一种链霉菌及其应用的制作方法

文档序号:608730阅读:501来源:国知局

专利名称::一种链霉菌及其应用的制作方法
技术领域
:本发明涉及一种新型微生物及其应用,尤其涉及一种链霉菌及其在制备喷司他汀中的应用。
背景技术
:喷司他丁是拟嘌呤类的抗代谢药,其抗肿瘤作用是通过抑制体内的腺苷脱氨酶(ADA)来实现的。ADA是一种参与嘌呤救援代谢途径的酶,催化细胞内的腺苷和脱氧腺苷进行不可逆的脱氨基,从而控制细胞内的腺苷水平。喷司他丁抑制了ADA的活性,结果使细胞内脱氧腺苷和5'-三磷酸脱氧腺苷(dATP)大量积累,而dATP的积累将最终导致细胞的死亡,这一过程可能与DNA或RNA的合成受到抑制有关。喷司他丁的适应症为1、干细胞白血病(hairycellleukemia,HCL);2、慢性淋巴细胞白血病;3、蕈样霉菌病。喷司他丁为白色结晶,最早由Woo等在1974年从Str印tomycesantiboticus培养液中分离得到。以这种方法获得喷司他丁发酵单位低,无法产业化。
发明内容本发明的目的是针对上述问题,提供一种高单位的喷司他汀产生菌。本发明的另一个目的是提供该菌种在制备喷司他汀中的应用。本发明的目的是通过下列技术措施实现的—种链霉菌SW0701,分类命名为链霉菌Str印tomycessp.SW0701,已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC),保藏号为CCTCCM208263,保藏日期为2008年12月26日。所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株是从杭州临安大明山筛选得到的。所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株的菌落特征菌落形态是在所用的固体培养基中菌株的气生菌丝和基内菌丝发育良好,孢子丝大部分弯曲,环状,偶见直或松散螺旋形,孢子链长度10-20个,孢子圆柱状或椭圆形,孢子大小0.9-1.3X0.8-0.9um,孢子外壁光滑。根据微生物形态学及国外相关资料的描述,结合保藏号为CCTCCM208263的菌株的各种培养特征和形态特征,该保藏号为CCTCCM208263的菌株应属于链霉菌属,定名为Str印tomycessp.SW0701。所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株可应用于发酵制备喷司他汀。该制备方法包括下列步骤a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCM208263的菌株;b、按常规方法制备的斜面茄子瓶,挖取斜面菌苔接入摇瓶种子培养基,150280rpm,培养3055左右小时,得摇瓶种子液;将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.11.0%的接种量接种于种子罐,120220rpm,培养2040h,得罐种子;将罐种子液按发酵培养基体积515%的接种量接种于发酵罐培养基,120200rpm,发酵培养90140小时,收集发酵液;其中培养温度均为2635°C。其中,斜面培养基各组份在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.33.Og,氮源0.12.6g,琼脂为1.22.5g;摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.54.5g,氮源0.35g,无机盐00.3g,其余为水;种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源27.5g,氮源1.08.5g,无机盐01.5g,其余为水;发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源28g,氮源1.58.5g,无机盐01.8g,氨基酸00.4g,其余为水。其中所述的培养基各组分在培养基中比例优选为斜面培养基各组份在培养基中按重量体积比(g/ml)计,碳源0.61.3g,氮源0.20.9g,琼脂为1.41.8g;摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.62.5g,氮源0.52.5g,无机盐00.3g,其余为水;种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源2.56g,氮源1.56.2g,无机盐0.20.3g,其余为水;发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源2.56.5g,氮源2.56.5g,无机盐0.30.5g,氨基酸00.2g,其余为水。其中所述的碳源选自淀粉(如玉米淀粉)、淀粉水解糖、糊精、甘油、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁、麦芽汁、豆汁、豆油、棉籽油、土豆浸出粉、燕麦片中的一种或几种;所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸出物、黄豆粉、棉子粉、氨水、蚕蛹粉、硝酸盐、酪蛋白水解物中的几种,无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钙中的一种或几种;氨基酸为L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。