专利名称：一种检测革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的检测方法。
背景技术：
许多海洋细菌聚集在一个很小的微环境中，并达到很高的密度从而展现出特定的生理性 状，艮卩群体感应现象(Quorum sensing, QS) (Fuqua W C , et al. Journal of Bacteriology, 176(2): 269-275, 1994)。研究发现革兰氏阴性菌通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯类 (N-acyl-homoserine lactones, AHLs)化合物来调控与食品腐败、动植物致病性等有关的许 多特定的生理性状的表达，如蛋白酶活性、致病因子的表达、生物膜的形成等(WhiteheadNA， et al. FEMS Microbiology Reviews, 25: 364-404,2001)。
近几年群体感应抑制成了人们研究的另一个热点。通过群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitor, QSI)使致病细菌、腐败细菌中由QS系统所调控的生理特性不表达或者表达水平 下降，开创新的食品防腐保鲜技术及新药开发途径。其中利用AHL类似物是研究群体感应抑 制的一个非常重要的方式。发现最早同时也是研究最广泛的是由海洋红藻("Wi^朋 pWc力rs)产生的卤化呋喃酮，该化合物能够抑制K /Ysc力eri和K力ar^KJ'的生物发光、 5". h》"efa"e/w的浮游、￡ car"orara胞外酶的产生以及减弱铜绿假单胞菌的致病力等 (Manefield M， et al. Microbiology, 145:283 - 291, 1999; Manefield M， et al. FEMS Microbiology Letters, 205 (1): 131-138， 2001; Hentzer M， et al. The EMBO Journal, 22(15): 3803-3815, 2003)。因此，QSI化合物在医疗、食品防腐等领域都具有非常广泛的应用价值。 建立筛选群体感应抑制剂的方法对研究群体感应抑制是非常重要的。
紫色杆菌(C/ 7^ 063ctei^'鹏w'oZ3ce咖J通过产生C6-HSL以群体感应方式来调控紫色 色素的产生，而细菌生物感应器紫色杆菌CV026是AHL功能基因的突变体，不产生AHL，也 不能产生紫色，但是有外源的AHL存在的条件下，恢复产生紫色的能力。发明人前期研究发 现，当有QSI化合物存在的条件下，该化合物会阻断CV026群体感应系统，即便是有外源AHL 存在时，也不能恢复产生紫色(綦国红，等.中国农业科学，40(7): 1486-1491， 2007)
发明内容
本发明公开了一种检测微生物是否产生群体感应抑制剂的方法。本发明使用细菌生物感 应器紫色杆菌(C/ rM7^acz^ri咖w'Wace咖)CV026和其敏感的信号分子己酰基高丝氨酸内 酯(C6-HSL)对微生物进行检测，以筛选能产生革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的微生物。
本发明具体方法如下
使用细菌生物感应器紫色杆菌CV026和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，将被检测微生物 进行以下任一项方法的检测
1) 将被检测微生物在含有1.5X1 (T6mol/L~2.5XI(T6mol/L (优选2X l(T6mol/L)的己酰 基高丝氨酸内酯的LB固体平板上划条接种后，培养24h 48h，再将紫色杆菌CV026平行于 被检测微生物划条后继续培养24h 48h，观察现象即可判断，如果紫色杆菌CV026呈现紫色 变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象， 则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；
2) 将被检测微生物在LB固体平板的中央划条，培养24h 48h，紫色杆菌CV026培养 16 h~24 h，与LB琼脂培养基混合，并添加己酰基高丝氨酸内酯至1.5 X 10—6 mol/L~2.5 X l(T6 mol/L (优选2X10^mol/L)，混匀后迅速覆盖在LB固体平板的上面，继续培养24h~48 h， 观察现象即可判断，如果在被检测微生物周围的紫色杆菌CV026呈现紫色变浅或褪去的现 象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生 物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；
3) 被检测微生物培养后，对培养上清液进行提取后获得提取物，将提取物点样于C18 反相薄层板上，充分展开后，把含有紫色杆菌CV026和1.5X10-6mol/L~2,5X10-6mol/L (优 选2X10—6mol/L)己酰基高丝氨酸内酯的琼脂LB培养基铺于C18反相薄层板上，培养 24h 48h，观察现象即可判断，如果在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，则被 检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生 革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。
其中3)中被检测微生物培养所用的LB培养基含有胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯 化钠1%，余量为水。
其中3)中对培养上清液进行提取的方法包括将培养液6000 8000rpm, 4 5。C条件离心， 取上清，用等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，溶 于甲醇中，-20°〇保存。
上述三种试验任选一种即可进行检测，筛选出待测微生物是否产生群体感应抑制剂。 为了确保实验的准确性，可以采用产生紫色杆菌CV026 QSI化合物的铜绿假单胞菌 /^e"ofe膨朋s aei-收i/7oss PAO-1为阳性对照菌株，以不产生AHL分子及QSI化合物的大肠杆菌&c力eric力ia cWi JM109为阴性对照菌株。 检测的培养温度优选为25~28°C。 本发明的有益效果如下
1、 本方法简单、易得，不需要昂贵的硬件设备，检测目标明确，检测样品不需要纯化。克服 了 HPLC/MS检测QSI需要特定的硬件设备、检测目标不明确以及需对样品纯化等缺点。
