ATTTCATTTGGAGAGAACACGG
GGGACTCTTGACCATGGTA
(a)序列特征
长度I272Tbp
类型碱基序列
链型单链
拓扑结构环状
(b)分子类型双链DNA
(C)假设否
(d)反义否
(e)最初来源雨生红球藻
(f)特异性名称CDS
实施例2
植物双价表达载体的构建
1.从雨生红球藻中克隆β -胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β -胡萝卜素羟化酶基 因(crtR-B)。
2.将得到的bkt和crtR-B分别连接在两条pET48a(+)载体(Novagen)上得到 pET-28a (+) -bkt 和 pET_28a (+) -crtR-B 载体。
3.根据载体pET_28a⑴_bkt序列设计一对引物P1Z^P2，并在上游引物和下游 引物的5’端分别引入BamHI和SacI酶切位点(由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。)，以质粒pET-28a(+)-bkt为模板，用引物组合P/^和La Taq DNA聚合 酶进行PCR扩增，产物经BamHI和SacI酶切回收片段和pBI221载体用T4DNA连接 酶连接，得到pBI221-bkt中间载体，得到pBI221-bkt载体(如图1)。再用Hindlll、 EcoRI双酶切该载体，得到大小约为2 的35S-bkt_NOS片段，而后将植物表达载 体pCAMBIA1301 (CAMBIA)同样经HindIII、EcoRI双酶切，将其酶切后片段与 35S-bkt-NOS片段用T4DNA连接酶连接，获得中间载体pCAMBIA 1301-bkt(如图2、 3)，并转化大肠杆菌TOPlO中保存，待用。
P1: 5' AAAGGATCCATGCACGTCGCATC 3‘
P2 5' AACGAGCTCTCATGCCAAGGCAG 3‘
PCR 扩增反应条件95°C预变性 5η ι ； 94°C变性 lmin，59°C退火 lmin，72°C延伸1.5min,循环35次；72°C继续延伸IOmin0
4.根据载体pET_28a (+) -crtR-B序列设计一对引物，并在上游引物和下 游引物的5’端分别引入BglII和BstEII酶切位点(由上海Sangon合成)，以质粒 pET-28a(+) -crtR-B为模板，用引物组合P/PjPLa Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，得到 含有BglII和BstEII酶切位点的约879bp的crtR-B基因片段，用BglII和BstEII双酶切后 回收。pCAMBIA1301-bkt中间载体经BglII和BstEII酶切，将其与crtR-Β片段用T4DNA 连接酶连接，并转化大肠杆菌TOPIO，保存待用，即得序列表SEQIDNal中的碱基序列 所示的植物双价表达载体(如图4、5)。该载体中包含bkt基因和crtR-B基因两个完整 表达盒(分别含有CaMV 35S启动子和NOS终止子)，为双价植物表达载体，筛选标记 为Km。进一步酶切鉴定显示，pCAMBIA1301-bkt_crtR-B载体经BamHI、SacI双酶切 产生963bp—条带(如图6)，经Bglll、BstEII双酶切产生879bp—条带(如图7)，说明 bkt基因和crtR-B基因已成功克隆到pCAMBIA1301中。
P3 5' CCCAGATCTATGCTGTCGAAGCTGC 3‘
P4 5' AAAGGTCACCCTACCGCTTGGACCA 3‘
PCR 扩增反应条件95°C预变性 5η ι ； 94°C变性 lmin，63°C退火 lmin, 72°C延伸1.5min,循环35次；72°C继续延伸IOmin0
实施例3、双价载体转化花生
1.转化根癌农杆菌EHA105:提取实施例2所得的植物双价表达载体 pCAMBIA1301-bkt-crtR_B质粒，采用冻融法转化感受态农杆菌EHA105，涂布于含有利 福霉素(Rif，50mg/L)、卡那霉素(Km，50mg/L)的固体YEB培养基平皿上，暗培 养48h。挑取单菌落采用带有相同抗生素的YEB液体培养基培养。用引物组合P/^对 bkt基因以及用引物组合P/P4对crtR-B基因分别进行PCR检测，双阳性克隆即为含有 双价植物表达载体的农杆菌工程菌株EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR_B。接种农杆菌 EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B 单克隆在 5ml 含Rif(50mg/L)、Km(50mg/L)的 YEB 液体培养基中，^°C、200r/mte震荡培养过夜，取Iml移入25mlYEB液体培养基中继续培养至OD6tltl为0.65左右，6000r/min离心15min后，用诱导液体培养基悬浮至OD6tltl = 0.65。
2.花生胚小叶及胚生长点外植体的准备选取成熟饱满的花生种子，除去子 叶，取出胚，用70%酒精浸泡约Ιη ι，再用0.1 l^HgCl2溶液消毒6η ι，无菌条件下用无 菌水冲洗3-4次，置于培养箱中，无菌水浸泡。浸泡16-lSh后，把花生胚的胚小叶 从其基部切下，获得胚小叶外植体，尽量使每片胚小叶分开，接种在诱导培养基上。剥 去胚小叶的胚，切去胚轴和胚根，获得胚生长点外植体，接种在诱导培养基上，预培养 4d。
3.双价植物表达载体对花生的遗传转化接种农杆菌EHA105/ pCAMBIA1301-bkt-crtR-B 单克隆在 5ml 含 Rif(50mg/L)、Km(50mg/L)的 YEB 液体培 养基中，^°C、200r/mta震荡培养过夜，取Iml移入25mlYEB液体培养基中继续培养至 OD600为0.65左右，6000r/min离心15min后，用诱导液体培养基悬浮至OD600 = 0.65。 将预培养的受体材料放入该悬浮液中15η ι，取出用无菌滤纸吸干表面液体，接于诱导培 养基上，l&h光照/天、共培养。共培养4d后，外植体用无菌水洗4次，在含头孢 噻肟霉素(Cef，650mg/L)的MSB液体培养基中震荡杀菌《1，吸干表面水分，转接在诱 导培养基上维持培养10d，之后再转入含Cef(500mg/L)、Km(100mg/L)的诱导培养基上 筛选并继续诱导再生芽，每20d继代培养一次。筛选培养40d后，将存活的芽丛或抗性 芽转入含Cef(300mg/L)、Km(100mg/L)的芽伸长培养基上继续培养，待芽长至2 3cm 左右时，切下并置于生根培养基中生根。相关培养基见表1。
4.检测农杆菌菌株EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B介导转化“花育23”花生胚生长点外植体，用lOOmg/L卡那霉素筛选获得再生花生植株。以重组质粒 pCAMBIA1301-bkt-crtR_B为阳性对照，未转化植株为阴性对照，各取1 μ L DNA为模 板，检测到bkt基因和crtR-Β基因都为阳性的植株。
因此bkt和crtR-Β两个基因，构建在同一载体上并分别由两个启动子驱动表达， 通过提高酶的表达量，提高虾青素的含量，并且保持虾青素的生物活性。
表1供试培养基成分
>培养基^ 成分， ""~Media_Components__MSBMS无机盐+B5有机物+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH5.8诱导培养基MSB +4 mg/L 6-BA+l mg/L NAA芽伸长培养基MSB +1 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KIN+2 mg/L IAA生根培养基MSB +0.2 mg/L NAA
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120> 一种植物双价表达载体及其构建方法
<130>
<160>13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>12727
<212>DNA
<213>雨生红球藻
<220>
<221>CDS
<222> (1)..(882)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(10125)..(11087)
<223>
<400>1
atg ctg tcgaagctgcagteaateagegtcaag gcc cgc cgc gtt gaa48