其中所述的培养基优选为碳源为淀粉、糊精、甘油、豆油、棉籽油、麦芽糖中的一种或几种;氮源为黄豆粉、玉米浆、酵母粉、蚕蛹粉中的一种或几种;无机盐为氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾中的一种或几种;氨基酸为L-赖氨酸、卜酪氨酸中的一种或几种。本发明所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株是目前分离到的一种天然高单位的喷司他汀产生菌,发酵性能优良,可用于大规模生产。发酵过程是喷司他汀生产的重要环节,其发酵水平与工艺优劣直接相关,本发明提供的发酵工艺经过摇瓶、2吨和10吨发酵罐中进行试验,其生产能力稳定,从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发酵副产物相对较少,并降低了后提取的难度,在应用于工业化生产上具有优势。菌株保藏情况保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号为CCTCCM208263,分类命名为链霉菌Str印tomycesantiboticusSW0701。保藏日期为2008年12月26日。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。实施例1:保藏号为CCTCCM208263的菌株的培养特征将保藏号为CCTCCM208263的菌株接种于高氏一号、葡萄糖天门冬素等用于观察形态特征的培养基。2『C培养一定的时间5、7、10天,观察并进行描述。保藏号为CCTCCM208263的菌株在各种培养基上的菌落特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2:生理生化特征生理生化性质采用链霉菌分类中的标准方法。保藏号为CCTCCM208263的菌株的生理生化反应为在明胶培养基上能液化明胶,胨化牛奶,能凝固牛奶,淀粉水解阳性,不利用纤维素,硝酸盐还原阳性。实施例3:碳源利用采用国际链霉菌计划(ISP)所推荐的方法,碳源利用实验以ISP9为基础培养基,2『C培养37天,观察菌株对各种所试的碳源的利用情况。保藏号为CCTCCM208263的菌株生长时,能很好利用鼠李糖、甘油、葡萄糖、棉籽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇,不利用柠檬酸钠、酒石酸钾钠、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖。实施例4:发酵培养制备喷司他丁1.斜面培养培养基麦芽糖O.3g,甘油lg,酪蛋白水解物(Caseinhydrolystae)0.3g,酵母粉0.3g,琼脂1.8g,水100ml,pH自然。培养方法菌株接种于固体培养基斜面上,28。C培养7-10天。2.摇瓶种子培养培养基葡萄糖lg,玉米浆0.2g,黄豆粉2.2g,酵母粉0.3g,水100ml。装量500ml三角瓶装100ml培养基接种量从斜面挖块约1*0.5cm2接入种子瓶中培养温度30。C培养时间55h摇床转速180rpm3.种子罐种子培养培养基葡萄糖500g,棉籽油375g,玉米淀粉500g,酵母粉1125g,黄豆粉1750g,蛋白胨125g,碳酸钙175g,水50L装量100L种子罐内装培养基50L,121。C灭菌30min。接种量0.5L摇瓶种子液工艺控制罐压0.040.05MPa搅拌速度140rpm通气量l:0.5(V/V)温度30士rc周期26h4.发酵培养培养基麦芽糖30kg,棉籽油7.5kg,玉米淀粉30kg,酵母粉4.5kg,黄豆粉15kg,蚕蛹水解物3kg,L-酪氨酸2.5kg,碳酸钙3.5kg,水1吨装量2吨发酵罐内装培养基1吨接种量50L的种子液工艺控制罐压0.020.03MPa搅拌速度180rpm通气量l:1.5(V/V)温度27士rC周期90小时按照上述发酵条件和工艺,在2吨发酵罐进行3批发酵试验,都能产生喷司他汀,发酵情况稳定。实施例5:发酵培养制备喷司他丁1.固体培养基葡萄糖lg,酪蛋白水解物0.3g,酵母粉0.3g,琼脂1.5g,水100ml,pH自然固体培养菌株接种于固体培养基斜面上,28°C培养7-10天。2.摇瓶种子培养培养基葡萄糖2.5g,酪蛋白水解物(Caseinhydrolystae)0.3g,酵母浸出粉0.3g,(NH4)2S040.lg,尿素O.15g,pH自然,水100ml。装量500ml三角瓶装100ml培养基接种量0.5%的孢子悬液培养温度28°C培养时间35h摇床转速270rpm3.种子罐种子培养培养基葡萄糖14kg,甘油8.75kg,豆油8.75kg,黄豆粉5.25kg,酵母粉8.75kg,玉米浆8.75kg,水350L装量700L种子罐装350L培养基,121。C灭菌30min。接种量1L摇瓶种子液培养温度27士rC培养时间28h搅拌160rpm4.发酵培养培养基葡萄糖100kg,棉籽油12.5kg,玉米淀粉50kg,酵母粉12.5kg,黄豆粉175kg,鱼胨112.5kg,碳酸f丐17.5kg,水5吨装量10吨发酵罐内装培养基5吨接种量350L的种子液工艺控制罐压0.020.03MPa搅拌速度130rpm通气量l:1.2(V/V)温度27士rC周期140小时按照上述发酵条件和工艺,在10吨发酵罐进行3批发酵试验,都能产生喷司他汀,发酵情况稳定。将发酵液过滤、提取,最终获得喷司他丁。