Gap启动子文库及其用途的制作方法

专利名称：Gap启动子文库及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及用于毕赤酵母的GAP启动子文库。
背景技术：
通过基因操作优化细胞代谢网络的代谢工程(Metabolic Engineering)正在成为 生物化工领域一个非常重要的前沿研究方向。但是，面对微生物细胞内由基因、蛋白、代谢 物、各种信号分子及它们之间相互作用组成的复杂动态网络，代谢过程的分析和调控非常 复杂和困难。只有通过对基因表达进行精密的微调来研究其对细胞表型和代谢流的影响， 才能从中解析出关键的可供改造的代谢节点。因此，精确的“开量”式基因微调是开展代谢 工程研究非常重要的先进手段，对其开展研究具有重要的科学意义广泛的应用空间。启动子(Promoter)是基因表达调控最常用的元件。但是，无论是组成型 (Constitutive)，还是诱导型(Inducible)启动子，都无法在一个较宽的范围内对基因表 达强度进行连续的调控。尽管诱导型启动子可通过诱导时间和诱导物浓度在一定程度上调 控基因的表达，但这种调节的本质还是“开关”控制，只能调控基因转录的开始和停止，即调 节转录时间的长短而非转录强度的高低。而诱导物浓度效应往往只是增加群体中基因表达 的细胞数而非各单个细胞的表达水平，不具体表达的均一性。此外，从实际工业应用的角度 考虑，由于诱导物的价格一般较贵，且细胞对诱导物具有高度敏感性，其可操作性不强。正 是由于这些缺陷，近些年来研究者开发了启动子文库(Promoter Library)用以作为对基因 表达更为灵活和精确的调控工具。启动子文库就是对调控基因转录的启动子碱基序列进行突变，通过报告基因 (Reporter Gene，如绿色荧光蛋白GFP基因、半乳糖苷酶基因LacZ等)的表达水平，筛选得 到的一系列不同强度的人工启动子集合体。由于启动子的碱基序列直接影响其调控基因 转录的强度，故只要所构建的文库包含足够丰富的突变序列，筛选量足够大，就可以从中筛 选出一系列具有不同调控强度的突变启动子，构成能对其下游基因实施“开量”式微调的文 库。启动子文库出现后即被应用于代谢工程的研究，并已在多方面显示了其强大的功 能。首先，启动子文库实现了对基因表达“开量”式微调，显著优于利用单一启动子的“开 关”式调控。Solem等人利用启动子文库，在乳酸乳球菌(Lactococculs latis)中，不仅对 糖酵解途径Pfk基因，还对位于同一操纵子内的另外两个基因(pyk和Idh)实现了强度递 增的表达调控。其次，启动子文库可用于代谢分析，使人们能更准确地定位代谢控制节点。 Keobmann等在大肠杆菌糖酵解途径的研究中，利用启动子文库调控F1-ATP合成酶表达，发 现逐渐提高ATP酶活水平和ATP的水解，可使糖酵解通量提高70%，表明糖酵解途径的主 要调控因素是ATP水平，并非途径本身各反应的酶活。第三，启动子文库也可用于寻找多基 因调控合成途径的限制性因素。Alper等在研究蕃茄红素的合成时，发现在野生菌中提高 dxs基因(deoxy-xylulose-p synthase，脱氧-磷酸木酮糖合成酶)的表达，只能在一定程度上提高蕃茄红素的产量，而在过表达该合成途径下游两个酶的重组菌中，不断增强dxs 基因表达能使蕃茄红素产量不断提高，说明脱氧_磷酸木酮糖合成酶活是重组菌合成途径 的限制性因素。第四，启动子文库还可用于确定代谢控制的最优化基因调控水平。Nevoigt 等在分析3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)基因GPDl对酿酒酵母甘油产率的影响时发现，通过突 变启动子控制GPDH的酶比活变化不超过其野生型的2倍时，菌体的生物量和甘油产率均与 GPDH活性正相关，但多拷贝基因的过表达，非但不能使甘油产率相应增加，还对细胞生长产 生抑制，因此在代谢改造中可通过突变启动子文库来精确微调基因表达水平以达到最优化 控制。可见，通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和 改造中，突破了原来只能通过基因敲除(Knock out)和过表达(Over expression)两种非 “开”即“关”的手段来实现对细胞基因型的扰动(Perturbation)，即可通过对目标基因表 达进行梯度式的精确微调来分析和控制其对表型和代谢流分布的影响。此外，对这一工具 的利用还可发展到使用文库中的不同启动子，对多个基因的表达同时进行调控。因此，启动 子文库正在成为代谢工程研究向系统分析和整体优化发展中的有效研究工具，将极大地提 升该领域的研究水平。

发明内容
本发明的目的在于提供用于毕赤酵母的GAP启动子文库及其用途。本发明的另一目的在于提供筛选突变型GAP启动子的方法。在本发明的第一方面，提供一种突变型GAP启动子文库，所述的启动子文库包括 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6 或 SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的启动子。在一个优选例中，所述的SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的启动子具有依次减弱的启动 目的基因表达的强度。在另一优选例中，所述的SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的启动子相对于野生型 GAP 启动子是增强型 GAP 启动子；所述的 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的启动子相对于野生型GAP启动子是 弱化型GAP启动子。在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :7 所示的核苷酸 序列，作为启动子元件。在一个优选例中，所述的载体还含有与所述的启动子元件可操作地连接的目的基 因。在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)结构基因、编码具有特定功 能的蛋白的基因、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。在另一优选例中，所述的目的基因位于启动子元件的下游，且与所述启动子的间 隔小于2000bp ；较佳的小于IOOObp ；更佳地小于500bp,如小于200bp,小于IOObp，小于 50bp。
