专利名称：表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗及病毒治疗领域，具体涉及到一种条件复制型腺病毒载体及其构建方案 和应用。
背景技术：
肿瘤是目前严SA类身体健康的疾病之一，目前除了化疗及放疗外还没有发现有效的治疗手 段。因此探索新的治疗方法显得极为重要。基因治疗作为疾病治疗的一种新手段，在肿瘤治疗中 有着重要的应用前景。基因治疗的关键是病毒载体。目前在月中瘤基因治疗中，最引人注目的病毒 载体是条件复制型腺病毒载体(Conditionally R印licating oncolytic Adenoviral Vector, CRAD)。这类载体可以选择性地在肿瘤组织中扩增，大量扩增的病毒最终可将肿瘤杀死，因此具有 明显的抛中瘤活性。
目前^f牛复制型腺病毒载体大致可以分三种类型(1)用肿瘤特异性启动子鋭E1A基因， 此类载体可在所使用肿瘤特异性启动子活性较高的肿瘤细胞中特异扩增；(2) E1B 55KD缺失腺病 毒载体，此类载体可以在p53 null/mutant的肿瘤细胞中特异扩增；(3) E1A分子CR2中24个碱 基缺失(Ad5 D24)，这类载皿pRB null/mutant的肿瘤细胞中特异扩增。但由于这类病毒载体 自身的一些不足，例如对肿瘤组织感染效率低及駄治疗基因的数目有限等，从而导致治疗效果 并不十分明显。本发明拟在Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载体的基础上，经过以下两方面的麟以 提高这类载條恶性胞瘤中的治疗效果(1)增加载体外源基因的表达数目(2-3个)；(2)对病 毒载体进W,以提高其感染效率。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述剝牛复制型腺病毒载体的缺点，提供一种表达 多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺 病毒载体的构建方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于衝共一种就多个外源基因的Ad5 D24斜牛复制型 腺病毒载体的用途。解决战技术问^ffl的技术方案是重组腺病毒载体中Ad5 El CR2中有24鹏缺失，在 pRB null/mutant的肿瘤细胞中特异扩增；采用E4-fiber穿梭载体在Fiber的末端及E4区5，端 之间插入至少1个表湖中瘤治疗基因或小干扰RNA的皿元件，同时插入启动子,元件。
本发明的Ad5 El CR2中有24 MS缺失，自缺，列为CTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTT。
本发明的表湖中瘤治疗基因或小千扰RNA的表达元件位于纤维蛋白3'端及E4区3'端之间。
本发明的启动子,元件为双向启动子表达元件。
本发明的重组腺病毒载体为
(1) 用分子量为4000 8000的聚乙二醇化学修饰的重组腺病毒载体。
(2) 腺病毒载体衣壳蛋白的遗ftj彦饰的重组腺病毒载体。
上述的泰逸多个外源基因的Ad5 D24割牛复制型腺病毒载体的构建方法由下述步骤组成
(1) 构建Ad5 E1A^CR2中24个MS缺失的穿梭载体。
(2) 用Ad5 E1A M CR2中24个,缺失的穿梭载体与腺病毒载体骨架按摩尔比3: 1在 ￡ ^J5183中同源重组获得Ad5 E1A M CR2中24个自缺失的腺病毒载体骨架。
(3) 构建,治疗基因或小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体。
(4) 用，治疗基因或小干扰RNA的穿梭载体与Ad5 E1A ^ CR2中24个MS缺失的腺病 毒载体骨架按摩尔比3: 1在￡ 坷5183中同源重组获得表达至少1个治疗基因或小干扰RNA 与治疗基因的Ad5 E1A M CR2中24个自缺失的条件复制型腺病毒载体。
(5) 将线性化的^JiM少1个治疗基因或小干扰RNA的复制型腺病毒载條染HEK293细胞， 扩增、分离、纯化，得到多,Ad5 D24^f牛复制型腺病毒。
本发明的穿梭载体为招可腺病毒载体Fiber的末端及E4区5'端之间插A^达基因或小干 扰RNA的,元件。
表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体与化学治疗药物或生物毒素或单克隆抗 体或细胞表面受体的配体化合物组成复合物。
泰逸多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载皿制备治疗肿瘤药物中的用途。
有效成分表达多个外源基因的Ad5 D24割牛复制型腺病毒载体制备治疗肿瘤药物用常规药用 制剂的形式来1顿。所述的药用常规制齐晗作为活性成分的就多个夕卜源基因的Ad5 D24劍牛复 制型腺病毒载体，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有m^ 机固体鄉体赋形剂混合。
战制剂可按照制剂的常夫紅艺第喊。
5含有敏多个外源基因的Ad5 D24割牛复制型腺病毒载体治疗肿瘤的药物中含有表达多个夕卜 源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体的重量比为0.1% 99. 5%活性成分， 含有重量比为 0.5% 90%的活性成分。
本发明采用斜牛复制型腺病毒载体表超少1个治疗基因或小干扰RNA,在肿瘤疾病治疗中具 有重要价值。本发明表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体经药效i，，证明表达 多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体可提高对肿瘤的治疗效果。
