专利名称：一种利用基因工程方法增强烟草抗冻性能的方法
技术领域：
本发明属分子生物学、酶学、生理学、育种学以及基因工程等领域。涉及一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，具体涉及利用莨菪AOC基因的cDNA构建高效植物 表达载体和工程菌株在烟草中表达该基因、筛选转化子、验证抗冻性能的具体程序。
背景技术：
茉莉酸类物质是植物界中普遍存在的一种激素，参与植物发育和逆境胁迫下应激 反应的信号传导过程。内源和外源的茉莉酸类化合物能显著提高植物对机械损伤、动物撕 咬、病虫害侵染、低温、高盐等不利外界环境的耐受能力。在植物中，茉莉酸类物质的合成途 径是从细胞膜上释放的亚麻酸开始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化 酶、OPDA(12-0X0-(10，15Z)-phytodienoic acid)还原酶、β -氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一 系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物会自发水解，由此丙二烯 氧化物环化酶的作用在茉莉酸类物质的合成途径中尤为重要。作为一种重要的模式植物，且易于进行遗传转化，烟草是植物的信号途径研究中 的热门对象；作为一种广泛种植的经济作物，烟草的抗逆性能在物种品质和经济价值上具 有非常重要的意义。烟草的抗冻研究目前涉及葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐 化酶(SOD)蛋白等。相比较而言，利用来源于莨菪的茉莉酸类物质合成途径的关键酶丙二烯氧化物环 化酶的基因工程来系统性地提高烟草的抗冻性能具有很大的优势(1)在茉莉酸类物质的 合成和信号传导研究领域，全世界的研究人员已经进行了几十年的深入研究，其生理作用 和生化机制比较清楚，为在基因工程中利用茉莉酸类物质生物合成途径的基因打下了良好 的理论和实践基础。(2)莨菪是一种和烟草亲缘关系非常相近的茄科植物，来源于莨菪的丙 二烯氧化物环化酶可以在烟草中顺利表达并达到高活性效果。目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术把莨菪的茉莉酸物 质生物合成途径的酶基因尤其是丙二烯氧化物环化酶转到烟草中，提高烟草抗冻性能的相 关报道，包括专利和文献。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，该 方法将来源于莨菪的丙二烯氧化物环化酶基因转到烟草中。本发明的第二目的是提供一种高效表达载体，它包含上述莨菪的丙二烯氧化物环 化酶基因片断。本发明的第三目的是提供一种用上述高效表达载体转化的宿主细胞。在本发明实 例中该宿主细胞是烟草。本发明还提供利用基因工程获得的提高了抗冻性能的烟草细胞和植株及其培养 的子代、再生植株、植物组织或种子。
本方法的目的通过下述技术方案实现本发明分离出的DNA分子具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心 片断，该核心片断来源于由申请人在GenBank中登录的莨菪丙二烯氧化物环化酶基因 (AY708383)的核苷酸序列，用引物 P1 (5，_GA ACTAGT ATG GCT ACT GCT TCC TCA G-3，， Spel 酶切位点用下划线表示)禾口 P2(5，-GC GGTGACC TCA ATT AGT GAA ATT TTT CAG-3，， BstEII酶切位点用下划线表示)，采用PCR法可以从莨菪cDNA文库中扩增出该核心片断， 莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列如SEQ IDN01 :(莨菪(Hyoscyamus niger)丙二 烯氧化物环化酶基因，全长1045bp，Genbank登录号AY708383，开放阅读框位置为第71位 碱基到第817位碱基)。本发明公开了一种利用转基因技术提高烟草抗冻能力的方法，其特征在于利用具 有编码莨菪丙二烯氧化物环化酶的核苷酸核心片断的表达载体，采用任何转基因方法在烟 草细胞、组织、器官、植株中表达其步骤如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得莨菪丙二烯氧 化物环化酶基因的核心片断；(2)把莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成 表达载体；(3)采用任何转基因方法转移莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断到烟草细 胞、组织、器官、植株中；(4)在特定的条件下筛选和鉴定转化子；(5)在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因后代。本发明涉及的载体包含具有编码莨菪丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心 片断的DNA。用上述方法获得的生命体，它是抗冻性能提高了的烟草的细胞、组织、器官、植株。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本发 明中，术语“生命体”指烟草的细胞、组织、器官、植株。在本发明中，术语“任何可能的手段”为获得莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的方 法，具体包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文库筛选而后人工合成莨菪丙二烯氧化物 环化酶基因及其变异体。在本发明中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根 农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、PEG介导基因转化、脂质体介导 基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束 介导基因转化、基因枪介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因 转化。在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指在离体培养的条件 下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的转化子；可以使用PCR、 Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。在本发明中，术语“在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因 后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测抗冻性能，筛选抗冻性能提高的优良转化子进行培养，获得转基因后代。