专利名称：miR-381作为脑瘤发生分子标志物的用途及检测方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤分子标志物，特别涉及微小RNA在脑瘤高危人群筛查和早 期诊断中的应用。
背景技术：
据统计，在全身肿瘤的发病中，脑瘤的发病率仅次于胃、子宫、乳腺及食 管肿瘤，国内发病率为1.34/10万，国外为9-10/10万，儿童脑瘤的发病率明显 高于成年人。虽然目前脑瘤的诊断和治疗方法在不断改进，但是脑瘤生存期仍 没有明显提高。脑瘤的诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经 验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为晚期，远远不能适应对脑瘤进行高危 人群筛查和早期诊断的需求。因此，寻找无创伤性的脑瘤早期诊断标志物对高 危人群进行筛査，以便对脑瘤患者进行早期诊断、早期治疗，显著提高患者生 存率， 一直是神经科学领域研究的主要任务。
微小RNA (microRNA/miRNA)是长度约21-25个核苷酸的非编码RNA， miRNA能够识别特定的目标mRNA并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解 和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用，它们通过调节信号分子(细 胞因子、生长因子、转录因子和促凋亡或抗凋亡基因等)的表达参与动植物的 生长、分化和发育。近几年来的研究发现， 一些miRNA的特异性调节和人类肿 瘤的形成有关,一半以上的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性区域， 可以作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的病理发病过程，其异常表达在肿瘤的发 生发展以及诊断和评估预后等方面极具研究价值，已经愈来愈受到生命科学工 作者的重视。如，miR-15、 miR-16在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中表达下调 或缺失，miR-145和miR-143的表达下调与结肠癌密切相关，miR-155在Bukitt's 淋巴瘤中高表达，miR-128a的表达下调则与胶质瘤密切相关等等。除此之外， 最新的研究发现，来源于各种组织或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周 血中并稳定存在，它们可以抵抗血中RNA酶(RNaseA)的消化，甚至是更强 烈的干扰。虽然目前miRNA抵抗RNA酶消化的机制还不清楚，但是，miRNA 在外周血中稳定存在的特性，足以显示出miRNA在探寻肿瘤早期诊断分子标志 物方面的巨大潜力。
发明内容
本发明的目在于提出miR-381 (miRBase登录号MI0000798)能作为脑瘤 发生风险的分子标志物之一应用于医药领域，并进一步通过提供一种检测外周 血miR-381的方法，用于脑瘤高危人群筛查和早期诊断。
在前期的研究工作中，发明人通过筛査不同病理级别的胶质瘤组织中差异 表达的miRNA时，发现miR-381在不同级别的胶质瘤组织中存在明显的差异， 且随着胶质瘤的病理级别增加，miR-381的表达明显升高。通过进一步组织研究， 发明人发现miR-381是一个与脑瘤发生发展密切相关的瘤基因，在脑瘤组织， 包括胶质瘤、脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤等肿瘤组织中表达明显上调，这提 示miR-381可以作为脑瘤的分子诊断标志物。研究还发现，miRNA在肿瘤发病 的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的 降解而稳定存在。因此，发明人提出外周血miR-381可以作为脑瘤早期诊断的 分子标志物。
本发明的检测外周血miR-381的方法为(1)收集待测个体外周血样本， 抽提总RNA; (2)以总RNA为模板将miR-381特异性逆转录为cDNA; (3)用 miR-381 stem-loop引物进行Real-Time PCR扩增，定量ACt惶，ACt惶二 miR-381与内参基因平均CT值的差值，判断ACr是否小于10.15，当ACT《10.15 时提示miR-381表达阳性。
本发明可以定量的检测各人群外周血中miR-381的表达状况，从而预测脑 瘤的患病风险，用于脑瘤高危人群的筛査，并用于对脑瘤患者做出早期、快速 的无创性诊断。此外，由于miR-381的表达随着胶质瘤病理级别的进展而增加， 因此，外周血miR-381的表达检测也可以作为脑瘤患者预后判断的重要指标。
图1 RT-PCR检测miR-381在正常脑组织和脑瘤组织中的表达差异图； 图2 RT-PCR检测miR-381在正常人和脑瘤患者外周血中的表达差异图。