2、 本方法成本低廉，获得结果迅速，可用于大规模的QSI化合物的筛选。
3、 本方法可用于微生物产生QSI化合物的的大量筛选，对筛选到的目标样品，通过薄层层析 的方法进一步确证。由于目标样品中的化合物经薄层层析分离后，避免了由于检测对象产生 抗菌物质抑制细菌生物感应器的生长所至的假阳性结果，还可以根据所产生的斑点的Rf值等 获取该化合物的一些定性信息。
具体实施例方式
实施例1
对荧光假单胞菌所产生的QSI化合物进行检测，具体操作如下
首先，阳性对照菌株铜绿假单胞菌PA0-1、紫色杆菌CV026、被检测菌荧光假单胞菌，用 LB培养基(蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%)在25r条件下，150rpm振荡活化两次后 备用。活化紫色杆菌CV026所使用的LB培养基中添加卡那霉素至20 !ig/ml。阴性对照菌株大 肠杆菌JM109在LB培养基中37'C条件下，150rpm振荡活化两次后备用。进行如下试验
1、 在含有O. 8M琼脂的LB培养基(胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5V氯化钠1%)中加入信号分 子C6-HSL至2Xl(Tmol/L，倾注平板，凝固后，将活化好的被检测菌荧光假单胞菌在LB平板 上划条，无菌风吹干，培养24h后，再将紫色杆菌CV026与LB平板上的荧光假单胞菌平行划条， 紫色杆菌CV026与被检测微生物平行划条的距离在lcm以下。无菌风吹干后，继续培养24h。 铜绿假单胞菌PAO-l为阳性对照菌株，大肠杆菌JM109为阴性对照菌株，以与被检测菌同样的 方法划条、培养。与被检测菌平行划条后共同培养的紫色杆菌CV026所产生的紫色变淡甚至褪 去，判断荧光假单胞菌产生QSI类化合物。
2、 将荧光假单胞菌的培养物在LB平板(胰蛋白胨P/。，酵母提取物O. 5%，氯化钠1%，琼脂O. 8%) 的中央划条，无菌风吹干后，培养24h。将紫色杆菌CV026的LB培养物与温度在46'C 5(TC且 含有0.8%~1.0%琼脂的1^培养基混合，并添加信号分子C6-HSL至2X l(T6mol/L，充分混合后 迅速覆盖在LB平板的上面，继续培养24h。铜绿假单胞菌PA0-l为阳性对照菌株，大肠杆菌JM109 为阴性对照菌株。用与被检测菌同样的方法进行处理。根据平板中央荧光假单胞菌所在位置 的紫色杆菌CV026所产生的紫色变淡甚至褪去判断该荧光假单胞菌产生QSI类化合物。3、被检测菌荧光假单胞菌在LB培养基中25。C,150rpm振荡培养24h， 4 5。C离心，取上清用 等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，溶于甲醇中， -20汇保存备用。2-5 ^L提取液点样于C18反相薄层板上，甲醇/水(60:40,V/V)充分展开后，无 菌风吹干，将紫色杆菌CVO26的LB培养物与46。C 50。C含有0.8。/。 1.0。/。琼脂的LB培养基混合， 并添加信号分子C6-HSL至2X10—6mol/L，充分混合后立即铺于C18反相薄层板上，凝固后，置 于消毒的密闭容器中25 28'C培养48h。铜绿假单胞菌PA0-1的乙酸乙酯的提取液作阳性对照， C6-HSL为阴性对照。根据在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，判断被检测菌产生 QSI。根据所产生斑点的Rf值可初步判断该QSI化合物为C12-HSL或3-oxo-C14-HSL。
本实施例利用三个试验来检测荧光假单胞菌，试验结果表明，三种试验方法均检测出荧 光假单胞菌可产生QSI。
权利要求
1、一种革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂的检测方法，其特征是使用细菌生物感应器紫色杆菌CVO26和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，将被检测微生物进行以下任一项方法的检测1)将被检测微生物在含有1.5×10-6mol/L～2.5×10-6mol/L的己酰基高丝氨酸内酯的LB固体平板上划条接种后，培养24h～48h，再将紫色杆菌CVO26平行于被检测微生物划条后继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；2)将被检测微生物在LB固体平板的中央划条，培养24h～48h，紫色杆菌CVO26培养16h～24h，与LB琼脂培养基混合，并添加己酰基高丝氨酸内酯至1.5×10-6mol/L～2.5×10-6mol/L，混匀后迅速覆盖在LB固体平板的上面，继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在被检测微生物周围的紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；3)被检测微生物培养后，对培养上清液进行提取后获得提取物，将提取物点样于C18反相薄层板上，充分展开后，把含有紫色杆菌CVO26和1.5×10-6mol/L～2.5×10-6mol/L己酰基高丝氨酸内酯的琼脂LB培养基铺于C18反相薄层板上，培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。
2、 权利要求l的检测方法，其中3)中被检测微生物培养所用LB培养基含有胰蛋白胨1%、 酵母提取物0.5%、氯化钠1%，余量为水。
3、 权利要求l的检测方法，其中3)中对培养上清液进行提取的方法包括将培养液6000 8000rpm 4 5。C条件离心，取上清，用等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪 蒸干溶剂后，溶于甲醇中，-2(TC保存。
4、 权利要求l的检测方法，其中己酰基高丝氨酸内酯的浓度是2Xl(^mol/L。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的检测方法。其特征是使用细菌生物感应器紫色杆菌CVO26和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，采用肉眼观察即可检测出待检微生物是否产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。本发明的检测方法简单、快速。
文档编号C12Q1/04GK101503730SQ200910025868
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者博 李, 杨志萍, 王岁楼, 綦国红, 董明盛, 陈贵堂 申请人:中国药科大学