在本发明中，从莨菪中克隆丙二烯氧化物环化酶基因核心片断，并构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，以提高烟草的抗冻性能，提高了烟草的种质，增 强了栽培适宜性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如《分子克隆》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条 件，或按照厂商所建议的条件。实施例1莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的合成，及表汰载体和工稈菌的构津1.莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的获得根据莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的全长序列，在该基因的内部第71碱基至第 817碱基之间设计引物，扩增747bp序列作为基因片断，并根据植物表达载体PCAMBIA1304 的多克隆酶切位点，分别设计两条含有SpeI和BstEII限制性内切酶位点以及保护碱基的 PCR扩增引物，其引物序列为Pl :5，-GAACTAGTATGGCTACTGCTTCCTCAG-3’, SpeI 酶切位点用下划线表示P2 :5，-GCGGTGACCTCAATTAGTGAAATTTTTCAG-3’, BstEII 酶切位点用下划线表示从莨菪的叶片抽提总RNA (上海华舜生物工程有限公司植物RNA提取试剂盒)，反 转录成cDNA (TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μ L，包含去离 子水，10XPCR 缓冲液 5 μ L，dNTP 1 μ L，MgCl2 3 μ L，引物各 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0. 5 μ L。PCR条件为94°C 3分钟，随之以94°C 50秒、60°C 45秒、和72°C 1分钟进行28个 循环，最后在72°C延伸10分钟。琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片断长度为 764bp。电泳分离后，回收(上海华舜生物工程有限公司PCR产物回收试剂盒)目的片断， 取适量回收产物与pMD 18-T载体(TaKaRa PMD 18-T Vector试剂盒)连接后转入大肠杆 菌DH5ci，在LB+氨苄青霉素(lOOmgL—1)固体培养基上抗性筛选阳性克隆，PCR鉴定后测序 (上海博亚生物工程公司完成)。2. CaMV35S组成型启动子表达载体pCAMBIA-HnAOC的构建将经过测序验证正确后的DH5 α (已经转入带有莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核 心片断的pMD 18-T载体)摇菌，扩大培养，提取质粒，用SpeI和BstEII双酶切，琼脂糖 电泳后回收小片断。将pCAMBIA1304用SpeI和BstEII双酶切，1 %琼脂糖电泳后回收大片断。将回收的pCAMBIA1304大片断和莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断用T4连 接酶连接后，转化DH5 α感受态细胞，LB+卡那霉素(lOOmgL—1)固体培养基上筛选阳性抗性 克隆，PCR和双酶切鉴定。获得转莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的重组质粒并命 名为 pCAMBIA1304-HnA0C。3. pCAMBIA1304-HnA0C 转化农杆菌 EHA105
将pCAMBIA1304-HnA0C转化入农杆菌菌株EHA105，划板挑取阳性单菌落摇菌，取 少量菌液抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定。阳性克隆定义为EHA105-HnA0C。实施例2获得抗冻能力提高的转基因烟草1.农杆菌EHA105-HnA0C。使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体(Rif+，Str+， Kan+)，28度，200rpm振荡培养两次。2.第二次活化0D_达0. 3时加100 u mol L-1乙酰丁香酮，继续28度，200rmp振 荡培养，OD600达0. 6时室温下4000rpm离心10分钟。3.弃上清，菌体用MS (加100 u mol L—1乙酰丁香酮)液体培养基悬浮，稀释到原 体积的5-20倍，使菌液的0D_ = 0. 3左右，称转化液。4.取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成O.ScmXO. 8cm左右的叶 盘，放在MS (加lmg L—1 6-苄氨基嘌呤，lmg L—1萘乙酸)培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘 放入农杆菌培养液中，190rpm，28°C摇床上浸染lOmin ；用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水 纸上，吸干叶盘上的多余菌液；将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS (加lmg厂1 6-苄氨 基嘌呤，lmg L—1萘乙酸)培养基上，25°C左右，于暗处共培养约2天。5.共培养后，按以下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接 触溶液a)无菌水15分钟b)无菌水+羧苄青霉素(500mg L—1) 15分钟c)MS+羧苄青霉素(500mg L—1)20 分钟接着用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分；将叶盘放在MS (含30mg I71 潮霉素和250mg L—1羧苄青霉素)培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25°C左右，16h/24h 光照培养；约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于MS (含0. 5mg厂1萘乙酸、 SOmg/r1潮霉素和ZSOmg/T1羧苄青霉素)培养基上进行生根培养；约14天之后将幼苗移 栽到装有1 1 1的泥炭土、蛭石和珍珠岩混合物小型的塑料花盆中在25°C、14h光/24h 的条件下生长。6.用PCR分别检测潮霉素抗性基因和莨菪丙二烯氧化物环化酶基因在转基因烟 草的基因组中的整合，确认转基因事件。实施例3转基&烟H禾P非转基&烟草)^照的抗栋能力检测丨1.比较转基因和非转基因烟草抗冻能力，用烟草叶片低温处理后的离子泄漏率来 表征其对低温的耐受性能。(参考文献:Wallis,J. G.，Wang，H. Y.