具体实施例方式
在前期研究工作中，发明人利用miRNA芯片和SAM软件分析筛査10例正 常脑组织和10例胶质瘤组织中差异表达的miRNA时，发现miR-381在正常脑 组织和胶质瘤组织中存在明显的差异。
通过进一步组织研究，发明人发现miR-381是一个与脑瘤发生发展密切相 关的瘤基因，在脑瘤组织，包括胶质瘤、脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤等肿瘤组织中表达明显上调(参见附图l)，且随着肿瘤的病理级别增加，miR-381的 表达明显升高，这提示miR-381可以作为脑瘤的分子诊断标志物。
研究还发现，miRNA在肿瘤发病的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至 微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而稳定存在。因此，发明人进一步检 测了 miR-381在正常人和脑瘤患者外周血中的表达情况，发现miR-381在脑瘤 包括胶质瘤、垂体瘤、脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤和髓母细胞瘤 等患者的外周血中表达明显升高，与正常人外周血中的表达存在明显差异(p< 0.01)(参见附图2)。即使在胶质细胞增生即胶质瘤发生的极早期阶段患者的外 周血中，仍然可以检测到miR-381与正常人患者外周血中的表达差异(p<0.05)， 提示外周血miR-381可以作为脑瘤早期诊断的分子标志物。
实施例1 外周血样本中miR-381的检测
(1)外周血RNA的抽提采用德国格雷那公司VACUETTE (非可替)5ml 枸橼酸钠抗凝管，采集待测个体外周血样本5ml。采血后需来回轻晃抗凝管，让 血液与管壁的抗凝剂充分接触，动作轻柔以防溶血，立即抽提外周血总RNA。
① 外周血单核细胞提取取枸橼酸钠抗凝血5ml， 1000rpm离心6min，吸 取上层血浆于EP管中-7(TC保存，向下层的外周血细胞加入等体积的Hanks液 颠倒混匀；取淋巴细胞分离液6ml于离心管中，将混匀的血细胞沿管壁缓慢注 入分离液中，使两液体间保持清晰的界面，2000rpm离心20min;吸取血浆和分 离液之间的单个核细胞层于EP管中，4°C 6000rpm离心10min;弃上清液，加 入Hanks液lml吹打混匀，4°C 6000rpm离心10min;弃上清，加Trizol lml吹 打混匀，冰上静置5-10min，提取RNA或-70'C保存。
② Trizo1提取细胞总RNA:加氯仿200 P 1/ml Trizol于EP管中，用手震荡 15-30s，冰上放置5min， 4°C 12000g离心15min;小心取上层水相入新EP管中， 加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20°(:冰箱静置20min， 4°C 12000g离心 10min;弃上清，加入75。/。DEPC水稀释的乙醇l-2ml混匀，4t: 7500g离心5min， 尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20 ul溶解RNA。分光光度 计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行EB胶电泳检测 RNA质量，-70*€保存。
(2) miR-381特异性逆转录使用上海吉玛生物技术有限公司生产的 Hairpin-itTMmiR-381试剂盒(QPM010)定量分析。20uL逆转录反应的体系
如下成分量/管
5XRT缓冲液4iU
Mg2+ (25mM)3iU
dNTP (10mM)0.75
MiR國381-RT引物(1 ixM)1.20 ul
RNasin (40U/ul)0.25 u 1
MMLV逆转录酶(200U/ul)0.2 u 1
RNA样本 (lug总RNA)Xy 1
无酶水To 20 u 1
在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录mix， 用手指轻弹装试剂的管子，将逆转录mix用移液器吸打几次，不能用振荡器。
miR-381逆转录程序16。C30分钟，42'C30分钟，85XM0分钟。 (3) miR-381特异性Real-time PCR:先将逆转录产物稀释至2倍，然后混 匀。20uL反应体系如下
成分量/管
2 X Real-time PCR缓冲液10ul
miR-381特异性引物(5ixM)0,4 ul
miR-381 RT产物2ul
耐热性聚合酶(5U/ul)0.2 Pl
双蒸水To 20 u 1
miR-381实时定量PCR反应程序95°C 3分钟，40个循环，95'C12秒， 62。C 35秒。
miR-381的特异性引物为