图1是E1A針CR2中24个鹏缺斜牛复第ij型腺病毒载体骨架示意图。 图2是腺病毒E4-fiber穿梭载体示意图。
图3是表ii^荧光蛋白的Ad5 D24条件复制型溶病毒载体示意图。
图4是^i^tfe荧光蛋白的Ad5 D24斜牛复制 病毒载^^肿瘤动,型中实验治疗结果。
图5是表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA (siVEGF)及Arresten的Ad5D24条件 复制型腺病毒载体示意图。
图6是,针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA刻中瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的Ad5 D24 餅复制型腺病毒载体示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。 实施例l
以表iitffe荧光蛋白的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体为例其构建方法步骤如下 1、构建Ad5 E1A^CR2中24个MS缺失的穿梭载体
舰设计两对弓胸，经过重叠聚合,式反应获得含有Ad5 E1A針CR2中24个鹏缺失的 基因片。P1-P4为两对弓l物的序列
PI: ATTMTTAACATCATCMTMTATACCTTATTTTGGATT;
P2: TCCTCGTCGTCACTGGGTGGMTCCAAMTMGGTATATTATTGATGATG;
P3: CCACCCAGTGACGACGAGGATGMGAGGGT GAGGAGTTT;
P4: TACTAGTCCGCTCTCCACAGA TGCATGGCCAG。
聚合酶链式反应扩增条件是94 。C、 2分钟，94 。C、 50秋55 。C、 60秋72 。C、 2分钟，30 个循环。重叠聚合,式反应产物经质量浓度为1. 0%的琼S識电泳后回片段。将聚合,式反应 片段与pGEMT-T easy载体连接。连接^(牛是酶切纯化片段，10XT4连接酶缓冲液，
6酶切载体，0.5WT4连接酶，三蒸水，16。C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5 a细 胞，并涂布于含有100 Pg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 Mg/ml的氨节 青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性,法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克 隆。将所获得阳性克隆命名为pGEffl7Ad5-D24 F。将Ad5-D24 F片段从pGEm7Ad5-D24 F上经Pacl 和Spel双酶切下来，乡，量浓度为1. (m的琼l識电泳纯化后与用Pacl和Spel双酶切处理的腺 病毒E1区穿梭载体进^S接。连接剝牛是酶切纯化片段，1M1 10XT4连接酶缓冲液，M酶 切载体，0. 5W T4连接酶，5. 三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提 粒DNA、酶切 鉴定获得阳性克隆，命名为pAd5 D24 shuttle。此载体为获得的Ad5 E1A ^ CR2中24个 缺 失的穿梭载体。
2、 构建Ad5 E1A M CR2中24个^S缺失的腺病毒载体骨架
将Seal线性化的Ad5 E1A分子CR2中24个,缺失的穿梭载体与CM线性化腺病毒骨架载 体pTG3602/Swal按摩尔比3: 1，共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100 P g/ml的氨 精雾素的LB平板中，16 24小时后，挑取離，接种到扁ug/ml的氨苄青霉素的LB培养液 中，14 16小时后，经碱性裂解法提顿粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克 隆即为Ad5ElA針CR2中24个鹏缺失的腺病毒载体骨架，命名为pAd5-D24/Swal载体。Ad5 E1A ^H1 CR2中24个^S缺失的腺病毒载体骨架见图1。在图1中，黑色加宽部分代表Ad5 E1A ^ CR2中24个,缺失部分。
3、 构建表达^fe荧光蛋白的腺病毒E4-fiber穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨节抗性基因的开放读码读框(ORF)的两端fflil基因突变的方式产 生两个单一的醇切位点(Xbal及SfuI)，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所 获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker (EcoRI Pacl Swal Spel HindIII)连接，所获得的 载体命名为pUCKanEHL。聚合,式反应扩增位于Ad5 E4区3'端上游约2. Okb的片段，基因片 段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得 到的载体称为pshuttle Ad5E4-3'。采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3'端上游约 2. Okb的片段，基因片段两端分别含有Swal与Spel位点。将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3' 载糊应的酶切位点中，所获得的新载鹏为pshuttle Ad5-E4-fiber,如图2所示。在图2中， 在pshuttleAd5-E4-fiber载体的上下游两个基因片段之间插入可以表:ii^fe荧光蛋白基因的表达 元件。这样所得至啲载体即为鋭乡絶荧光蛋白的腺病毒E4-fiber穿梭载体。