Met Leu SerLysLeuGlnSerlieSerValLys Ala Arg Arg Val Glu
151015
cta gcc cgcgacateacgeggCCCgtctgc ctg cat get cag egg96
Leu Ala ArgAsplieThrArgProLysValCys Leu His Ala Gln Arg
202530
tgc tcg ttagtteggctgcgagtggcagcacca cag aca gag gag gcg144
Cys Ser LeuValArgLeuArgValAlaAlaPro Gln Thr Glu Glu Ala
354045
ctg gga accgtgcaggetgccggcgcgggcgat gag cac age gcc gat192
Leu Gly ThrValGlnAlaAlaGlyAlaGlyAsp Glu His Ser Ala Asp
505560
gta gca ctccagcagCttgacegggetategca gag cgt cgt gcc egg240
Val Ala LeuGlnGlnLeuAspArgAlalieAla Glu Arg Arg Ala Arg
657075 80
cgc aaa egggagcagctgteataccaggetgcc gcc att gca gca tea288
Arg Lys ArgGluGlnLeuSerTyrGlnAlaAla Ala lie Ala Ala Ser
859095
att ggc gtgteaggcattgccatettcgccacc tac ctg aga ttt gcc336
lie Gly ValSerGlylieAlaliePheAlaThr Tyr Leu Arg Phe Ala
100105110
atg cac atgaccgtgggcggcgcagtgccatgg ggt gaa gtg get ggc384
Met His MetThrValGlyGlyAlaValProTrp Gly Glu Val Ala Gly
115120125
actctcctcttggtggttggtggcgcgctcggcatggagatgtatgcc432
ThrLeuLeuLeuValValGlyGlyAlaLeuGlyMetGluMetTyrAla
130135140
CgCtatgcacacgccatetggcatgagtcgcctCtgggctggCtg480
ArgTyrAlaHisLysAlalieTrpHisGluSerProLeuGlyTrpLeu
145150155160
CtgcacaagagecaccacacacctCgCactggaCCCtttgaagccaac528
LeuHisLysSerHisHisThrProArgThrGlyProPheGluAlaAsn
165170175
gacttgtttgcaateateaatggaCtgCCCgccatgctcCtgtgtacc576
AspLeuPheAlalielieAsnGlyLeuProAlaMetLeuLeuCysThr
180185190
tttggcttctggCtgCCCaacgtcCtgggggcggcctgctttggagcg624
PheGlyPheTrpLeuProAsnValLeuGlyAlaAlaCysPheGlyAla
195200205
gggCtgggcateacgctatacggcatggcatatatgtttgtacacgat672
GlyLeuGlylieThrLeuTyrGlyMetAlaTyrMetPheValHisAsp
210215220
ggcCtggtgcacaggCgCtttCCCaccgggCCCategetggcCtgCCC720
GlyLeuValHisArgArgPheProThrGlyProlieAlaGlyLeuPro
225230235240
tacatgaagCgCCtgacagtggcccaccagctacaccacageggcaag768
TyrMetLysArgLeuThrValAlaHisGlnLeuHisHisSerGlyLys
245250255
tacggtggcgcgCCCtggggtatgttcttgggtccacaggagCtgcag816
TyrGlyGlyAlaProTrpGlyMetPheLeuGlyProGlnGluLeuGln
260265270
cacattccaggtgcggcggaggaggtggagcgaCtggtcCtggaaCtg864
HislieProGlyAlaAlaGluGluValGluArgLeuValLeuGluLeu
275280285
gactggtccaageggtaggtgaccagct cgaatttccc cgatcgttca912
AspTrpSerLysArg
290
aacatttggc aataaagttt cttaagattgaatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc972
atataatttc tgttgaatta cgttaagcatgtaataatta acatgtaatgcatgacgtta1032
tttatgagat gggtttttat gattagagtcccgcaattat acatttaatacgcgatagaa1092
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaattatcgcgcg cggtgtcatctatgttacta1152
gatcgggaat taaactatca gtgtttgacaggatatattg gcgggtaaacctaagagaaa1212
agagcgttta ttagaataac ggatatttaaaagggcgtga aaaggtttatccgttcgtcc1272
atttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaacc1332
cctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgtcttctgaaaacga1392
catgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgcccttttcctggcgttt1452
tcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactagaaccggagacatta1512
cgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcgtcagcaccgacga1572
ccaggacttg3.CC3.3.CC3.3.Cgggccgaactgcacgcggccggctgcaccaagctgttttc1632
cgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccaggatgcttgaccacct1692
acgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggcccgcagcacccgcga1752
cctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgcgtagcctggcaga1812
gccgtgggccgacaccaccaCgCCggCCggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcat1872
tgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaa1932
ggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgc1992
ccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgt2052
gcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggc2112
caggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgc2172
cgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccg2232
tttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccg2292
cccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaag2352
ctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaagg2412
tgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatga2472
gtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaag2532
gcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccgggg2592
ccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgc2652
gggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtga2712
aggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttgg2772
ctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacg2832
acatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatg2892
gaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtg2952
aggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagc3012
gcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagg3072
gcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaat 3-3-3- C 3-3-3-3-ctcatttgag3132
ttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgag3192
cgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcg3252
ggtcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgcca3312
aggcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgag3372
caaatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaag3432
aacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccag3492
gcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgagg3552
aatcggcgtgacggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgat3612
gacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaa3672
gcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaa3732
ccgccggcagCCggtgCgCCgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagat3792
tttttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtg3852
gccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagctt3912
ccagacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattac3972
gacctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaaggg4032
aagggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgc4092
cggcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaac4152
accacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggta4212
tccgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccg4272
gagtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaac4332
ccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatCggCCgtttt4392
ctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacg4452
atctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaag4512
ctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggc4572
ccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaa4632
tgtacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctc4692
tttcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccg4752
tacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatata4812
aaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaa3-3-C C3.3.3.4872
acccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcg4932
cctacccttcggtcgctgcgctccctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggcc4992
gctggccgctcaaaaatggctggcctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagcc5052
gcgccgtcgccactcgaccgccggcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcgg5112
tgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgta5172
agcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcg5232
gggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcg5292
gcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgc5352
gtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgc5412
tcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcc5472
acagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagg5532
aaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcat5592
cacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccag5652
gcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccgga5712
tacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtagg5772
tatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgtt5832
cagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacac5892
gacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc5952
ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtattt6012
ggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatcc6072
ggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgc6132
agaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgg6192
aacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcattctaggtactaaaacaattcatcc6252
agtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaat6312
agctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatg6372
tcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgcca6432
tctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcg6492
ggcttttccg C 3.3.3.3.3.atcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttct6552
tcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggct6612
aagcggctgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagc6672
ctgatgcactccgcatacagctcgataatcttttcagggctttgttcatcttcatactct6732
tccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgt6792
tcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttt6852
tcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatatagg6912
ttttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatctttt6972
acgcagcggtatttttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatt7032
tattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagct7092
agacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaataccagaaaacagctt7152
tttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaac7212
cgcggtgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctaccctccgcg7272
agatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagcatcggtaa7332
catgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgg7392
gctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggc7452
tggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaactta￡Ι ￡1￡10￡10￡Ι 7512
gcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagt7572
actggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttaCclclcltclCclclcl7632
tacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaat7692
tcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgaca7752
gatccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttc7812
cactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcga7872
tttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcg7932
cccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaa7992
tgcggagcatatacgcccggagtcgtggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcga8052
agtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcga8112
cctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggc8172
cattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcgg8232
ggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacgg829221
tgtcgtccatcacagtttgccagtgataca catggggatc agcaatcgcg catatgaaat8352
cacgccatgtagtgtattga ccgattccttgcggtccgaa tgggccgaacccgctcgtct8412
ggctaagatcggccgcagcg atcgcatcca tagcctccgcgaccggttgtagaacagcgg8472
gcagttcggtttcaggcagg tcttgcaacg tgacaccctg tgcacggcgg gagatgcaat8532
aggtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccg8592
atgcaaagtgccgataaaca taacgatctttgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc8652
gcaggacatatccacgccctcctacatcga agctgaaagc acgagattcttcgccctccg8712
agagctgcatcaggtcggag acgctgtcga acttttcgatcagaaacttctcgacagacg8772
