专利名称：：一株枯草芽孢杆菌及其在生物除臭剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于环保领域，涉及一株新的枯草芽孢杆菌及其在生物除臭剂中的应用。
背景技术：
：恶臭，是一种发生源众多，污染面积广的感觉公害。它不仅使人感到不快和厌恶，而且臭气中的不少物质直接危害人体健康。为此，自20世纪60年代开始逐渐引起了国内外环境科技工作者的重视和关注，并取得了多方面的成果。日本1971年颁布了《恶臭防治法》，美国1971年颁布了《清洁空气法》，德国1993年在《环境大气中有关臭气的指令》中规定了臭气的频度、臭气时间测定方法。我国对臭气污染的研究起步较晚，参考日本经验，与1994年1月15日和2003年7月1日起分别实施了《恶臭污染物排放标准》(GB1455421993)和《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB1891822001)，对臭气浓度，及8种臭气物质，即氨、三甲胺、硫化物、甲硫醚、二甲二硫、二硫化碳、苯乙烯，并对其测定方法也做出了具体的规定。恶臭物质很多，目前大气中检出的物质可分8类，即1、硫化物2、脂肪胺；3、烃类；4、羰基化合物；5、醇类；6、酚类；7、低级脂肪酸;8、刚哚共147种气体。现阶段，全球恶臭污染的处理方法主要有洗气、法、臭氧氧化法、直接燃烧法、吸附法、氧化处理法、空气氧化法、掩蔽法、空气稀释法、酸碱洗涤法、生物化学分解法。而目前市场上已有的除臭剂主要有化学除臭剂和植物除臭齐二植物除臭剂提取工艺复杂，生产成本较高；化学除臭剂除成本较高外还可能造成二次污染。因此成本低廉，工艺简单，使用环保的生物除臭剂成为了科研人员关注和研发的热点。但是目前市场上出现的所有生物除臭剂均存在着只能降解硫化物(如硫化氢)和氨，对有机物(总烃)降解能力弱的缺陷。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1。本发明的另一目的是提供该枯草芽孢杆菌在制备生物除臭剂中的用。本发明的目的可以通过以下措施达到本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1是从采自多种生态环境下的样品中筛选得到的。先用无菌水溶解并稀释样品，按10%接种量接种于筛选培养基中30'C培养(以未接种样品的筛选培养基为空白对照)，在3天后嗅辩接种了各样品的筛选培养基的恶臭程度(判断标准见表l)，判断各样品的除臭效果。选取除臭效果为"+++"的样品，通过稀释平板法在营养肉汤琼脂培养基、高氏1号琼脂培养基及麦芽汁琼脂培养基上分离出单菌落并续代保藏备用。然后挑取分离出的单菌落接种于筛选培养基中3(TC培养(以未接种被选微生物的筛选培养基为空白对照)，3天后嗅辩接种了各微生物的筛选培养基的恶臭程度(判断标准见表l),判断各微生物的除臭效果，选取除臭效果为"+++"的菌株进入复筛。挑取备选菌种的单菌落液体培养后采用液体稀释法进行复筛,挑取氨气、硫化氢、总烃去除率最高的一株，按《伯杰细菌鉴定手册》第八版鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-Al。将该枯草芽孢杆菌(BacillussubtiUs)HF-A1在营养肉汤琼脂培养基中传代50代(培养条件30'C，72h/代)，其形态特征稳定。分别挑取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-Al第l代和第50代枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-Al接种于筛选培养基培养72h，二者的除臭效果几乎一致，说明该菌种的除臭性能经传代后依然稳定。挑取第一代枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-Al培养后制成冻干送交中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.3230，保藏日期为2009年8月19日。其中营养肉汤(琼脂)培养基、高氏1号(琼脂)培养基及麦芽汁(琼脂)培养基均为微生物常用培养基。筛选培养基为腐烂蔬菜叶400g，鱼头、内脏或肉渣100g，自来水800ml，煮沸30min，过滤，调滤液pH至7.0，12rC，灭菌20min。—复筛时采用的液体稀释法具体操作为取鸡粪便样，，在实验室内经过定量、水溶、过滤、稀释、加入等体积的各备选菌培养液(以加入无菌水的一管为空白对照)，1小时后嗅辩，得出试验组和对照组鸡粪便恶臭程度(判断标准见表1),最后检测通过嗅觉判断的除臭效果最好的几管样品臭气中氨、硫化氢和总烃的去除率以确认除臭效果。臭气组分测定法主要是测定臭气中主要成分——氮气和硫化氢的量用次氯酸钠-水杨酸分光光度法测定氨气的量，用聚乙烯醇磷酸铵吸收-亚甲基蓝比色法测定硫化氢的量，用气相色谱法(GB/T15263)测定总烃的量。表1菌种除臭效果标准较之空白对较之空白对比空白对照更较之空白对空白对照照臭味轻微照臭味显著臭照臭味减弱减弱减弱恶臭程度N/A+-——除臭效果N/A-++++++枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)具有以下微生物学特征1、形态学特征细胞呈杆状，0.91.0xl.71.8微米，着色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，运动，革兰氏染色阳性。