在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO -J所示的核苷酸序列的核酸。在一个优选例中，所述的细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)细胞。在本发明的第四方面，提供所述的突变型GAP启动子文库的用途，用于提供突变 型GAP启动子，将所述突变型GAP启动子可操作性地与目的基因连接，调节目的基因的表 达。在本发明的第五方面，提供一种筛选突变型GAP启动子的方法，所述的突变型GAP 启动子相对于野生型GAP启动子、启动目的基因表达的强度发生变化(包括增强表达或弱 化表达)，所述方法包括(1)提供重组表达载体1，所述重组表达载体1含有GAP启动子突变体序列，以及 与所述GAP启动子突变体序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体1转化宿主 细胞，获得重组宿主细胞1，用BMD培养基培养该重组宿主细胞1 ；(2)提供重组表达载体2，所述重组表达载体2含有野生型GAP启动子序列，以及 与所述野生型GAP启动子序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体2转化宿主 细胞，获得重组宿主细胞2，用BMD培养基培养该重组宿主细胞2 ；(3)观察所述的重组宿主细胞1表达报告基因的情况，若相对于重组宿主细胞2， 重组宿主细胞1报告基因的表达强度发生变化(优选有统计学意义的变化)，则该重组宿主 细胞1中重组表达载体1携带的GAP启动子突变体为所需的突变型GAP启动子。在一个优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)细胞。在另一优选例中，所述的报告基因选自但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增效的绿 色荧光蛋白(EGFP)或半乳糖苷酶基因LacZ。在另一优选例中，所述的重组宿主细胞1和重组宿主细胞2的培养条件是 30 士 2°C，200 士 lOOrpm。在另一优选例中，步骤(1)所述的重组宿主细胞1与步骤(2)所述的重组宿主细 胞2培养条件相同。在另一优选例中，步骤(3)中，若相对于重组宿主细胞2，重组宿主细胞1报告基 因的表达强度发生显著增强(如增强10%以上，较佳的增强20%以上，更佳的增强30%以 上)，则该重组宿主细胞1中重组表达载体1携带的GAP启动子突变体相对于野生型GAP启 动子是增强型GAP启动子。在另一优选例中，步骤(3)中，若相对于重组宿主细胞2，重组宿主细胞1报告基 因的表达强度发生显著弱化(如弱化10%以上，较佳的弱化20%以上，更佳的弱化30%以 上)，则该重组宿主细胞1中重组表达载体1携带的GAP启动子突变体相对于野生型GAP启 动子是弱化型GAP启动子。在另一优选例中，步骤(1)或(2)中，用BMD培养基培养重组宿主细胞(重组宿主 细胞1或重组宿主细胞2)的方法包括(a)用BMD培养基A预培养该重组宿主细胞30_50小时(更优选36_48小时)；其 中，所述的BMD培养基A中葡萄糖浓度0. 2 士 0. 05% ；
(b)将经预培养的重组宿主细胞转移到BMD培养基B，培养30_65小时(较佳地 36-48小时)；其中，所述的BMD培养基B中葡萄糖浓度1 士0.2%。在另一优选例中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)，且步骤(2)中，观察所 述的重组宿主细胞表达报告基因的情况的方法包括测定含有所述的重组宿主细胞的培养 基的荧光强度。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图1、重组质粒pGHg构建示意图。图2、重组质粒鉴定。A、重组质粒pGAPZAgfp酶切和PCR验证。泳道1 :Not I和SalI双酶切验证；泳道 2 用引物 GFP F 和 GFP R PCR 验证；M :DNA marker B、重组质粒pGAPg酶切验证。M =DNA Marker ；泳道1 :SpeI和Not I双酶切验证。C、重组质粒pGHg酶切和PCR验证。M =DNA Marker ；泳道1 =SpeI和Not I双酶切验证；泳道2 用引物GAP primer和 GFP R PCR 验证。图3、质粒pGH图谱及构建示意图。图4、重组质粒pGH酶切和PCR验证。泳道1 :PCR验证；泳道2 重组质粒pGH经 HindIII 酶切；M :DNA Marker。图5、荧光酶标仪和和重组菌G/GHg表达GFP荧光强度。A、荧光酶标仪GFP荧光强度。B、流式细胞仪测定GFP荧光强度。1 :G/GH ；2和3 G/GHg0图6、48孔深孔板中不同培养基BMD、BSM、BMDY, YPD对重组菌生长影响。A、重组菌G/PHg于30°C，200rpm,培养60h，测定细胞密度0D6(1。。B、重组菌G/GHg于30°C，200rpm,培养60h，测定细胞密度0D6(1。。图7、不同培养基对重组菌GFP表达影响。流式细胞仪检测重组菌G/PHg和对照菌 G/PH经不同培养基对GFP表达影响。1. YPD培养对照菌G/PH ；2. YPD培养G/PHg ；3. BMD培 养 G/PHg ；4. BSM 培养 G/PHg.图8、筛选模型示意图。图9、48深孔板预培养板中不同接种量对重组菌G/PHg、G/GHg和对照菌生长影响。A、48深孔板预培养板中不同接种量重组菌G/GHg生长情况比较。每孔装 BMD (0. 2 % )900μ L,30°C,200rpm,培养 48h。GHgl 接种量 10 μ L ；GHg2 接种量 20μ L ； GHg3 接种量 30 μ L0B、48深孔板预培养板中不同接种量重组菌G/PHg生长情况比较。每孔装 BMD (0. 2 % )900μ L,30°C,200rpm,培养 48h。PHgl 接种量 10 μ L ； PHg2 接种量 20μ L ； PHg3 接种量 30 μ L。C、48深孔板预培养板中不同接种量对照菌生长情况比较。每孔装 BMD (0. 2% )900μ L，30°C，200rpm，培养 48h。Cl 接种量 10 μ L ；C2 接种量 20 μ L ；C3 接种量 30 μ Lo图10、不同接种时间对重组菌G/PHg、G/GHg在筛选板48孔深孔板生长影响筛选板 48深孔板每孔装900 uL BMD(1% )培养基，预培养板中培养24h、36h、48h分别接种30 μ L 至筛选平板，300C，200rpm,培养60h测定细胞密度0D_。图11、从预培养板接种至筛选板48孔深孔板不同接种量对重组菌生长影响。图12、重组菌 G/GlstHgfρ、G/G2ndHgfp、G/G3thHgfpPCR 验证。(A)泳道 1-10 :G/GlstHgfp ；泳道 11-17 :G/G2ndHgfp ；M :DNA Marker。(B)泳道 1-10 :G/G3thHgfp ；泳道 11-13 :G/G2ndHgfp ；M :DNA Marker。图13、pGAP突变文库调控绿色荧光蛋白在重组毕赤酵母中的表达，显示了试管培 养流式细胞仪检测结果。图14、G1-G7测序结果比对。