4、 构建^ii^录色荧光蛋白的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体用Pad线性化的表ii^ffe荧光蛋白的腺病毒E4-fiber穿梭载体与Swal线性化的Ad5 E1A分 子CR2中24个^S缺失的腺病毒载体骨架按摩尔比3: 1共转化E. coli BJ5183，然后ffiil酶切及 测序获得阳性克隆，所得到的载^^为pAd5-D24-eGFP见图3。图3是表达乡絶荧光蛋白的Ad5 D24 餅复制型腺病毒载体示意图。
5、获得表达食录色荧光蛋白的Ad5 D24条阵复制型腺病毒
采用磷酸钙法将Pacl线性化的表达绿色荧光蛋白的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体 pAd5-D24-eGFP转染HEK 293 Val细胞系。经过7 10天后，可见明显的细胞病变，然后经过离 心收获病毒原液，经过2 3轮的病毒扩增后，进一步将所获得的病毒原液感染10个150cm的细 胞培养平皿，扩增获得足够量的病毒原液用于后续的进一步纯化。感染的病毒的细胞经37'C/酒精 干冰反复冻融3次，3500转/溯离心15 iH+， Mii两次氯化铯密度梯度繊离心纯化，获得纯 化的表达绿色荧光蛋白的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体。将所构建的表达绿色荧光蛋白的 Ad5 D24^^牛复制型腺病驗》嫌内-80。C保存。
实施例2
以,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA和Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病毒 载体为例其构建方法步骤如下
1 、构建Ad5 E1A M CR2中24个M缺失的穿梭载体
构建Ad5 E1A針CR2中24个鹏缺失的穿梭载体的步骤与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的穿梭载体。
2、 构建Ad5 E1A ^H1 CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架
构建Ad5 E1A好CR2中24个鹏缺失的腺病毒载体骨架与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架。
3、 构建表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA和Arresten的腺病毒E4-fiber穿梭载
体
il3l聚合酶链式反应方法扩增U6-siVEGF,元件，聚合酶链式反应扩增^f牛是94 °C、 2 分钟，94 。C、 50执55 。C、 30秋72 。C、 40秋30个循环。聚合酶链式反应产物顿量浓度 为l.(m的琼I離电泳后回收聚合酶链式反应片段。将聚合,式反应片段与pGE肌-Teasy载体 连接。连絲件是2W酶切纯化片段，10 X T4连接酶缓冲液，酶切载体，连 接酶，三蒸水，16X:连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5a细胞，并涂布于含有 100 M/ml的氨^W霉素的LB平板中。挑取^接种到含有100 Pg/ml的氨节青霉素的LB培养
8液中，14 16小时后，经碱性SI 法提M粒DNA，舰酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳 性克隆命名为pGafT/U6- siVEGF。将U6-siVEGF片段从pGBff/U6- siVEGF上经Clal和Notl双酶 切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进1瑰接，连接割牛是酶切纯化片段，M 10 XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，0.5WT4连接酶，三蒸水。连接产物采用同样的方法 转化、提M粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshnttle-Bio-siVEGF。利用聚合M式反 应的方',增Arresten基因，聚合酶链式反应扩增条件94 。C、 5射中，94 。C、 30秋55 。C、 30秒，72'C、 l辦中。{顿伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经电泳纯化 后与pGE肌-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性 克隆命名为pGEffl7Arresten。将Arresten片段从pGEMVArresten上经Xhol和Xbal双酶切下来， 经质量浓度为1.0%的琼月識电泳纯化后与用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-siVEGF进fi^接。 