芽孢0.50.7x0.81.3微米，椭圆到柱状，中生到近中生，无伴胞晶体，芽孢囊不明显膨大。菌落为圆形，粗糙，不透明，不闪光，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱状凸起，污白色或微带黄色。2、培养学特征枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)在营养琼脂培养集中30'C培养48h后菌落凸起，表面湿润，边缘光滑，不透明，呈灰白色，无可溶性色素；在营养肉汤中30'C培养48h,生长旺盛，培养液呈灰黄色，浑浊状；在蛋白胨査氏琼脂平板上3(TC培养48h，菌落呈平坦而厚，表面湿润，边缘光滑，不透明，灰黄色，无可溶性色素。3、常规生理生化性质如下项目生理生化特征项目生理生化特征需氧试验好氧&02酶实验+V.P.反应+氧化酶实验-M.R.试验-脲酶+油脂水解+明胶液化+酪素水解+石蕊牛奶反应+酪氨酸水解-形成吲哚-淀粉水解+柠檬酸盐利用+马尿酸盐水解-从甘油产二羟丙酮-纤维素分解-碳源产酸耐盐浓度7%葡萄糖+5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)的发酵工艺如下(1)种子液制备先进行斜面种子制备，培养温度为2035'C培养3672小时，挑取少量菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中，在温度为2035°C，转速为100250rpm下振荡培养3672小时，即可作为一级种子。同样培养条件下，将一级种子按5%~10%的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中，培养36~72小时后作为二级种子。(2)扩大化培养将二级种子以5%~10%(%:\^)的接种量接种到发酵罐中采用好氧和厌氧轮流进行的方式进行培养，每种方式各10小时。其中好氧培养采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10%,通气量0.1V/V.min,罐压0.03MP,温度20~35°C,起始转速100rpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平进行调节，最大转速不超过400ipm;厌氧培养阶段将搅拌转速降为50rpm,并通过调节通气量使溶氧不高于3%，温度不变。发酵过程中每4小时取样，利用细菌计数板检测，计算出活菌数，当活菌数不少于lxl07cfo/ml数量级时可停止发酵。所涉及的培养基成分如下斜面种子培养基(g/L):葡萄糖1020，牛肉膏1020，蛋白胨1020，CaCl2:卜5，KH2P04:18，Na2HP0412H20:18，MgS047H20:18,琼脂20，pH7.0。—级、二级液体种子培养基(g/L):葡萄糖1020，牛肉膏1020，蛋白胨1020,CaCl2:1~5，KH2P04:18，Na2HP04、2H20:18，MgS047H20:18，pH7.0。发酵培养基(g/L):葡萄糖1030，牛肉膏520，蛋白胨520，CaCl2:1~5，KH2P04:18，Na2HP0412H20:18，MgS047H20:18，pH6.0~7.0。枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)在制备生物除臭剂中的应用。所述的生物除臭剂含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1(CGMCCNo.3230),生物除臭剂中有效菌总活菌数不得少于lxl07cfWml数量级。生物除臭剂中还可含有嗜硫红假单胞菌(RpS.Sulfid叩hilus)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、产阮假丝酵母(CflaT/c/aa"fc)、小椭圆酵母(Saccharomycesmicroellipsoides)中的一种或几禾中。所述的生物除臭剂中还可加入体积百分比为0.01%~0.05%的香精。—种以枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)为主要成分的生物除臭剂的制备方法如下挑取枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)单菌落接种培养基，培养种子液，发酵进行扩大培养，发酵培养至活菌数至少达到lxlO、i^ml数量级，即制成仅含枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)的生物除臭剂。还可在所得到的生物除臭剂中加入0.01%~0.05%的香精。含枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)在内的复合生物除臭剂的制备方法如下将枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)、嗜硫红假单胞菌、生黄瘤胃球菌、产阮假丝酵母、小椭圆酵母根据各自的培养条件分别培按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂养发酵至菌数至少达到lxlO、ufml数量级，分别分装保存。