专利名称：：一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法
技术领域：
：本发明涉及脱氧胞苷三磷酸
技术领域：
，具体地说，是一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法。
背景技术：
：DNA分子是由四种脱氧核糖核苷酸分子结合成的两条互补多聚核苷酸链。合成这些多聚核苷酸的前体是四种脱氧核苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸作为四种原料之一参与核酸分子的体内或体外扩增。随着生物技术工业的发展特别是DNA生物合成和聚合酶链式反应的推广，市场上对DNA扩增所需要的脱氧核苷三磷酸的需求量将会明显地持续升高。另外，由于脱氧胞苷三磷酸在抗病毒抗肿瘤，治疗心血管疾病等方面应用的推广，同样也会对包括本发明所阐述的产品_脱氧胞苷三磷酸的需求量的提高起到促进作用。目前，商业化的脱氧胞苷三磷酸产品主要是由化学合成法实现的(Chambers"al.，1957;SmithandKhorana，1958);其中，脱氧胞苷三磷酸的合成方法包括使用脱氧胞苷单磷酸的三正丁基铵盐与正磷酸在二环己基碳二亚胺的存在下，在吡啶或二甲基甲酰胺水溶液中进行反应。脱氧胞苷单磷酸的转化率为50%;而且在转化过程中不可避免地会生成脱氧胞苷二磷酸和脱氧胞苷多磷酸等主要副产物。因此在后续的分离中，需要色谱分离方法实现脱氧胞苷单磷酸与脱氧胞苷二磷酸和脱氧胞苷三磷酸的分离。提纯过程还需要除去未反应的二环己基碳二亚胺(DCC)和正磷酸、副产物脱氧胞苷单磷酸、二磷酸和多磷酸以及还原后的DCC、吡啶或DMF溶齐U。在化学转化法所用溶剂属于美国环境保护署列出的有毒化学品。中国专利申请号00100844中公开了一种通过酶催化和化学反应联合生产脱氧核苷三磷酸的方法；该方法以天然DNA为起始原料，DNA经酶解后，脱氧核苷单磷酸经"脱氧核苷单磷酸酶的催化"反应和相应的化学反应后转化为包括脱氧胞苷三磷酸产品在内的四种脱氧核苷三磷酸；在该方法中，发明者没有对这种"脱氧核苷单磷酸酶"进行具体描述；这种酶的名字也没有被NC-IUBMB(国际生物化学和分子生物学联合命名委员会http:〃w丽.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/)酶命名法收录和接受，其中的化学法就是上文中所提到的方法。中国专利申请号02134612公开了一种三磷酸脱氧核苷的生产方法；该方法是将核苷酸还原酶EC1.17.4.2和要转化的底物腺苷三磷酸或鸟苷三磷酸或胞苷三磷酸或胸苷三磷酸加入到反应系统中，使酶的浓度达0.010.16单位/ml，使底物浓度达到160mmol/L，并加入以维生素B12为基础的辅酶形式的辅酶，以及含巯基还原剂或NADH或蛋白质还原剂，以缓冲液控制溶液pH69，于25°C4(TC反应；在该过程中必须使用维生素B-12作为辅酶，以NADH或蛋白作为还原剂。工艺路线与本专利不同。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的—种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，具体步骤为(a)脱氧胞苷酸激酶的克隆，表达和纯化；脱氧胞苷酸激酶的克隆是指包含了酿酒酵母的培养，基因组DNA的提取，利用PCR技术从中获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胞苷单磷酸激酶的基因GUK1，然后利用粘性末端连接法，进行重组质粒pET-17b/GUKl的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；脱氧胞苷酸激酶的表达和纯化是指利用23mg/ml的细菌溶菌酶加表面活性剂(如0.5^Tween20和0.5X的P450)或超声波破碎细胞，然后使用蛋白分子量截留为3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；丙酮酸激酶的克隆是指自枯草杆菌中获得丙酮酸激酶的基因BYK，重组质粒pET-28a/byk的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达；丙酮酸激酶的表达和纯化是指利用溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化；(c)用激动剂脱氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胞苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胞苷单磷酸合成脱氧胞苷三磷酸；本步骤包括以脱氧胞苷单磷酸为原料进行的脱氧胞苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胞苷二磷酸实现，其中用到原料为可溶性的脱氧胞苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶，如附图1所示，在第一步中，使用脱氧腺苷三磷酸为磷酸供体，而在第二步反应中，磷酸供体为磷酸烯醇式丙酮酸；第一步反应在可溶性脱氧胞苷单磷酸激酶的作用下一摩尔的脱氧胞苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸转变为一摩尔的脱氧胞苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸；第二步反应中，一摩尔的脱氧胞苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴随着磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，脱氧胞苷二磷酸和脱氧腺苷二磷酸同时被转化为脱氧胞苷三磷酸和脱氧腺苷三磷酸，生成的脱氧腺苷三磷酸产物又可以重新作为第一步反应的磷酸供体再次参与反应；另外，在两步反应中，总计一摩尔的脱氧胞苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸以及两摩尔的磷酸烯醇式丙酮酸被转化为一摩尔的脱氧胞苷三磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸以及两摩尔的丙酮酸，而生成的脱氧腺苷三磷酸可以再次被用做第一步反应所需要的磷酸供体，因此本反应体系的第一步反应中只需要添加极为微量的脱氧腺苷三磷酸即可满足反应所需。