采用同样的方法连接、转化、提,粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达针对血 管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的双向启动子穿梭载体，命名为 pshuttle-Bio-siVEGF/Arresten。将pshuttle-Bio-siVEGF/Arresten经BamHI及Sful双酶切末 端补平后与经Swal酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进fi^接，所获得的阳性克隆为,针对血 管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的腺病毒E4_fiber穿梭载体，此载体命名为 pshuttleAd5_E4-fi ber-s iVEGF/Arresten 。
4、 构建,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的Ad5D24条件复制型腺 病毒载体
构建^i针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的Ad5 D24 ^j牛复制型腺病 毒载体与实施例l相同。获得表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的 Ad5 D24^K牛复制型腺病毒载体，其载体示意图见图5。
5、 获得,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的Ad5D24^f牛复制型腺 病毒
获得表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病 毒的步骤与实施例1相同。将所构建的表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA及Arresten 的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒在&嫌内-80。C保存。
实施例3
以表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA (siHecl)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (Trail)的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体为例其构建方法步骤如下1、 构建Ad5 E1A M CR2中24个MS缺失的穿梭载体
构建Ad5 E1A舒CR2中24个鹏缺失的穿梭载体的步骤与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的穿梭载体。
2、 构建Ad5 E1A 5H1 CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架
构建Ad5 E1A舒CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架。
3、 构建表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA刻中瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的腺病毒 E4-f iber穿梭载体
舰聚合,式反应方法扩增U6-siHecl表达元件，聚合酶链式反应扩增^f牛是94 。C、 2 分钟，94 。C、 50秋55 。C、 30秋72 。C、 40秒，30个循环。重叠聚合酶链式反应产物频量 浓度为1.0%的琼S離电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy 载体驗。i^^鴨2W酶切纯餅段，lrt 10X T4 3S^^g冲液，M酶切载体，0.5WT4连 接酶，5,5)4三蒸水，16'C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5ci细胞，并涂布于含有 100 Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中，挑取離接种到含有100 Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液 中，14 16小时后，经碱性娜、鹏M粒DNA，舰酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克 隆命名为pGM7 U6-siHecl。将U6-siHecl片段从pGEMT/ U6-siHecl上经Clal和Notl双酶切下 来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进1瑰接，连接割牛是2W酶切纯化片段，1W10XT4 连接酶缓冲液，lrt酶切载体，0.5WT4连接酶，三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、 提，粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-siHecl。利用聚合,式反应的方 法扩增TRAIL基因，聚合,式反应扩增条件94°C、 5射中，94 。C、 30秋55 。C、 30秒，72 °C、 1分钟。