根据不同终端客户所需要的品种不同，将各种不同菌种的培养液按一定比例混合，其中活菌总菌数不得少于lxlO、uf/ml数量级，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1的活菌数不低于有效菌总菌数的30%,即制成含枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)的复合生物除臭剂。嗜硫红假单胞菌、生黄瘤胃球菌、产阮假丝酵母、小椭圆酵母的发酵可使用现有技术中的培养基与培养条件。本发明的有益效果本发明提供的菌株是一种新型的枯草芽孢杆菌，通过对恶臭物质的吸附、吸收和降解功能，将其分解成无臭的简单无机物，可以对多种恶臭环境起到显著的除臭和抑菌效果，NH3平均去除率可达95.5。/。，H2S平均去除率可达93.8%，总烃平均去除率可达'94.3%，细菌总数平均去除率可达87.9%，臭气浓度平均去除率可达96.8%，可用于垃圾、生活污水、畜舍空气等的除臭和净化。当加入其他几种微生物活性成分后，枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)与其他的微生物共生在一起成为一种有益微生物菌群，此菌群被激活后在污水、垃圾等恶臭污质中繁殖，能分解污质中的有机物，同时靠相互间共生增殖及协同作用，代谢出抗氧化物质，形成稳定而复杂的生态系统，抑制有害微生物的生长繁殖，抑制H2S和NH3的产生，激活污质中具有净化功能的微生物、水生植物，通过这些物质的综合效应从而达到净化污质、抗菌和除臭的目的。7本发明所涉及的生物除臭剂中使用的微生物菌种均为安全无害微生物，将其制成除臭剂具有绿色无污染的优点，加之其为非转基因产品，消除了外来物种入侵之虑。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3230,保藏日期为2009年8月19曰。具体实施方式，菌种筛选及鉴定见说明书正文部分。实施例1~实施例6中所提及的枯草芽孢杆菌HF-A1均指保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.3230的枯草芽孢杆菌。实施例1在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌HF-A1(CGMCCNo.3230)斜面菌禾中3环，接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖15，酵母膏10,蛋白胨10，CaCl2:3,KH2P04:5，Na2HP0412H20:4,MgS047H20:6，pH7.0'单位g/L,115。C，灭菌20min)。在温度为30°C,转速为150rpm下振荡培养48小时得到1级种子液。将一级种子液按照10%的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中按同样条件进行培养，48小时后可得二级种子液。将二级种子液按照10%的接种量接种到35L已灭菌的液体培养基中(发酵罐体积为50L)，葡萄糖30，牛肉膏10，蛋白胨8，CaCl2:5,KH2P04:8，Na2HP0412H20:8，MgS047H20:5，pH7.0，单位g/L，115°C，灭菌20min),采用好氧和厌氧轮流进行的方式进行培养，每种方式各10小时。其中好氧培养采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10%,通气量0.1V/V.min，罐压0.03MP，温度30°C,起始转速lOOrpm，发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节，最大转速不超过400rpm;厌氧培养阶段将搅拌转速降为50rpm，并通过调节通气量使溶氧不高于3%，温度不变。发酵过程中每4小时取样，利用细菌计数板(JHA70-20-l型镜检目测显微细菌计数板，南京恩吉光学仪器)检测，计算出菌数，当活菌数达到lxlO、fWml时停止发酵，即得无香精型生物除臭剂。还可向发酵罐中加入10.5ml香精，搅拌均匀，即得含香精型生物除臭剂。实施例2室内垃圾除臭试验于一间密封的房间内放一堆己高度腐烂的产生恶臭的垃圾，将该生物除臭剂(按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂)在使用前用自来水稀释10倍，用喷枪喷洒200ml，尽量使除臭剂喷洒范围遍及垃圾堆放区域。在垃圾周围设置不同的采集地点进行采样，测定喷药前及喷药后15分钟恶臭气体中的H2S和NH3浓度，采样点离臭源边缘lm，采样高度为1.3m，5点采样，取平均值。臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T14675);氨采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法(GB/T14679);硫化氢采用聚乙烯醇磷酸铵吸收-亚甲基蓝比色法(GB/T16489);细菌总数采用撞击法(GB/T17093);总烃采用气相色谱法(GB/T15263)。