专利名称：一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法
技术领域：
本发明涉及一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法，属生物医学分子生物学及 纳米技术领域。
背景技术：
随着纳米技术的迅速发展，各种形式的纳米材料正以各种途径进入我们的生活，纳米尺 度的材料具有小尺寸效应、大比表面积、高反应活性等性质，其能够进入生物体，对生物体 造成的各种的影响已经引起科学界和各国政府的广泛关注。
纳米生物技术在迅速发展的生物技术领域中正处于领先地位，利用纳米技术对细胞和动 物体内成像的探索性发展已经进行了很多年。作为纳米生物技术的基础，纳米粒子具有尺寸 小和新颖的特性，已广泛用于药物输送，细胞成像，和生物医学的诊断和治疗。特别是用荧 光成像技术，纳米粒子独特的物化特性使其特别适合在细胞中对分子进行观察和轨迹跟踪。 由于二氧化钛纳米管具有生物和化学惰性以及它的成本效益，二氧化钛纳米管结合了无机和 有机成分的特性，并且大范围使用于分子生物学领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法，利用异硫氰酸 荧光素标记或修饰的二氧化钛纳米管研究其在细胞中的定位、迁移、代谢等分子生物活动过 程。
本发明一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法，其特征在于具有以下的过程和 步骤
a. 3-氨丙基三乙氧基硅烷与异硫氰酸荧光素化合物的合成(FITC-APTS)
用36.3ml3-氨丙基三乙氧基硅垸(APTS， d=0.949)、 2.625mg异硫氰酸荧光素(FITC) 与0.5ml的重蒸后的分析纯无水乙醇，放置于洁净的三颈烧瓶中共同混合；在氮气保护下使 其反应，反应在磁力搅拌下进行，反应时间为12 15小时；在FITC-APTS两物质的合成过 程中要避光，避免光漂白；所述反应的反应方程式如下 <formula>formula see original document page 3</formula>
b. 异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管(Ti02-FITC-NTS)用lml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圆底烧瓶中，用磁力搅拌机进行搅拌，并 调节pH值，5分钟后加入3mg二氧化钛纳米管和50ul四乙氧基硅烷(TEOS), 2分钟后加 入1.4ml氨水，调节pH值至11.85, 10分钟后加入100ul已标记有异硫氰酸荧光素(FITC) 的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，继续磁力搅拌24 30小时；其具体反应方程式如 下
<formula>formula see original document page 4</formula>
最终得到异硫氰酸荧光素标记或修饰的二氧化钛纳米管(Ti02-FITC-NTS)。
一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法所得到的异硫氰酸荧光素二氧化钛纳米 管(Ti02-FITC-NTS)的用途是研究其在细胞中的定位、迁移、代谢等分子生物活动过程；可 直接用于细胞生物试验。
本发明方法的优点是荧光素标记的二氧化钛纳米管分散性好。同时合成过程简单，不 需要如高温、高压、添加催化剂等特殊的反应条件，并且硅是生物兼容性物质、无毒性，同 时在反应中选择地加入少量TEOS，使得二氧化钛纳米管表面形成有序的硅矩阵包封在荧光 试剂周围，避免光漂白，有利于增加其稳定性，不影响二氧化钛纳米管与细胞的作用效果。
本发明标记方法与半导体量子点相比具有很多优点比半导体的量子点的荧光量子效率 高，有利于在实时监测中的应用；并且半导体量子点需要紫外激发，会生成一种高毒性的Cd2+，
损伤及杀死生物细胞及生物大分子。
图1为异硫氰酸荧光素修饰后二氧化钛纳米管的激光共聚焦荧光图。
图2为修饰后的二氧化钛纳米管的透射电镜图(TEM)。
图3为修饰后的二氧化钛纳米管的红外光谱分析图。
图4为修饰后的二氧化钛纳米管的X射线衍谢分析图(XRD )。
图5为修饰后的二氧化钛纳米管的紫外光谱分析图。
图6为荧光修饰纳米二氧化钛在细胞中的激光共聚焦表征图。图7为荧光修饰纳米二氧化钛在细胞中的激光共聚焦表征图。
具体实施例方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。 实施例l
本实施例中的过程和步骤如下
(1) 3-氨丙基三乙氧基硅烷与异硫氰酸荧光素化合物的合成(FITC-APTS) 用36.3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS， d=0.949)、 2.625mg异硫氰酸荧光素(FITC) 与0.5ml的重蒸后的分析纯无水乙醇，放置于洁净的三颈烧瓶中共同混合；在氮气保护下使 其反应，反应在磁力搅拌下进行，反应时间为12小时；在FITC-APTS两物质的合成过程中 要避光，避免光漂白；所述反应的反应方程式如下
I FITC 'I
b.异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管(Ti02-FITC-NTS)