具体实施例方式本发明人通过广泛而深入的研究，构建了一个基于GAP启动子的突变型GAP启动 子文库，该文库包括一组分离的启动子，各启动子启动目的基因表达的强度呈现梯度分布。 本发明的启动子文库可实现对目的基因表达的连续微调。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序 列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子提供RNA聚合酶和正确 起始转录所必需的其它因子的识别位点。如本文所用，所述的“GAP启动子文库”是指含有本发明筛选得到的一系列突变型 GAP启动子的核酸集合体。如本文所用，所述的“GAP启动子”简称为pGAP或Ρωρ。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性相连”是指两个或多个核酸区域 或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子被置于相对于目的基因核酸序列的特定位 置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子被“可操作地连接”到该核酸序 列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。本发明对合 适的目的基因没有特别的限制，例如包括但不限于结构基因、编码具有特定功能的蛋白的 基因、酶、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。如本文所用，所述的“增强型GAP启动子”是指相对于野生型GAP启动子(其序列 如SEQ ID N0:8所示)其启动目的基因表达的强度显著增强，例如增强10%以上，较佳的 增强20%以上，更佳的增强30%以上，如增强50%以上、增强80%以上或增强100%以上。 其启动目的基因表达的强度可通过检测目的的基因表达量而得知，表达量的检测是本领域 技术人员熟知的技术。
如本文所用，所述的“弱化型GAP启动子”是指是指相对于野生型GAP启动子其启 动目的基因表达的强度显著弱化，例如弱化10 %以上，较佳的弱化20%以上，更佳的弱化 30%以上，如弱化50%以上、弱化80%以上或弱化100%以上。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质 序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子 对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。启动子文库为了实现对基因表达的连续微调，本发明人经过广泛的研究，筛选到了一组突变 型 GAP 启动子，包括 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的启动子，构成启动子文库，各启动子启动 目的基因表达的强度呈现梯度分布，用于在不同强度下指导目的基因表达。启动子文库的 获得可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统分析。本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而 言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸 序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋 白。例如，当用于表达强度的研究时，所述的目的基因包括但不限于绿色荧光蛋白、 增效的绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ等。“绿色荧光蛋白”具有内源 荧光基团，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。“增 效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白。“荧光素酶”作为一种代表性的 指示基因表达状况的工具，可良好地指示由启动子指导的基因表达情况。作为本发明的优选方式，可以从本发明的启动子文库中选择不同强度的启动子， 分别将它们与待研究的目的基因可操作地连接，或将目的基因与所述的启动子可操作的连 接入合适的载体中，采取适当的方式导入到宿主细胞内，从而获得其中目的基因表达量不 同的一系列细胞。可通过分析这些细胞的代谢情况、表型变化、蛋白表达情况或相互作用情 况、各种信号分子的变化等，来得知该目的基因的功能或用途。作为本发明的优选方式，所述的目的基因可以是一种对于某一细胞而言缺失或表 达量不足的基因，可将该目的基因与本发明的增强性GAP启动子可操作地连接，或将目的 基因与本发明的启动子可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到该细胞内， 从而高水平地表达目的基因。本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因 相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例 如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的 修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信5寸。此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接 到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反 义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。载体和宿主细胞
来自于本发明的启动子文库的任何一种启动子和/或目的基因序列可被包含在 重组载体中。作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含 多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克 隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)引导目的基因转录的启 动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化 信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体”指本领 域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在 宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是酵母 细胞适用的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的 基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化 的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白 (GFP)等。