使用伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经电泳纯化后与 pGafT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆 命名为pGB/TT/TRAIL。将TRAIL片段从pGEfflV TRAIL上经XhoI和XbaI双酶切下来，经质量浓度 为1. d的琼月識电泳纯化后与用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-siHecl进4瑰接。采用同样的 方法连接、转化、提3XM粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达针对癌症高表达蛋 白的小干扰RNA及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的双向启动子穿梭载体，命名为 pshuttle-Bio-siHecl/TRAIL。将pshuttle-Bio-siHecl/ TRAIL经BamHI及Sful双酶切末端补平 后与经Swal酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进fi^接，所获得的阳性克隆为，针对癌症高表 达蛋白的小干扰RNA刻中瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的腺病毒E4-fiber穿梭载体,此载体命
10名为pshuttleAd5-E4-fiber- siHecl/ TRAIL。
4、 构建表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的 Ad5 D24餅复制型腺病毒载体
构建，针对癌症高,蛋白的小干扰RNA及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的Ad5 D24 斜牛复制型腺病毒载体与实施例1相同。获得駄针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA^中瘤坏死 因子相关的凋亡诱导配体的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体，其载体示意图见图6。
5、 获得表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的 Ad5 D24餅复制型腺病毒
获得表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的Ad5 D24 割牛复制型腺病毒的步骤与实施例1相同。将所构建的,针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA和 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的Ad5 D24条件复制型腺病毒载 }*||内-8(TC保存。
实施例4
以,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体为例其构 建方法步骤如下
1 、构建Ad5 E1A ^ CR2中24个g^缺失的穿梭载体
构建Ad5 E1A肝CR2中24个鹏缺失的穿梭载体的步骤与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的穿梭载体。
2、 构建Ad5 E1A^CR2中24个^S缺失的腺病毒载体骨架
构建Ad5 E1A肝CR2中24个鹏缺失的腺病毒载体骨架与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个MS缺失的腺病毒载体骨架。
3、 构建皿针X寸血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体 Mi^聚合酶链式反应力法扩增U6-siVEGF表达元件，聚合酶链式反应扩增斜牛是94 °C、 2
分钟，94 。C、 50秋55 。C、 30秋72 。C、 40秒，30个循环。重叠聚合^^反应产物魏 量浓度为1. (m的琼脂糖电泳后回收聚合,式反应片段。将聚合,式反应片段与pGEMT-T easy 载体连接。连接^f牛是2ri酶切纯化片段，1W10XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，0.5M1T4 连接酶，5.5W三蒸水，16'C连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5a细胞，并涂布于含 有100 w/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 Pg/ml的氨节青霉素的LB培 养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得 阳性克隆命名为pGMT/U6-siVEGF。将U6-siVEGF片段从pGEM7U6-siVEGF上经Clal和Notl双酶切鄉补平后与经Swal酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进4话接，连接割牛是酶切纯化 片段，mi 10XT4连接酶缓冲液，酶切载体，T4连接酶，三蒸水。连接产物 采用同样的方法转化、提取质粒DNA 、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为 pshuttleAd5-E4-fiber-siVEGF。