与现有技术相比，本发明的积极效果是(1)目前，传统的化学法既有可能破坏环境，又因为反应过程、纯化过程的低产率而不经济。虽然产品相同，但本发明描述的酶促工艺与化学法工艺截然不同过程简单，转化率高，环境友好，避免使用有毒和有腐蚀性的物质，如DCC、吡啶、DMF等。4(2)本发明采用两种很容易确认的酶，脱氧胞苷单磷酸激酶(EC2.7.4.8)和丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)，而且这两种酶制剂可以利用工程菌自行生产，表达量高，纯化简单，生产成本较低。使用过程中，可根据需要对酶用量、酶纯度等进行实时控制和调节。(3)本发明使用两种工程菌生产的激酶，包括脱氧胞苷单磷酸激酶(EC2.7.4.8)和丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)，这两种酶的催化反应不需要额外地添加辅酶。而现有技术使用一种酶核苷酸还原酶(EC1.17.4.2)，需要维生素B12作为酶促反应的辅酶，(4)本发明不使用还原剂。现有所述的方法必须使用含巯基还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇(DTE)或二氢硫辛酸或巯基乙醇，本发明中不需要添加任何还原剂，成份更加简洁；(5)本发明所建立的催化体系中，调节两种酶制剂的用量可以保持反应流的正向进行，使脱氧胞苷单磷酸底物完全转化为脱氧胞苷三磷酸产物，产物的分离和纯化将更加简单；(6)本发明的原材料为脱氧胞苷单磷酸这一单一化合物；(7)本发明的终产物是单独封装的脱氧胞苷三磷酸产物，然后可以按照需求进行分装或者和其它三种脱氧核苷三磷酸产品进行混合；(8)本发明中反应在水相中进行，原料溶解度大，可以获得高浓度的产品。图1脱氧胞苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶催化下由脱氧胞苷单磷酸生物合成脱氧胞苷三磷酸；图2HPLC检测4小时后脱氧胞苷单磷酸向脱氧胞苷三磷酸的全转化图。具体实施方式以下提供本发明一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法的具体实施方式。实施例1(a)脱氧胞苷单磷酸激酶的克隆，表达和纯化利用PCR技术，以酿酒酵母基因组DNA为模板，扩增获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胞苷单磷酸激酶的基因GUKl，然后利用粘性末端连接法，插入pET-17b的多克隆位点内，构建重组质粒pET-17b/G區l，并将该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序进行高效表达；脱氧胞苷单磷酸激酶制剂制备的基本培养基组成为0.5%的酵母提取物，1.0%蛋白胨和1.OX的氯化钠，其余的液体为水，用5mol/L的NaOH溶液调节培养基的pH值至7.0，12rC保温20分钟灭菌。灭菌后以lX接种量接种，37t:条件下，充分搅拌培养至0D600为0.50.6，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，37"下搅拌诱导4小时。在4"下，10000g离心5min收集细胞，用pH值为59的缓冲液洗涤，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷_盐酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸。离心收集洗涤后的细胞，用pH值为59的裂解缓冲液裂解细胞，裂解液为三羟甲基氨基甲烷_盐酸，氯化钾，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐温-20和P-40以及PMSF，离心后获得提取液，该提取液可以不经纯化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析获得粗酶，还可以通过色谱柱进行进一步的5纯化；表1由BL21(DE3)细胞产生的脱氧胞苷单磷酸激酶的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化利用PCR技术，以枯草杆菌基因组DNA为模板，扩增获得包含起始密码子和终止密码子在内完整的丙酮酸激酶的基因BYK，然后利用粘性末端连接法，插入pET-28a的多克隆位点内，构建重组质粒pET-28a/bykl，并将该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，按照下述程序进行高效表达；丙酮酸激酶制剂制备的基本培养基组成为0.5%的酵母提取物，1.0%蛋白胨和1.0%的氯化钠，其余的液体为水，用5mo1/1的NaOH调节培养基pH值至7.0，12rC保温20分钟灭菌。灭菌后以1%接种量接种，371:条件下，充分搅拌培养至0D600为0.60.9，加入终浓度为0.35mM的诱导剂IPTG，25t:下搅拌诱导6小时。在4"下，10000g离心5min收集细胞，用pH值为59的缓冲液洗涤，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸，葡萄糖和乙二胺四乙酸。离心收集洗涤后的细胞，用pH值为59的裂解缓冲液裂解细胞，裂解液为三羟甲基氨基甲烷_盐酸，氯化钾，乙二胺四乙酸和溶菌酶，吐温-20和P-40以及PMSF，离心后获得提取液，该提取液可以不经纯化直接使用，或者使用蛋白分子截留量在3，50014，OOODaltons的透析膜直接透析获得粗酶，还可以通过色谱柱进行进一步的纯化；表2由BL21(DE3)细胞产生的丙酮酸激酶的活性丙酮酸激酶浓度反应速度(mM脱氧总蛋白片段(Bradford法)胞苷二磷酸/min)(wt.