tcgcggtgagttcaggctttttcatatctcattgccccccgggatctgcgaaagctcgag8832
agagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaa8892
cttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgt8952
cagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttcttttt9012
ccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatctt9072
gaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttcta9132
ctgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgata9192
ttaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatat9252
tcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttatcacatcaatccacttgctttg9512
aagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctt9572
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<213>雨生红球藻
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151015
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<213>雨生红球藻
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<213>雨生红球藻
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<212>PRT
<213>雨生红球藻
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202530
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Phe Pro His Phe Ala Ser Met Val Val Val Leu Pro Val Leu Ala Met
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<213>雨生红球藻
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Tyr Gly Ala Met His Cys Val Met Cys Gly Asp Glu
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<213>雨生红球藻
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<213>雨生红球藻
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<213>雨生红球藻
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<213>雨生红球藻
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<213>雨生红球藻
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20
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<213>雨生红球藻
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Cys Arg CysAsp Val
15Gly Ala Asn Asp Gly Gln Arg His Arg Asp Ala1015Trp Arg Phe Val Gly Val Leu 25ValVal lie Leu Cys Arg Pro Arg Ser Gln Asp Val1015Cys Leu Thr Ala Phe Leu Leu Asp His 2530His
权利要求
1.一种植物双价表达载体，其特征在于植物双价表达载体序列表SEQID Nal中的 碱基序列所示，其为胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CrtR-B) 共同插入到PCAMBIA1301表达载体上，得到的植物双价表达载体。
2.按权利要求1所述的植物双价表达载体，其特征在于所述植物双价表达载体总 长度为12727bp，bkt和crtR-B基因的表达均由各自上游的CaMV35S启动子启动。
3.—种按权利要求1所述的植物双价表达载体的构建方法，其特征在于首先，从 雨生红球藻中克隆β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CrtR-B)； 其次，将得到的bkt和crtR-B分别连接在两条pET-28a (+)载体上得到pET_28a (+) -bkt和 pET_28a(+)-CrtR-B载体；再次，以pET_28a⑴-bkt为模板，P1和P2为引物PCR扩增， 产物经BamHI和SacI酶切回收片段和pBI221载体用T4DNA连接酶连接，得到pBI22l_bkt 中间载体，之后再用Hindlll、EcoRI双酶切该中间载体和pCAMBIA1301载体，并用T4 DNA连接酶连接得到pCAMBIA1301-bkt中间载体；最后，以pET_28a(+) -crtR-B为模 板，P3和P4为引物PCR扩增，产物和pCAMBIA1301-bkt中间载体经BglII和BstEII酶 切，回收的片段由T4 DNA连接酶将CrtR-B基因正向连接到酶切后的pCAMBIA1301-bkt 载体上，即得序列表SEQ ID Nal中的碱基序列所示的植物双价表达载体。
4.按权利要求3所述的植物双价表达载体的构建方法，其特征在于所 述 P” P2、P3、P4 弓 I 物分另Ij 为P1 5 ‘ AAAGGATCCATGCACGTCGCATC 3 ‘ 、P 2 5 ‘ AACGAGCTCTCATGCCAAGGCAG 3 ‘、 P 3 5 ‘ CCC AGATCTATGCTGTCGAAGCTGC 3 ‘ 、P4: 5' AAAGGTCACCCTACCGCTTGGACCA 3‘。
5.按权利要求3所述的植物双价表达载体的构建方法，其特征在于所述bkt基因 上游具有35S启动子，下游具有NOS终止信号，构建成35S-bkt_NOS片段，该片段反向 插入到pCAMBIA1301载体上；crtR-B基因上游具有35S启动子，下游具有NOS终止信 号，构成35S-crtR-B_NOS片段，该片段正向插入在pCAMBIA1301载体上。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，具体的说是一种植物双价表达载体及其构建方法。植物双价表达载体序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示，其为β-胡萝卜素酮化酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因共同插入到同一表达载体上，得到的植物双价表达载体。构建为从雨生红球藻中克隆bkt和crtR-B基因；将bkt基因连接到pBI221载体上；酶切连有bkt基因的pBI221载体，得到35S-bkt-NOS片段，然后将此片段插入到pCAMBIA1301载体上；最后，将crtR-B基因插入到含有bkt片段的pCAMBIA1301载体上，得到含bkt和crtR-B基因的植物双价表达载体，将该载体转化高等植物，可以充分利用植物中β-胡萝卜素前体物质高效合成虾青素。
文档编号C12N15/82GK102021197SQ20091001852
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者任宝永, 侯艳华, 徐静, 李富超, 王宏华, 秦松 申请人:中国科学院海洋研究所