测试结果见表2:表2微生物除臭剂室内垃圾除臭效果实验喷洒除臭剂前喷洒除臭剂后.平均去除率主要指标项目平均浓度平均浓度(mg/m3)(mg/m3)(%)臭味指标硫化氢0.0370.003490.7氨0.2960.02492.0总烃17.941.0294.3臭气浓度75276.796.5细菌指标细菌总数298036087.9注:臭气浓度单位:无量纲；细菌总数单位:cfWnv实施例3除臭效果和成本比较将一堆垃圾平均分成四份，置于四个面积和空间体积均相同的房间，分别喷洒4种除臭剂。按照实施例2的方法，考察相同体积、相同稀释度的不同品牌除臭剂的除臭效果的区别，结果见表3。其中，本发明生物除臭剂是按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂。表3.本生物除臭剂与市场常见产品除臭虑和成本比较生产厂家产品名称产品类型15min臭气去除率生产成本(元/m2)本发明生物除臭剂生物96.80.03陕西富安生物科技有限公司万洁芬生物除臭剂生物71.320.04隆润新技术发展有限公司隆润2号生物活性除臭剂生物21.890.80法国依雷德公司300型除臭剂生物提取液33.331.06200910034842加拿大北京华大佳净除臭HLSECOLO天然植物44.610.04技术有限公司植物型除臭剂由表3可看出本发明所提供的生物除臭剂在成本和除臭效果上均明显优于其他除臭剂。实施例4对生活污水的除臭取家庭厨房洗米、洗菜、洗鱼等混合污水，将其放置io天发出恶臭后，将污水分为等体积的两组，A组加入按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂，加入量为污水体积的0.1%;B组为空白组，加入污水体积0.1%的无菌水。15分钟后嗅辩，发现较之空白对照组，A组污水的臭味明显减弱。检测其中H2S和NH3浓度，H2S去除率为89.83%，NH3去除率为91.35%。实施例5净化畜舍空气效果试验将该按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂在使用前用自来水稀释10倍，向养鸡场中未打扫的空鸡舍中喷洒50ml，尽量使除臭剂喷洒范围遍及整个鸡舍。在鸡舍内设置不同的采集地点进行采样，测定喷药前及喷药后15分钟恶臭气体中的H2S和NH3浓度，采样高度为1.3m，5点采样，取平均值。氨和;硫化氢检测方法同实施例2。结果显示喷洒除臭剂15分钟后鸡舍内的氨和硫化氢分别平均降解95.5%和93.8%，，舍内空气氨和硫化氢分别平均降到9.8mg/rr^和1.5mg/m3，可明显降低鸡舍内的臭味。实施例6皮肤刺激性试验选取健康大白兔4只，于背中线两侧脱毛，范围3.0cmX3.0cm。取按照实施例1方法所制备的无香精型生物除臭剂原液0.5ml滴在2.5cmX2.5cm的4层纱布上。敷贴在每只家兔一侧脱毛区，然后用一层玻璃纸覆盖，再用纱布固定。另一侧用生理盐水作对照。6小时用温水去除受试除臭剂，于4h、24h、48h观察皮肤反应情况。观察结果显示在观察时间内，4只家兔皮肤试验区内均未见红斑、氷肿等现象，表明该生物除臭剂对家兔皮肤无刺激。权利要求1、一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3230。2、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-Al在制备生物除臭剂中的应用。3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的生物除臭剂以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1为有效成分。4、根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的生物除臭剂以包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-AI在内的多种微生物为有效成分，其中，有效菌总菌数不得少于lxl0^fti/ml数量级，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-AI的活菌数不低于有效菌总菌数的30%。全文摘要本发明属于环保领域，公开了一株新的枯草芽孢杆菌及其在生物除臭剂中的应用。本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A1，于2009年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3230。本发明菌株是从采自多种生态环境下的样品中筛选得到的。该菌株具有对多种恶臭环境起到明显的除臭和抑菌效果，NH<sub>3</sub>平均去除率可达95.5％，H<sub>2</sub>S平均去除率可达93.8％，总烃平均去除率可达94.3％，细菌总数平均去除率可达87.9％，臭气浓度平均去除率可达96.8％，可用于垃圾、生活污水、畜舍空气等的除臭和净化。文档编号C12N1/20GK101638626SQ20091003484公开日2010年2月3日申请日期2009年9月10日优先权日2009年9月10日发明者刘小勇,飞惠,惠大帅,王大伟,王有智,翁万山,肖淑红,晶魏申请人:飞惠