重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的 其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使 其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有酵母，大肠杆菌，动物的组织细胞，植物细胞等。 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优选方式，所 述的宿主细胞是酵母细胞，更优选地，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞。 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。筛选方法本发明还提供了一种筛选突变型GAP启动子的方法，所述的突变型GAP启动子相 对于野生型GAP启动子、启动目的基因表达的强度发生变化(包括增强表达或弱化表达)， 所述方法包括在相同培养条件下，分别培养由GAP启动子突变体启动目的基因表达的宿 主细胞以及由野生型GAP启动子启动目的基因表达的宿主细胞，比较两种细胞中目的基因 的表达强度(或表达量)，若GAP启动子突变体启动目的基因表达与野生型GAP启动子启动 目的基因表达相比表达强度发生显著变化，则该GAP启动子突变体为所需的突变型GAP启 动子。
上述筛选方法中，优选的宿主细胞是酵母细胞，更优选地是毕赤酵母细胞。培养酵 母细胞的条件是本领域人员所熟知的，本发明中没有特别的限制；较佳地，培养酵母细胞的 条件是 30 士 2°C，200 士 lOOrpm。本发明人在研究中发现，尽管多种培养基均可用于本发明中宿主细胞(如酵母细 胞)的培养，但是利用不同的培养基培养宿主细胞，对于后续筛选的灵敏性或准确性有影 响。因此，本发明人针对多种培养基中进行了对比和选择，最终发现，BMD培养基最适合用 于本发明的筛选方法。BMD培养基是本领域人员已知的培养基，其配方如下YNB (酵母基础 氮源)26. 8g/L，生物素0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 10g/L, IOOmM磷酸盐缓冲液(pH 6. 0)配 制。本发明的筛选方法中，在不同的筛选阶段，本发明人还对其中葡萄糖的浓度进行 了调节。因此，作为本发明的优选方式，用BMD培养基培养重组宿主细胞的方法包括(a)用 BMD培养基A预培养该重组宿主细胞30-50小时(更优选36-48小时)；其中，所述的BMD培 养基A中葡萄糖浓度0. 2 士0. 05% ； (b)将经预培养的重组宿主细胞转移到BMD培养基B，培 养30-65小时(较佳地36-48小时)；其中，所述的BMD培养基B中葡萄糖浓度1 士0. 2%。测定培养体系中报告基因的表达情况的方法是本领域技术人员熟知的技术，也可 根据报告基因的不同作出调整。作为本发明的优选方式，所述的报告基因是绿色荧光蛋白 (GFP)，测定该报告基因的表达情况的方法包括测定培养体系中的荧光强度。本发明的主要优点在于(1)本发明通过大量筛选获得了一系列启动子，它们启动目的基因表达的强度呈 现梯度分布，从而建立了 GAP启动子文库；(2)本发明通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析 和改造中，突破了原来只能通过基因敲除和过表达两种非“开”即“关”的手段来实现对细 胞基因型的扰动，即可通过对目标基因表达进行梯度式的精确微调来分析和控制其对表型 和代谢流分布的影响。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、重组菌G/GHg的构建利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因以描述调控其表达的GAP启动子强度。为 了构建报告基因表达载体，便于突变启动子插入，首先利用原始的未经突变的GAP启动子 调控报告基因gfp的表达，构建GFP报告基因表达载体pGHg和相应的重组菌G/GHg，并构建 不含GFP基因的载体pGH和重组菌G/GH作为对照，考察GFP的表达。1、表达载体pGHg的构建和鉴定(1)重组质粒pGAPZAgfp的构建和鉴定
参照图1，以化学全合成的gfp基因(SEQ ID NO 15)为模板，用引物 GFP F(AATGCGGCCGCAAACCCAAGCTTATGTCTAAAGGTGAAGAAT (SEQ ID NO 9))禾口 GFP R(GACGTCGACGCTCCCAAGCTTTTATTTG TACAATTCATCC(SEQ ID NO 10))扩增目的基因 gfp， 经限制性内切酶Not I和Sail双酶切，质粒pGAPZ A(含有野生型GAP启动子；购自 Invitrogen公司)同样方法酶切。经双酶切后gfp片段和载体质粒pGAPZA连接获得重组 质粒pGAPZAgfp。重组质粒pGAPZAgfp用引物GFP F和GFP R进行PCR鉴定，目的片段gfp 约750bp ；Not I和SalI限制性内切酶酶切鉴定，切下目的片段gfp约750bp (如图2A)。(2)重组质粒pGAPg的构建和鉴定质粒pGAPZ A 为模板，正义链引物 GAP F BSpe (AGAAGATCTTCGACTAGTTTTTTGTAGAA ATGTCTTGGT (SEQ ID NO: 11))和反义链引物 GAP R Not (TTAGCGGCCGCAATAGTTGTTCAATTGAT TGAAA(SEQ ID NO :12))，扩增得到的GAP启动子片段经BglII和NotI酶切，连接经同样方 法酶切的载体pGAPZAgfp，获得重组质粒pGAPg。重组质粒pGAPg用SpeI和Not I限制性 内切酶酶切鉴定，切下GAP启动子和载体片段分别为500bp和3kb (如图2B)。(3)重组质粒PGHg的构建和鉴定质粒pGAPg经BglII酶切，并去磷酸化。用限制性内切酶BglII和BamH I酶切 的pA0815质粒(购自Invitrogen公司)片段(4. Okb的HIS4和3，AOX片段)，该片段与 经BglII酶切并去磷酸后质粒pGAPg连接，获得质粒pGHg，SpeI和Not I限制性内切酶酶 切鉴定，切下目的片段约500bp ；用引物GAP primer(TTTCAATCAATTGMCAACTAT(SEQ ID NO: 13))禾口 GFP R (GCAAATGGCATTCTGACATCC (SEQ ID NO : 14)) PCR 鉴定，目的片段约 750bp (如 图 2C)。2、重组质粒pGH的构建和鉴定重组质粒pGHg经限制性内切酶HindIII酶切，回由6. 8kb载体片段经自连，获得 质粒pGH，质粒构建示意图如图3。用GAP启动子正义链引物GAP F BSpeI和3’ AOX引物 PCR鉴定重组质粒pGH，目的片段约750bp，限制性内切酶HindIII酶切验证质粒pGH，线性 化质粒约为6. 