，and Guerra，D. J. (1997) Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mol. Biol. 35, 323-330 ；Nunes, M. E. S. and Smith, G. R. (2003). Electrolyte leakage assay capable of quantifying freezing resistance in rose clover. Crop Sci.43,1349-1357)2.分别称取对照和转基因烟草生长期和生长状态较一致的叶片每份0. 5克，用去 离子的蒸馏水冲洗三次，放入-20°C处理30分钟。3.在室温解冻1小时，每份样品中加入30ml超纯水，再于25°C、lOOrpm振荡2小时，用数字式电导率仪测定溶液的电导率Re。4.接着将样品在原溶液中煮沸30min，再测定溶液的电导率Re’。5.定义相对电导率=Rc/Rc，X100%。6.六个被检测的转基因系都显示出对低温处理较高的耐受性。经过-20°C处理 后，六个转基因系植株的叶片离子的泄漏率分别为25.04% (5.81% ), 15. 57% (1.96% ), 11. 82%(0. 98% ), 17. 30% (3. 82% ), 12. 07% (0. 86% ), 13. 45% (0. 96% )；野生型烟 草-20°C处理后的离子泄漏率为77. 95% (3.82%)；转空载体对照烟草_20°C处理后的离 子泄漏率为73. 26% (3. 82% )。其中括号中为标准偏差。转基因烟草的离子泄漏率水平为 空白对照和空载体对照的四分之一左右。SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120> 一种利用莨菪AOC基因转化提高烟草抗冻性能的方法<130>11<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1045<212>DNA<213> 植物<400>1gatcaccctc agcaacaacc tcattcaagt tttttatttt gccaacaaat ttgcaagttc 60ttctttagcc atggctactg cttcctcagc ctcagctgct cgtagacgca ctatatcttc 120ttccacatat aagctacctt ctacctttcc gcttacttct gcttctcaaa agatccaatc 180ttttaaactc cctaaccccc tcatttccca atcccttaaa cttaacacct ccactactac 240ttctagatca ttttcctgca aaagccagag cagctcaaca gattccacaa ctactaaagt 300tcaagaacta agtgtctatg agctcaatga acatgaccgt ggtagcccag cttatcttcg 360attgagtcaa aagaatgtca attcacttgg agatcttgtc ccgtttagca acaaactata 420tacagcagac ctaaagaagc gaattggaat aacagcagga ctatgcattt taaccaagca 480cgaagaggag aaaaaaggag atcgctatga agctatttac agcttttact tcggcgaata 540cggtcacatc gccgtacagg gatcgtactt aacttacgag gatacttatc tcgccgtcac 600cggtggatcc ggtatatttg caggggtttc gggtcaagtg aaattacagc aaatcatctt 660cccttttaag ctattctaca ctttttactt gaaaggtatc ccagatctgc cgtctgagtt 720gctatgtacg gcggttcctc cgtcgccgac ggtggagcca acgcctgaag ctaaagcttg 780tgaggctggg gccacactga aagatttcac taattgagtg ggttgttgat tgcaattagg 840acttttattg gggtcgtttt gaataaacca gtaatgctga gagtgtagga tagctgaaat 900tactccattg tccttttggt tcgccttttt ggtatctttt taattattgc tgtattttgt 960tatgtaatgg cctaatttcc gtttctgcct tttggtactt tgtattataa agttaagaaa 1020ataatttaaa aaaaaaaaaa aaaaa 104权利要求
一种利用基因工程方法增强烟草抗冻性能的方法，其特征在于利用具有编码莨菪丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列(Genbank No.AY708383)的植物表达载体，采用转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中过量表达莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的DNA分子；包括下述步骤(1)采用基因克隆或人工合成基因方法获得莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的片断；(2)把莨菪丙二烯氧化物环化酶基因片断连于表达调控序列，形成植物高效表达载体；(3)采用转基因方法转移莨菪丙二烯氧化物环化酶基因片断到烟草的细胞、组织、器官或植株中；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化子，获得转基因后代；(6)测定转基因后代的抗冻性能。
2.一种表达载体，其特征在于它包含权利要求1的莨菪的丙二烯氧化物环化酶基因片断。
3.一种宿主细胞，其特征在于其转化上述表达载体。
4.按权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于是烟草。
5.一种生命体，其特征在于是用权利要求1所述方法获得的抗冻性能提高的细胞、组 织、器官、植株。
6.一种生命体的后代，其特征在于是用权利要求1所述所述方法获得抗冻性能提高的 细胞、组织、器官或植株转基因生命体的后代。
全文摘要
本发明属分子生物学、酶学、生理学、育种学以及基因工程等领域。具体涉及利用莨菪AOC基因的cDNA构建高效植物表达载体和工程菌株在烟草中表达该基因、筛选转化子、验证抗冻性能的方法。本方法从莨菪中克隆AOC基因，构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，测定转基因烟草叶片低温处理后的电导率。本方法可以在烟草中过量表达莨菪AOC基因，提高烟草的抗冻性能。本发明方法能在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因后代，并能提高烟草的种质，增强栽培适宜性。
文档编号C12N15/82GK101838664SQ20091004776
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者唐克轩, 唐燕雷, 孙小芬, 皮妍, 蒋科技 申请人:复旦大学