所获得的载体为,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的 腺病毒E4-f iber穿梭载体，命名为pshuttleAd5-E4_f iber-siVEGF。4、 构建,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体 构建表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体与实施例1相同。获得,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5D24条件复制型腺病毒载体。5、 获得表达针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺病毒 获得,针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺病毒的步骤与实施例1相同。将所构建的，针对血管内皮细胞生长因子的小干扰RNA的Ad5 D24条件复制型腺 病毒载,^H内-8(TC保存。 实施5以,Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体为例其构建方法步骤如下 1 、构建Ad5 E1A CR2中24个 缺失的穿梭载体构建Ad5 E1A肝CR2中24个鹏缺失的穿梭载体的步骤与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个 缺失的穿梭载体。2、 构建Ad5 E1A^CR2中24个自缺失的腺病毒载体骨架构建Ad5 E1A OT CR2中24个鹏缺失的腺病毒载体骨架与实施例1相同，获得Ad5 E1A分 子CR2中24个^S缺失的腺病毒载体骨架。3、 构建Arresten的腺病毒E4-fiber穿梭载体利用聚合K^反应的方、 iT增Arresten基因，聚合酶链式反应扩增斜牛94°C、 5併中， 94 。C、 30秋55 。C 、 30秒，72 。C、 1併中。《顿伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收 获DNA，经电泳纯化后与pGEMr-easy载体相连接，连接条件是酶切纯化片段，10X T4 连接麟冲液，酶切载体，0.T4连接酶，5. 三蒸水，16。C连接过夜，将连接产物转 化感受态的DH5a细胞，并涂布于含有100Mg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取麟接种到含 有100Mg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA， ffi3i酶 切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Arresten。将Arresten片段从 pGEmVArresten上经Xhol和Xbal自切^补平后与经Swal酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体酶切纯化片段，1W10X T4连接酶缓冲液，114酶切载体， 连接酶，5.5)4三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为pshuttleAd5-E4-f iber-Arresten。4、 构建,Arresten的Ad5 D24 ^f牛复制型腺病毒载体构建表达Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体与实施例l相同。获得表达Arresten的 Ad5 D24餅复制型腺病毒载体。5、 获得,Arresten的Ad5 D24^f牛复制型腺病毒获得表达Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病毒的步骤与实施例1相同。所构建的表达 Arresten的Ad5 D24条件复制型腺病毒载#^/嫌内-80。C保存。为了验证本发明的有益效果，发明A^用本发明实施例1构建的绿色荧光蛋白的Ad5 D24条 件复制型腺病毒载体进行了药效微，i微瞎况如下1、 ^M驗瘤动鹏型采用U87MG细胞，TO数生长期细胞，乡彌酶消化，离心后， 清、无双抗、无谷氨鹏 的DMEM培#^悬浮，制备7. 5X 106/mL的细胞悬液。选用12只8周龄BALB/C雌性裸鼠，裸鼠用 乙醚ltA麻醉，每只右后肢上部皮下注射200 ML的7.5X 107mL的细脱悬液，U87MG细胞注射量 为1.5X1()6个细胞，在接种7天后均可见肿块不同大小的肿瘤生长。接种U87MG细胞12天后，待 肿瘤^ 、达至哟40咖3时，^te胶质瘤动鹏型。ffi5l肿瘤内病毒的注射进行肿瘤治疗研究。2、 药效i^将12只裸鼠模型随机分成2组，每组6只。裸鼠用乙醚吸入麻醉，根据分组注射纟絶荧光蛋 白的Ad5 D24条件复制型,腺病毒以及对照组Ad5 CMV eGFP病毒的腺病毒原液。每只裸鼠注射 病毒量均为2X109 PFU，每两天重复注射l次，共4次，每次剂量为5X1()SPFU。开始治疗后 每2天测劐中瘤#^只1次，统计^IR变化趋势并^^肿瘤生长曲线，测量31天肿瘤体积。并用统 计软件SPSS13.0中的One-Way ANOVA进行差异性分析。实验结果见图4。由图4可见，与对照组相比，表达卖絶荧光蛋白的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载体可以明显 提高实验动物的生存期，具有明显的抛中瘤治疗效果。核苷酸序列核苷,列表 〈110〉陕西师范大学〈120〉表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体及其构建方法和应用 〈160> 1〈210〉 1 <211> 24 <212> DNA 〈213〉All病毒 <220><221> misc—recomb 〈400〉 1CTTAC CTGCC ACGAG GCTGG CTTT 1 6 11 16 21 2权利要求