8kb，如图4。3、基因工程菌G/GHg和G/GH的构建将构建好的重组质粒pGHg和pGH用限制性酶BspeI酶切线性化后，用乙醇沉淀方 法沉淀DNA，回收后分别电转毕赤酵母GSl 15 (购自Invitrogen公司)，涂布MD平板，30°C 倒置培养3 5天，直到单克隆出现。采用菌落PCR鉴定转化子。MD平板上挑选的10个基因工程菌G/GHg接种到3mL YPG培养基中，30°C，220rpm 培养16h，取ImL菌液保种，ImL菌液5000rpm，离心收集菌体，去离子水洗一次，用20%甘油 重悬菌体，-20°C保存以便样品的后续分析。余下菌液用于测定菌体浓度(OD6tltl)。(1)荧光酶标仪检测GFP荧光强度菌液用PBS(pH7.0)稀释至OD6tltl为1，稀释后样品取250 μ L至96孔板，使用荧光 酶标仪检测GFP荧光强度(激发波长488nm，发射波长505nm)，并检测0D·。检测GFP荧 光强度时，以不表达GFP的基因工程菌G/GH作为对照去除背景干扰。G/GH和G/GHg的GFP 比荧光强度值分别为2246. 5 (RFU)和2349. 3 (RFU)，如图5A，比荧光强度F/0D6(1(1 (RFU/0D6 J 为荧光强度值比上对应细胞密度0D_。(2)流式细胞仪测定GFP荧光强度
将菌体用PBS (pH7. 0)稀释至OD6tltl为0.2，然后经流式细胞仪测定细胞GFP荧光强 度(同样检测条件下以基因工程菌G/GH作为空白对照)。如图5B所示，利用流式细胞仪可 以检测到GFP的特征荧光，构建的重组菌G/GHg能利用GAP启动子调控报告基因gfp的表 达，而且表达的GFP具有活性。可见，通过检测GFP的荧光强度能表征调控其表达的启动子强度。综上，本发明人成功构建了表达载体pGHg，利用组成型启动子GAP调控报告基因 gfp表达，并构建不含GFP基因的载体PGH作为对照。将GFP表达载体pGHg转入毕赤酵母 GSl 15中获得G/GHg，通过PCR、流式细胞仪和荧光酶标仪检测GFP荧光，验证了 gfp基因已 被成功转入重组菌并受启动子GAP调控表达出具有活性的绿色荧光蛋白。以GS115为宿主， 转入不表达gfp的对照载体pGH，得到重组菌G/GH，通过PCR验证载体pGH的转入，获得对 照重组菌G/GH。实施例2、筛选模型的建立1、筛选培养基的确定(1)不同培养基对GFP荧光检测影响以PBS为阴性对照，考察不同培养基对GFP荧光检测的影响。无菌BMD、BMDY、YPD、BSM 培养基(参见 Invitrogen 公司的操作手册A Manualof Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris)禾口 PBS 各取 250 μ L加至96孔板中经荧光酶标仪测定荧光强度(激发波长488nm，发射波长505nm)。 结果发现，BSM培养基对荧光强度测定干扰最小(BSM :537 (RFU) ；PBS 460 (RFU))，其次 是BMD:616(RFU)。无菌培养基BMDY和YPD经荧光酶标仪检测荧光强度最强，分别为 47581 (RFU)和 46499 (RFU)，高出 PBS 检测荧光 100 多倍。BMD、BMDY, YPD、BSM培养基以及PBS配方如下BMD(1%葡萄糖)=YNB 26. 8g/L，生物素 0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 10g/L，IOOmM 磷酸钾缓冲液配制，PH 6.0。BMD (0. 2 % 葡萄糖)=YNB 26. 8g/L，生物素 0. 2g/L，葡萄糖(Dextrose) 2g/L，IOOmM 磷酸钾缓冲液配制，PH 6.0。BMDY 蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L, YNB 26. 8g/L，生物素0. 04g/L,葡萄糖 (Dextrose) 10g/L, IOOmM 磷酸钾缓冲液配制，pH 6. 0。YPD(1%葡萄糖)蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖10g/L。BSM (NH4)2SO4 7. 0g/L, CaSO4 0. 46g/L, K2SO4 9. lg/L, MgSO4 · 7H20 7. 5g/L，葡萄 糖(Dextrose) lOg/L, PTM1 12mL/L。用 0. 2M 的 K2HP04/KH2P04 缓冲液配制，pH5. 5。其中PTM1 =CuSO4 ·5Η20 6g/L，Kl 0. 08g/L, MnSO4 .H2O 3g/L，Na2MoO4 · 2Η200· 2g/L, H3BO3 0. 02g/L, ZnSO4 · 7H20 20g/L, FeSO4 · 7H20 65g/L, CoCl2 · 6H20 0. 5g/L,生物素 0. 04g/ L, H2SO4 5mL/L。PBS :pH7. 0 =NaCl 8g/L，KCl 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 42g/L, KH2PO4 0. 27g/L，盐酸调 pH 至 7· 0。(2)不同培养基对菌体生长的影响本发明人分别考查了四种培养基BMD、BSM、BMDY、YPD (碳源均为葡萄糖)对重 组菌G/PHg和G/GHg生长影响。48孔深孔板每孔装900 μ 1培养基，每种培养基作三个平行复孔。48孔深孔板培养36小时，取30 μ L接种至含有对应培养基的另一 48孔深孔板， 30°C,200rpm,培养60h，测定细胞密度OD6tltl,结果如图6。可见，无论是G/PHg和G/GHg重 组菌，四种培养基中YPD和BMDY对菌体生长最有利，培养60h后0D_达到17左右；相对而 言，BSM和BMD培养60h后细胞密度OD600分别为12和9。(3)不同培养基对重组菌GFP表达影响鉴于BSM和BMD培养基对GFP荧光强度测定干扰极小(BSM 537 (RFU) ；BMD 616 (RFU))，本实验主要考查了 BSM和BMD培养基(葡萄糖含量均为1%)对GFP表达影响。 48孔深孔板每孔装900 μ L培养基，每种培养基分别作三个平行复孔，G/PHg、G/PH、G/GHg 和G/GH经48深孔板培养36h分别接种30 μ L至装有对应培养基的另一 48深孔板，30°C， 200rpm,培养60h，测定细胞密度0D_，经荧光酶标仪测定荧光强度(激发波长488nm，发射 波长505nm)，流式细胞仪检测GFP荧光强度。比较重组菌G/GHg和对照菌G/GH分别经BSM和BMD培养60h后GFP比荧光强度 (F/0D_)，可见当用BSM培养基培养时，G/GHg和对照菌G/GH的GFP比荧光强度几乎一致， 无法区分；当用BMD培养基培养时，G/GHg和对照菌G/GH的GFP比荧光强度相差约300 (RFU/ OD600)，基本能区分，G/GHg的GFP比荧光强度为2456 (RFU/0D_)，G/GH检测到比荧光强度为 2155(RFU/0D_)。