The forward primer: 5' - AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC國3' The reverse primer: 5' - ATCCATGACAGATCCCTACCG-3' 以U6SnRNA作为内参基因，其引物序列为 The forward primer: 5' - ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' The reverse primer: 5' - GGAACGCTTCACGAATT TG國3' (4)测定ACt指称ACt是指同一祥品中，待检基因与内参基因平均ct 值的差值。即miRNA ACT-microRNAMean CT- control Mean CT。本发明中，ACT为miR-381与U6 SnRNA的平均Ct信的差信，获取并定 量ACt信，并进行判断，当ACt《10.15吋，预示脑瘤发生。
实施例2外周血样本中miR-381检测方法的临床验证
以上述方法，检测10例正常人外周血和50例疑似脑瘤患者外周血(新入 院的初始病人，手术前)中miR-381的表达。
与正常人外周血miR-381的表达相比，其中48例患者外周血中miR-381的 表达升高，其ACT值均《10.15， 48例患者在手术后经病理证实均为脑瘤患者。 另2例患者在进行外周血miR-381特异性Real-time PCR检测时，其AOr值 〉10.15，与正常人外周血miR-381表达相比，没有显著性差异，经手术后病理诊 断证实，二例均为海绵状血管瘤患者。
以上研究表明，外周血miR-381可以作为脑瘤患者诊断的分子标志物，当 ACT值〈10.15时，预示脑瘤发生的可能性为100%。检测外周血miR-381的表 达，具有很好的稳定性，可以用于脑瘤高危人群筛査和早期诊断。序列表
<110> 中南大学
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agtctataca agggcaagct etc 23
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atccatgaca gatocctacc g 21
<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <■> 3
attggaacga tacagagaag att 23<210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4
ggaacgcttc acgaatttg 19
权利要求
1.miR-381作为脑瘤发生分子标志物的医药用途。
2. —种检测miR-381在外周血中的表达的方法，其特征在于包括步骤(1)收 集待测个体外周血样本，抽提总RNA; (2)以总RNA为模板将miR-381特 异性逆转录为cDNA; (3)用miR-381 stem-loop引物进行Real-Time PCR扩 增，以U6 SnRNA作为内参基因，定量AGr值二待检基因miR-381与内参基 因平均ct值的差值，判断ACt是否小于或等于10.15，当AC《10.15时提示 miR-381表达阳性。
3. —种如权利要求2所述的方法，其特征在于所述Real-Time PCR时，所用 的miR-381的特异性引物为正向5'- AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC -3',反向5'-ATCCATGACAGATCCCTACCG -3';所用的内参基因U6 SnRNA 的引物序列为正向5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向5'-GGAACGCTTCACGAATT TG -3'。
全文摘要
本发明公开miR-381作为脑瘤发生分子标志物的用途及检测方法，收集待测个体外周血样本，抽提总RNA；以总RNA为模板将miR-381特异性逆转录为cDNA；用miR-381 stem-loop引物进行Real-Time PCR扩增，以U6 SnRNA作为内参基因，定量ΔC<sub>T</sub>值，判断ΔC<sub>T</sub>是否小于或等于10.15，当ΔC<sub>T</sub>≤10.15时提示miR-381表达阳性。本发明通过定量的检测各人群外周血中miR-381的表达状况，从而预测脑瘤的患病风险，用于脑瘤高危人群的筛查，并用于对脑瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
文档编号C12Q1/68GK101560553SQ20091004315
公开日2009年10月21日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者唐海林, 张祖萍, 希 曾, 丹 李, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 武明花 申请人:中南大学