1、一种表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体，其特征在于重组腺病毒载体中Ad5 E1 CR2中有24碱基缺失，在pRB null/mutant的肿瘤细胞中特异扩增；采用E4-fiber穿梭载体在Fiber的末端及E4区5’端之间插入至少1个表达肿瘤治疗基因或小干扰RNA的表达元件，同时插入启动子表达元件。
2、 按照权利要求1戶脱的表达多个外源基因的Ad5 D24 ^f牛复制型腺病毒载体，其特征在于: 所说的Ad5 El CR2中有24 5tS缺失，^S缺，列为CTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTT。
3、 按照权利要求1所述的表达多个外源基因的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载体，其特征在于: 所说的表达肿瘤治疗基因或小干扰RNA的表达元《帷于纤维蛋白3'端及E4区3'端之间。
4、 按照权利要求1戶脱的表达多个外源基因的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载体，其特征在于 所说的启动子表达元件为双向启动子表达元件。
5、 按照权利要求l所述的表达多个夕卜源基因的Ad5D24^[牛复制型腺病毒载体，其特征在于 所说的重组腺病毒载体为(1) 用分子量为4000 8000的聚乙二醇化学{,的重组腺病毒载体；(2) 腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰的重组腺病毒载体。
6、 一种权禾腰求l表达多个外源基因的Ad5D24割牛复制型腺病毒载体的构建方法，其特征 在于它是由下述步骤组成(1) 构建Ad5 E1A分子CR2中24个M缺失的穿梭载体；(2) 用Ad5 E1A M CR2中24个,缺失的穿梭载体与腺病毒载体骨架按摩尔比3: 1在 ^ coA'历5183中同源重组获得Ad5 E1A肝CR2中24个MS缺失的J^病毒载体骨架；(3) 构建,治疗基因或小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体；(4) 用表达治疗基因或小干扰RNA的穿梭载体与Ad5 E1A ^ CR2中24个 缺失的腺病 毒载体骨架按摩尔比3: 1在f. co7j'幼5183中同源重组获得表达至少1个治疗基因或小干扰RNA 与治疗基因的Ad5 E1A ^H1 CR2中24个MS缺失的^(牛复制型腺病毒载体；(5) 将线性化的就至少1个治疗基因或小干扰RNA的复制型腺病毒载條染HEK293细胞， 扩增、分离、纯化，得到多表达Ad5D24^^牛复制型腺病毒，将所构建的表达多个外源基因的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载,^ll内-8(TC保存。
7、 按照权利要求6 0M的表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体的构建方法， 其特征在于所说的穿梭载体为ttf可腺病毒载体Fiber的末端及E4区5'端之间插A^达基因或 小干扰RNA的表达元件。
8、 一种药物组，，含有权利要求l 5表达多个外源基因的Ad5 D24斜牛复制型腺病毒载 体与化学治疗药物或生物毒素或单克隆抗体或细胞表面受体的配体化合物组成复^j。
9、 权利要求1表达多个外源基因的Ad5 D24割牛复制型腺病毒载條审恪治疗肿瘤药物中的 用途。
全文摘要
一种表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体，重组腺病毒载体中Ad5 E1 CR2中有24bp碱基缺失，在pRB null/mutant的肿瘤细胞中特异扩增；采用E4-fiber穿梭载体在Fiber的末端及E4区5’端之间插入至少1个表达肿瘤治疗基因或小干扰RNA的表达元件，同时插入启动子表达元件。其构建方法为构建Ad5 E1A分子CR2中24个碱基缺失的穿梭载体；构建Ad5 E1A分子CR2中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架；构建表达治疗基因或小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体构建表达治疗基因或小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体；构建表达至少1个治疗基因或小干扰RNA与治疗基因的Ad5 E1A分子CR2中24个碱基缺失的条件复制型腺病毒载体；表达多个外源基因的Ad5 D24条件复制型腺病毒载体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
文档编号C12N15/861GK101649328SQ20091002384
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者冯真真, 刘世海, 夏海滨, 孙晓聪, 婧 李, 王东阳, 郑晓晶 申请人:陕西师范大学