比较重组菌G/PHg和对照菌G/PH分别经BSM和BMD培养60h后比荧光强度(F/ OD600)，可见无论是用BSM培养基还是BMD培养基，G/PHg和对照菌G/PH的GFP比荧光强度 均能显著区分，在利用BMD培养基时，G/PHg (8029 (RFU/0D_))与对照菌G/PH检测到的比荧 光强度(2246 (RFUA)D6J)差异更显著接近4500 (RFU/0D6 J ；相对而言，使用BSM培养基时 两者差异较小约1500(RFU/0D_)，G/PHg的GFP比荧光强度为3528 (RFU/0D6 J，G/GH检测 到的比荧光强度为1982(RFU/0D_)。同样的，经流式细胞仪检测经BSM和BMD培养60h的 G/PHg和对照菌G/PH荧光强度，结果与用96孔板经荧光酶标仪检测的结果一致，且用BMD 培养基与使用YPD培养基表达GFP效果一样，如图7。2、筛选条件的确定(1)保种板接种到预培养(pre-culture)不同接种量对细胞生长影响预培养板48孔深孔板每孔装900yL BMD (0. 2 %葡萄糖)，分别从保种板 (masterplate)取 10 μ L、20 μ L、30 μ L 菌液至预培养板，30 °C，200rpm，培养 48h,每间隔 12h (Oh、12h、24h、36h、48h)取样测细胞密度 OD600，如图 8。本实验主要考查从预培养接种至筛选板48孔深孔板不同接种量对重组菌G/PHg、 G/GHg和对照菌生长影响。实验结果表明即使初始接种量不同(IOyL 30yL)，但对重 组菌的生长无影响。对重组菌G/PHg、G/GHg和对照菌，初始接种量为10 μ L、20 μ L或30 μ L 时生长曲线趋势保持一致如图9A-C。从图9可知，无论接种是多少，不同的重组菌在培养 24h后，都从对数生长期过渡至平稳期，48h细胞已经停止生长，到48h细胞密度虽稍微有下 降趋势，细胞密度0D_最终维持在同一水平(0D_ = 3.5 4.0)。所以，初始接种量范围 在10 μ L 30 μ L均可，考虑到实验操作方便性(排枪最小量程为30 μ L)，后继实验采用接 种量为30 μ Lo(2)预培养接种至筛选板不同接种时间对细胞生长影响筛选板48孔深孔板每孔装900 μ L BMD (1 %葡萄糖)，分别将预培养板中培养24h、36h、48h 菌液取 30 μ L菌液至筛选板，30°C，200rpm,培养 60h，每间隔 12h (Oh、12h、24h、36h、 48h、60h)取样测细胞密度0D_。本实验主要考查从预培养板接种至筛选板48孔深孔板不同接种时间对重组菌G/ PHg, G/GHg生长影响。实验结果表明预培养板培养24h、36h、48h分别接种30 μ L至筛选 板，即使接种时间不同，但对重组菌的生长并无影响，经过筛选板培养60h后各重组菌细胞 密度OD600最终达到同一水平(OD600 = 8 . 3 8. 5)。可见，接种时间在24h 48h范围对重 组菌生长无影响，但考虑到预培养板培养48h刚达到平稳期并且0D_最终维持在同一水平 (OD600 = 3 . 5 4. 0)(如图10)，所以36h为从预培养板接种至筛选板48深孔板最佳时间 点，后继实验采用接种时间均为36h。(3)预培养板接种至筛选板不同接种量对细胞生长影响筛选板48孔深孔板每孔装900 μ L BMDl %，分别将预培养板培养36h菌液取 10μ L、20y L、30y L、50y L 菌液至筛选板，30°C，200rpm，培养 60h,每间隔 12h(0h、12h、 24h、36h、48h、60h)取样测细胞密度 0D6。。。比较从预培养板接种至筛选板48孔深孔板不同接种量对重组菌G/PHg、G/GHg和 对照菌生长影响，实验结果表明预培养板培养36h分别接种10 μ L、20 μ L、30 μ L至筛选 板，虽接种量不同但生长曲线并无明显差异，经过筛选板培养24h均从对数长期过渡到平 稳期，36h到60h后各重组菌细胞密度0D_始终维持在8左右；当接种量提高至50 μ L时， 12h内就达到了平稳期，此后OD6tltl维持在9(如图11)。所以，从预培养板接种至筛选板48 深孔板接种量范围在10 30 μ L，对重组菌的生长并无影响，综上因素及考虑到实验操作 方便性(使用排枪最小量程为30 μ L)，后继实验采用接种量为30 μ L。3、结果和讨论利用48孔深孔板筛选启动子文库，首先考查了四种培养基BMD、BSM、BMDY、YPD对 重组菌生长影响，实验结果表明，四种培养基中YPD和BMDY对菌体生长最有利，培养60h后 OD600达到17左右；相对而言，利用BSM和BMD培养基60h后，细胞密度0D_较小分别为12 和9。在经过48孔深孔板筛选后，须将深孔板中样品一一对应稀释(0D·为0. 2-1)并转移 至96孔板，以便于报告蛋白荧光强度和细胞密度的测定，因此细胞密度太高并不利于后继 实验操作(0D·和荧光强度检测)，利用BSM和BMD培养60h后，OD6tltl范围均在10内，只需 将样品稀释10倍OD6tltl = 0. 2-1，便于检测，所以四种培养基中BMD和BSM较适用于48孔深 孔板筛选。在检测四种培养基BMD、BSM、BMDY, YPD对GFP荧光强度检测干扰时，发现BSM培 养基对荧光强度测定干扰最小(BSM 537 (RFU) ；PBS 460 (RFU))，其次是BMD 616 (RFU)。无 菌培养基BMDY和YPD经荧光酶标仪检测荧光强度最强是PBS (460/RFU)的100倍。因此培 养基BMD和BSM有利于报告蛋白GFP荧光强度测定，而BMDY和YPD对于检测的干扰太大， 不适于48孔深孔板筛选培养基。鉴于BSM和BMD培养基对GFP荧光强度测定干扰极小且利用这两种培养基细胞 密度不至于太高，随后主要考查了这两种培养基对重组菌GFP表达影响，实验结果表明用 BMD与YPD培养基重组菌表达GFP水平一致，而用BSM重组菌表达GFP的水平明显弱于前 者。因此，利用48孔深孔板筛选启动子文库，最适培养基为BMD。通过实验证明表达GFP的重组菌，当0D_在0.2-1范围内，其GFP荧光强度与细胞密度0D_成线性关系；不表达GFP对照菌检测到的荧光强度与细胞密度无关；可通过计 算比荧光强度，评估表达GFP的重组菌与对照菌的GFP荧光强度的差异，从而评估重组菌调 控GFP表达的启动子强度。利用48孔深孔板作为启动子文库的筛选工具操作流程如下(1)首先将涂布于MD筛选平板上的突变菌的单菌落培养至直径约3mm大小。(2)保种板48孔深孔板中每孔装600 μ L YPD，挑取MD平板上直径3mm单菌落至孔板中，一个 单菌落对应一个孔，300C，200rpm,培养24h，然后每孔加入60%甘油300 μ L，30°C，200rpm, 培养30min，制备成甘油保藏的master plate，最后将master-plate置于-80保存以便后 继实验使用。(3)预培养预培养板48孔深孔板每孔装900 μ L BMD (0. 