权利要求一种菌株Streptomycessp.SW0701,由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCM208263,保藏日期为2008年12月26日。2.如权利要求1所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用。3.如权利要求2所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用,其特征是该制备方法包括下列步骤a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCM208263的菌株;b.按常规方法制备的斜面茄子瓶,挖取斜面菌苔接入摇瓶种子培养基,150280rpm,培养30-55小时,得摇瓶种子液;将摇瓶种子液按种子罐培养基体积`0.11.0%的接种量接种于种子罐,120220rpm,培养20-40h,得罐种子;将罐种子液按发酵培养基体积515%的接种量接种于发酵罐培养基,120200rpm,发酵培养90140小时,收集发酵液;其中培养温度均为2635°C。4.如权利要求3所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用,其特征是所述的斜面培养基各组份在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.33.Og,氮源0.12.6g,琼脂为1.22.5g;所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.54.5g,氮源0.35g,无机盐00.3g,其余为水;所述的种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源27.5g,氮源1.08.5g,无机盐01.5g,其余为水;所述的发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源28g,氮源`1.58.5g,无机盐01.8g,氨基酸00.4g,其余为水。5.如权利要求4所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用,其特征是所述的斜面培养基各组份在培养基中按重量体积比(g/ml)计,碳源0.61.3g,氮源0.20.9g,琼脂为1.41.8g;所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源0.6`2.5g,氮源0.52.5g,无机盐00.3g,其余为水;所述的种子罐培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源2.56g,氮源1.56.2g,无机盐0.20.3g,其余为水;所述的发酵培养基各组分在培养基中的比例为每100ml培养基中,碳源2.56.5g,氮源2.56.5g,无机盐0.30.5g,氨基酸00.2g,其余为水。6.根据权利要求4或5所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用,其特征是所述的碳源选自淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、葡萄糖、麦芽糖、土豆汁、麦芽汁、豆汁、豆油、棉籽油、土豆浸出粉、燕麦片中的一种或几种;所述的氮源选自黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨、鱼胨、蚕蛹水解液、尿素、硫酸铵、酵母粉、酵母浸出物、黄豆粉、棉子粉、氨水、蚕蛹粉、硝酸盐、酪蛋白水解物中的一种或几种;所述的无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钙中的一种或几种;所述的氨基酸为L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸中的一种或几种。7.根据权利要求6所述的保藏号为CCTCCM208263的菌株在发酵制备喷司他汀中的应用,其特征是所述的碳源为淀粉、糊精、甘油、豆油、棉籽油、麦芽糖中的一种或几种;所述的氮源为黄豆粉、玉米浆、酵母粉、蚕蛹粉中的一种或几种;所述的无机盐为氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾中的一种或几种;所述的氨基酸为L-赖氨酸、L-酪氨酸中的一种或几种。全文摘要本发明公开了一种链霉菌及其应用,该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCCNO.M208263,保藏日期为2008年12月26日。本发明还公开了一种用此菌株发酵制备喷司他丁的方法。本发明提供的发酵工艺经过10吨发酵罐试验,其生产能力稳,发酵单位高且发酵副产物相对较少,降低了后提取的难度,适宜于工业化大生产。文档编号C12R1/465GK101792722SQ20091002859公开日2010年8月4日申请日期2009年2月4日优先权日2009年2月4日发明者朱健,谢祥茂,陈俊勇,陈晓霞申请人:杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司
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