用1ml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圆底烧瓶中，用磁力搅拌机进行搅拌，并 调节pH值至11.55， 5分钟后加入3mg 二氧化钛纳米管和50ul四乙氧基硅垸(TEOS)， 2分 钟后加入1.4ml氨水，调节pH值至11.85， 10分钟后加入lOOul已标记有异硫氰酸荧光素 (FITC)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，继续磁力搅拌24小时；其具体反应方程 式如下
<formula>formula see original document page 5</formula>
最终得到异硫氰酸荧光素标记或修饰的二氧化钛纳米管(Ti02-FITC-NTS)。 本发明实施例所制得的异硫氰酸荧光素标记的二氧化钛纳米管的表征。 通过各项仪器检测，所得的表征结果参见附图中的图1至图5。图1为异硫氰酸荧光素标记的二氧化钛纳米管的激光共聚焦图片，从图中可以看出，修 饰后的纳米管具有很好的荧光强度，且分布均匀。
图2为异硫氰酸荧光素标记的二氧化钛纳米管的TEM图片
图3为红外光谱分析，其中实线为未修饰的二氧化钛纳米管光谱分析，虚线为异硫氰酸 荧光素修饰后的二氧化钛纳米管光谱分析。硫氰酸荧光素修饰后的二氧化钛纳米管在1055.93 cm—1处出现一强吸收峰，同时在1384.58 cm'1是OS双键的伸縮振动吸收区域出现了吸收峰， 如图虚线所示。而没有修饰FITC的二氧化钛纳米管没有这些吸收峰，说明FITC成功标记在 了二氧化钛纳米管表面。
图4为异硫氰酸荧光素修饰后的二氧化钛纳米管的X射线衍射图，图a为未修饰的二氧 化钛纳米管，图b为修饰了 FITC的二氧化钛纳米管。由图中的二氧化钛特征峰可以看出为 红金石结构，可以清楚的看到，未修饰的二氧化钛纳米管与修饰了 FITC的纳米管的结构是 相似的，二氧化钛都是以红金石单一结构出现。除了出现了钛的特征峰外，图谱上出现了硅 的特征峰，可以定性说明Ti02的表面有Si02的存在。说明在荧光修饰过程中，二氧化钛表面
包覆了的Si02以非晶态存在。
图5为紫外光谱分析图，实线和虚线分别为未修饰的与异硫氰酸荧光素修饰后的二氧化 钛纳米管紫外光谱分析图。二氧化钛纳米管在250-400 nm之间的紫外区有强吸收；在400-500 nm之间的长波区有弱的吸收。未标记的二氧化钛纳米管在350 nm处有较强的吸收峰，而标 记了 FITC的二氧化钛纳米管在350 nm处吸收峰变弱，说明在标记FITC过程中，非晶体硅 以Ti-O-Si键存在于二氧化钛纳米管的表面。
细胞试验
将标记后的二氧化钛纳米管经过离心分离，用PBS稀释溶解后可直接用于细胞试验。在 激光共聚焦专用培养皿了加入一定量的Ti02-FITC，孵育3h， 48 h后，使用DAPI (4，6-联脒 -2-苯基巧|哚二盐酸盐)染核，最后利用激光共聚焦显微镜直接观察二氧化钛纳米管在细胞中 的定位(见附图6、 7)，图中显示蓝色为染色后的细胞核，绿色为异硫氰酸荧光素标记的二 氧化钛纳米颗粒。可以看出，利用激光共聚焦显微镜可以直观的观察到二氧化钛纳米管在细 胞中的定位，其首先聚集在细胞核周围，最终进入细胞核。
权利要求
1、一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与异硫氰酸荧光素化合物的合成(FITC-APTS)用36.3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS，d＝0.949)、2.625mg异硫氰酸荧光素(FITC)与0.5ml的重蒸后的分析纯无水乙醇，放置于洁净的三颈烧瓶中共同混合；在氮气保护下使其反应，反应在磁力搅拌下进行，反应时间为12～15小时；在FITC-APTS两物质的合成过程中要避光，避免光漂白；所述反应的反应方程式如下b.异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管(TiO2-FITC-NTS)用1ml氨水和30ml重蒸乙醇混合在100ml的圆底烧瓶中，用磁力搅拌机进行搅拌，并调节pH值，5分钟后加入3mg二氧化钛纳米管和50ul四乙氧基硅烷(TEOS)，2分钟后加入1.4ml氨水，调节pH值至11.85，10分钟后加入100ul已标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(FITC-APTS)，继续磁力搅拌24～30小时；其具体反应方程式如下最终得到异硫氰酸荧光素标记或修饰的二氧化钛纳米管(TiO2-FITC-NTS)。
2、 一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法所得到的异硫氰酸荧光素二氧化钛纳米 管(Ti02-FITC-NTs)的用途是研究其在细胞中的定位、迁移、代谢等分子生物活动过程; 可直接用于细胞生物试验。
全文摘要
本发明涉及一种异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管的方法，属生物医学分子生物学及纳米技术领域。本发明的方法过程如下(1)用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)与异硫氰酸荧光素(FITC)合成一种化合物FITC-APTS；(2)用所得的异硫氰酸荧光素标记二氧化钛纳米管，得到TiO<sub>2</sub>-FITC-NTS，即异磁氰酸荧光素二氧化钛纳米管。利用该物可研究其在细胞中的定位、迁移、代谢等分子生物活动过程。
文档编号C12Q1/02GK101525154SQ20091004830
公开日2009年9月9日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者琼 卢, 吴明红, 张海娇, 文燎勇, 正 焦, 佳 王, 王艳丽, 程善君, 婧 阎, 陈欣欣 申请人:上海大学