2%葡萄糖)，取master-plate培养 24h的菌液30 μ L至对应的预培养板的孔板中，300C，200rpm,培养36h，预培养板各深孔中 细胞密度基本一致(各孔间0D_均一性)。(4)蹄选筛选板48孔深孔板每孔装900 μ L BMD (1 %葡萄糖)，从预培养板的孔中取30 μ L 菌液至筛选板，30°C，200rpm，培养36h，利用筛选板以筛选出具有不同启动子强度的重组细 胞。实施例3、GAP启动子突变文库的构建为了构建启动子文库，获得启动子强度范围较宽且启动子强度成梯度变化的突变 启动子，必须得到具有丰富突变的启动子和快速有效筛选突变体的方法。易错PCR(EP-PCR) 是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法。其基本原理是通过改变传统PCR反 应体系中某些组分的浓度(如dNTP和Mg2+的浓度)，使碱基在一定程度上随机错误引入而 创造序列的多样性。易错PCR的关键在于选择适当的突变频率，一般有益突变的频率很低， 绝大多数突变是有害的或中性的。当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；当突变频 率太低，则未发生任何突变的野生型在突变群体中将占优势，也很难筛选到理想的突变体。 一般Ikb目标基因内有1.5 5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想。所以，本发明人 的首要任务是确定突变频率在1 % 5 % (GAP是500bp，按1 % 5 %计算，碱基突变个数为 5 25)范围的EP-PCR反应条件。为了快速有效筛选到有效的突变体，用突变启动子调控 报告基因gfp的表达，构建突变表达载体和相应的重组菌，将重组菌置于48深孔板中培养， 利用荧光酶标仪进行高通量快速筛选。1、GAP启动子的突变很多研究显示，易错PCR的突变率受Taq酶保真性的影响。加入Mn2+后，Taq酶 保真性随着反应体系中Mg2+的浓度增加而降低。不同dNTP的配比浓度也影响Taq酶保真 性。其中，Mn2+浓度通常0. 5mM，而Mg2+的浓度随着对突变率的要求不同，会有不同的浓度， 通常为2 10mM。为了优化易错PCR的反应条件，以达到需要的突变率(1% 5% )，本发 明人以不同的Mg2+浓度4mM、6mM、8mM和IOmM分别进行了易错PCR反应，每个Mg2+浓度各 挑选十个突变克隆测序并统计其突变率。Mg2+离子浓度为4mM时所产生的突变率较低只有 0.7%，而Mg2+离子浓度为IOmM时产生的突变率为1. 5%较适中能满足实验要求。经过三轮EP-PCR突变率达到4. 1 %。4mM、6mM、8mM和IOmM的Mg2+浓度易错PCR反应突变率分别 为 0. 3%,0. 7%,0. 8%, 1. 5%。为了增加易错PCR的突变率，本发明人在第一轮易错PCR的基础上又进行了第 二和第三轮的易错PCR。考虑到实验希望达到的突变率，实验中，EP-PCR反应体系的Mn2+、 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 浓度固定不变分别为 0. 5mM、0. 2mM、0. 2mM、ImM、ImM。每轮易错 PCR 的Mg2+离子浓度都定为10mM。第二和第三轮EP-PCR的模板分别为第一轮EP-PCR和第二 轮EP-PCR的回收产物。经过三轮EP-PCR，突变率可达到3 % -4. 1 %。2、GAP启动子突变文库的构建(1)重组毕赤酵母细胞库的构建突变的启动子GAP分别用限制性内切酶SpeI和Not I双酶切，将该片段与同样经 SpeI和Not I双酶切后载体pGHg分别连接，转化DH5 α，获得混合克隆D/GlstHg、D/G2ndHg和 D/GMHg。最终获得重组混合质粒pGlstHg、pG2ndHg和pGMHg。重组混合质粒分别用限制性酶 BspeI酶切线性化，电转毕赤酵母GS115，获得转化子G/GlstHg、G/G2ndHg和G/GMHg。转化后 涂布MD平板，30°C倒置培养3 5天，直到单克隆出现。采用菌落PCR鉴定转化子，PCR所 用引物分别为GAP primer和gfp R0阳性克隆PCR条带理论大小约SOObp (如图12)。所 有阳性重组菌构建成毕赤酵母GAP突变启动子细胞库。(2)突变启动子文库筛选利用48孔深孔板作为启动子文库的筛选工具，按照图8的操作流程筛选出具有不 同启动子强度的重组细胞。利用7块48深孔板筛选了 300个突变启动子重组细胞，获得了 强度成梯度分布的PeAP突变文库，表1为启动子文库调控绿色荧光蛋白在重组毕赤酵母中 的表达强度经荧光酶标仪检测结果。并将该突变启动子文库中的7个突变启动子经PCR克 隆至T载体测序。测序结果如图14突变启动子文库中的7个突变启动子(Gl，G2，G3，G4， G5，G6，G7)多核苷酸序列均存在差异，可得出结论，文库中突变启动子强度的差异确实是由 于pGAP序列的突变引起。表l、pGAP突变文库调控绿色荧光蛋白在重组毕赤酵母中表达 将Gl，G2，G3，G4，G5，G6和G7细胞用试管培养后经流式细胞仪检测GFP荧光强度， 如图13，其结果与荧光酶标仪检测结果一致，可见能将48深孔板900 μ L放大至试管3mL， 再一次证明了文库中突变启动子强度的差异确实是由于pGAP序列的突变引起。启动子文 库的获得可保证对所调控基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统分析。(3)突变启动子序列分析通过对突变启动子文库中Gl (SEQ ID NO 1), G2 (SEQ ID NO 2), G3 (SEQ ID NO: 3)，G4(SEQ ID NO :4)，G5(SEQ ID NO :5)，G6(SEQ ID NO 6)和G7(SEQIDN0 7)的序列分析， 见图14，发现这7个突变启动子突变的碱基分布较平均，突变率分别为3. 35%,2.31%, 1.89%, 2. 73%,1.26%, 2. 10%和2. 52%。因此，所构建的突变启动子文库中启动子的突变
较丰富。
综上，通过调整EP-PCR反应体系中Mg2+浓度，获得了适中的EP-PCR突变率，当Mg2+ 浓度为IOmM时，EP-PCR突变率达到1. 3%。经过三轮EP-PCR，碱基的突变率在1. 3% -4% 范围。本实施例完成了 GAP启动子文库的构建和筛选，通过对重组细胞表达GFP蛋白荧 光的检测，获得了一系列强度梯度改变的启动子，还筛选到启动子强度比未突变启动子GAP 强度略高的突变子。根据筛选结果，将突变后启动子从重组细胞中经PCR克隆进行测序，分 析其突变率及位置，发现突变的碱基均不同。实验结果表明突变启动子文库中的7个突变 启动子多核苷酸序列均存在差异，可得出结论，文库中突变启动子强度的差异确实是由于 PGAP序列的突变引起；经荧光酶标仪和流式细胞仪检测，pGAP突变文库调控绿色荧光蛋白 在重组毕赤酵母中表达量呈梯度似变化。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
0183]序列表