%)提取液17.700.278葡聚糖凝胶G-100片段1.690.478364.03其他片段组合35.38(c)在可溶性脱氧胞苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶的作用下将脱氧胞苷单磷酸完全转化为脱氧胞苷三磷酸生产脱氧胞苷三磷酸的过程在3(TC下进行，缓冲液由pH8.0的50mMTris，lOOmM的氯化钾和50mM的氯化镁组成。可溶性脱氧胞苷单磷酸激酶活力为2.9U/ml，可溶性丙酮酸激酶的活力为4.0U/ml。脱氧胞苷单磷酸浓度为25mM，磷酸烯醇式丙酮酸的浓度为50mM，脱氧腺苷三磷酸浓度为l.OmM。脱氧胞苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶皆由自主克隆相应基因的工程菌提取。反应过程pH的控制通过滴加5mo1/1的NaOH溶液实现，脱氧胞苷三磷酸的生成速率为0.143mM/min，在大约200分钟内90%的脱氧胞苷单磷酸转化为了脱氧胞苷三磷酸。在大约小时以后脱氧胞苷单磷酸基本可以完全转化为脱氧胞苷三磷酸，如附图2所示。需要特别说明的是本反应中酶的用量、底物浓度和其它试剂的用量以及反应器的大小可根据过程要求，如产量和生产率而改变。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。权利要求一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，具体步骤为(a)脱氧胞苷酸激酶的克隆，表达和纯化；(b)丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；(c)用激动剂脱氧腺苷三磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胞苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胞苷单磷酸合成脱氧胞苷三磷酸；包括以脱氧胞苷单磷酸为原料进行的脱氧胞苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胞苷二磷酸实现，其中用到原料为可溶性的脱氧胞苷单磷酸激酶和丙酮酸激酶，在第一步中，使用脱氧腺苷三磷酸为磷酸供体，而在第二步反应中，磷酸供体为磷酸烯醇式丙酮酸。2.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，所述的脱氧胞苷酸激酶的克隆是指包含了酿酒酵母的培养，基因组DNA的提取，利用PCR技术从中获得包含起始密码子和终止密码子在内的完整的脱氧胞苷单磷酸激酶的基因GUK1，然后利用粘性末端连接法，进行重组质粒pET-17b/GUKl的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达。3.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，所述的脱氧胞苷酸激酶的表达和纯化是指利用23mg/ml的细菌溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，然后使用蛋白分子量截留为3，50014，000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化。4.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，所述的丙酮酸激酶的克隆是指自枯草杆菌中获得丙酮酸激酶的基因BYK，重组质粒pET-28a/byk的成功构建，以及该质粒顺利转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并成功地进行高效表达。5.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，所述的丙酮酸激酶的表达和纯化是指利用溶菌酶加表面活性剂或超声波破碎细胞，使用蛋白分子截留量在3，50014，000Daltons的透析膜直接透析获得粗酶，或者通过色谱柱进行进一步的纯化。6.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(c)中，所述的第一步反应是指在可溶性脱氧胞苷单磷酸激酶的作用下一摩尔的脱氧胞苷单磷酸和一摩尔的脱氧腺苷三磷酸转变为一摩尔的脱氧胞苷二磷酸和一摩尔的腺苷二磷酸。7.如权利要求1所述的一种通过生物技术合成脱氧鸟苷三磷酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(c)中，所述的第二步反应是指一摩尔的脱氧胞苷二磷酸和一摩尔的脱氧腺苷二磷酸在可溶性丙酮酸激酶的作用下，伴随着磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，脱氧胞苷二磷酸转化为脱氧胞苷三磷酸同时脱氧腺苷二磷酸也被转化为脱氧腺苷三磷酸，此时生成的脱氧腺苷三磷酸又可以再次作为第一步反应的磷酸供体，参与第一步反应。全文摘要本发明涉及一种通过生物技术合成脱氧胞苷三磷酸的方法，具体步骤为脱氧胞苷酸激酶的克隆，表达和纯化；丙酮酸激酶的克隆，表达和纯化；用激动剂脱氧腺苷三磷酸，烯醇式丙酮酸和游离的脱氧胞苷酸激酶、丙酮酸激酶从脱氧胞苷单磷酸合成脱氧胞苷三磷酸；包括以脱氧胞苷单磷酸为原料进行的脱氧胞苷三磷酸的生物催化合成；该过程由两步耦合的磷酸化反应经生成中间产物脱氧胞苷二磷酸实现。本发明的优点表达量高，纯化简单，生产成本较低；产物的分离和纯化将更加简单；可溶解很多的溶质，从而可以满足不同的使用要求。文档编号C12P19/30GK101705270SQ20091003599公开日2010年5月12日申请日期2009年10月15日优先权日2009年10月15日公开号200910035991.发明者俞宏峰,朱月珍,段梅莉,辛秀娟,陆雅臣,鲍杰申请人:江苏华荣生物科技有限公司