0184]<110>华东理工大学
0185]<120>GAP启动子文库及其用途
0186]<130)092605
0187]<160>15
0188]<170>PatentIn version 3.3
0189]<210>1
0190]<211>477
0191]<212>DNA
0192]<213>人工序列
0193]<221>misc_feature
0194]<223>突变型GAP启动子
0195]<400>1
0196]tttttgtaga aatgtcttgg tgtcctcgtc caatcaggta gccgtctctg aaatatctgg 60
0197]ctccgttgca actccgaacg acctgcaggc aacgtaaaat tctctggggt aaaacctaaa 120
0198]tgtggagtaa tggaaccagg aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttact 180
0199]gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgtt 240
0200]cttcccagca ttacgttgcg ggtaatacgg aggtcgagta cccgacctag cagcccaggg 300
0201]atggaaaagt cccagccgtc gctggcaata atagcgggcg gacgcatgcc atgagtttat 360
0202]tggagaccac cagaatcgaa tataaaaggc gaacaccttt cccaatgttg gtttctcctg 420
0203]acccaaagac tttaaatcta atttatctgt ccctatttca atcaattgaa caactat477
0204]<210>2
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0206]<212>DNA
0207]<213>人工序列
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aaagaagatg gtaacatttt aggtcacaaa420
tacatcatgg ctgacaaaca aaagaatggt480
attgaagatg gttctgttca attagctgac540
ggtccagtct tgttaccaga caaccattac600
ccaaacgaaa agagagacca catggtcttg660
catggtatgg atgaattgta caaataa71权利要求
一种突变型GAP启动子文库，其特征在于，所述的启动子文库包括SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的启动子。
2.如权利要求1所述的启动子文库，其特征在于，所述的SEQID N0:1、SEQ IDNO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 所示核苷酸序列 的启动子具有依次减弱的启动目的基因表达的强度。
3.如权利要求1所述的启动子文库，其特征在于，所述的SEQID NO :1所示核苷酸序列 的启动子相对于野生型GAP启动子是增强型GAP启动子；所述的SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 所示核苷酸序列的启动子相 对于野生型GAP启动子是弱化型GAP启动子。
4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQID NO :3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列，作为启动子 元件。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求4所述的载体；或其基因组中整合有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的核酸。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母 (PichiaPastoris)细胞。
7.权利要求1所述的突变型GAP启动子文库的用途，其特征在于，用于提供突变型GAP 启动子，将所述突变型GAP启动子可操作性地与目的基因连接，调节目的基因的表达。
8.一种筛选突变型GAP启动子的方法，所述的突变型GAP启动子相对于野生型GAP启 动子、启动目的基因表达的强度发生变化，其特征在于，所述方法包括(1)提供重组表达载体1，所述重组表达载体1含有GAP启动子突变体序列，以及与所 述GAP启动子突变体序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体1转化宿主细胞， 获得重组宿主细胞1，用BMD培养基培养该重组宿主细胞1 ；(2)提供重组表达载体2，所述重组表达载体2含有野生型GAP启动子序列，以及与所 述野生型GAP启动子序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体2转化宿主细胞， 获得重组宿主细胞2，用BMD培养基培养该重组宿主细胞2 ；(3)观察所述的重组宿主细胞1表达报告基因的情况，若相对于重组宿主细胞2，重组 宿主细胞1报告基因的表达强度发生变化，则该重组宿主细胞1中重组表达载体1携带的 GAP启动子突变体为所需的突变型GAP启动子。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤⑴或⑵中，用BMD培养基培养重组 宿主细胞的方法包括(a)用BMD培养基A预培养该重组宿主细胞30-50小时；其中，所述的BMD培养基A中 葡萄糖浓度0. 2 士 0.05% ；(b)将经预培养的重组宿主细胞转移到BMD培养基B，培养30-65小时；其中，所述的 BMD培养基B中葡萄糖浓度1 士0. 2%。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的报告基因是绿色荧光蛋白，且步骤(2)中，观察所述的重组宿主细胞表达报告基因的情况的方法包括测定含有所述的重组 宿主细胞的培养基的荧光强度。
全文摘要
本发明涉及GAP启动子文库及其用途。本发明公开了GAP启动子文库中各启动子的核酸序列，含有所述核酸序列的载体和宿主细胞。本发明还公开了筛选所需的突变型启动子的方法。本发明建立了有效的筛选模型，获得了强度成梯度分布的突变型GAP启动子文库，可实现对目的基因表达的连续微调。
文档编号C12N1/19GK101922047SQ200910053198
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者储炬, 庄英萍, 张嗣良, 秦秀林, 肖慈英, 钱江潮 申请人:华东理工大学