专利名称：：一种过氧化物酶固定化效果的评价方法
技术领域：
：本发明涉及酶工程，具体涉及一种过氧化物酶固定化效果的评价方法。
背景技术：
：固定化酶，就是将酶分子结合在特定的支持物上且不影响酶的功能。用于固定酶的底物有琼脂糖、丙烯酰胺、藻酸钠等。固定化酶技术的应用，实现了酶制剂的循环反复使用。目前，评价酶固定化效果的方法大多采用直接测定方法，如光度法。这种方法大多是通过检测酶催化反应得到的有色物质的多少，来反映固定化酶酶活的高低。然而，由于酶固定化载体大多为多孔性物质，对有色物质有吸附作用，所以使用这种方法对固定化酶固定化效果进行评价的结果不准确。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种过氧化物酶固定化效果的评价方法。本发明的过氧化物酶固定化效果的评价方法包括下列步骤-1)过氧化物酶固定化取过氧化物酶酶液，将其固定于固定化载体上，固定化反应完成后，检测未固定上的残留酶液的过氧化物酶总酶活；2)取与步骤1)来源相同的过氧化物酶酶液，以相同体积的该过氧化物酶酶液作为参比，除不使用固定化载体外，与步骤1)采用完全相同的固定化反应条件同步进行固定化反应，在与步骤1)经历相同的固定化反应时间后，检测参比的过氧化物酶总酶活；3)计算步骤1)获得的残留酶液的总酶活与步骤2)获得的参比的总酶活的比例得到残余酶活比例。所述固定化载体可为各种常规的固定化载体，如强酸性阳离子树脂、弱酸性阳离子树脂、强碱性阴离子树脂、弱碱性阴离子树脂等。所述步骤l)中的残留酶液是指固定化反应完成后的酶液。所述固定化反应条件可为各种固定化反应条件，如将过氧化物酶酶液与固定化载体按3ml:lg的比例混合，在30。C及缓冲液存在的条件下；一起搅拌固定65min。步骤2)与步骤l)采用完全相同的固定化反应条件是指固定化反应的温度、搅拌速度、固定时间及缓冲液的选取等除不添加固定化载体外，两者的步骤完全一致。步骤l)和2)中，过氧化物酶总酶活的检测方法为在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以仏02和邻苯二胺为底物，检测加入一定体积的酶液后，在430nm波长下，混合物OD值随时间的增加，以每分钟0D变化1定义为一个酶活力单位，以下列公式计算获得过氧化物酶酶活其中，E:过氧化物酶活力，D二酶液的稀释倍数，K^反应时间为横坐标作出的OD与时间曲线最初的直线部分的斜率K，VHt测5反应中加入的酶液体积。具体的，可采用以下体系在比色皿中加2.7ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入0.lml邻苯二胺——乙醇溶液和0.2mlH202溶液，预热分光光度计，以此为空白调零。放样品的比色皿中加2.6ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其他同空白，加入0.1ml酶液，搅拌均匀。在430nm波长下，测定混合物OD值随时间的增加，每分钟OD变化1定义为一个酶活力单位。以OD为纵坐标，反应时间为横坐标作出的OD与时间曲线最初的直线部分的斜率K，根据公式^^^T("^)可计算出过氧化物酶的活力，E:过氧化物酶活力(U/ml)，D二酶液的稀释倍数，K-反应时间为横坐标作出的OD与时间曲线最初的直线部分的斜率K，1)=国际酶活单位(l(T6mol/min)。步骤3)中，残余酶活比例越小，固定化效果越好。反之，固定化效果差。本发明的方法可用于筛选过氧化物酶固定化的优化条件。进一步的，筛选获得的H型阳离子交换树脂固定过氧化物酶的最优条件为PH4.8;以柠檬酸-柠檬酸三钠为缓冲液；缓冲液离子强度0.24;固定时酶液酶活14U/ml;固定时树脂与酶液比例为1g:3ml。本发明的评价方法为间接方法，测定固定化过程中剩余的酶液酶活，以及与固定化过程经历相同过程，且与固定化过程中相同体积的过氧化物酶粗酶液的酶活(总酶活)，利用计算固定化后上层的剩余酶液酶活和做为参比的总酶液的酶活比例来评价固定化酶固定化效果，该比例小者说明固定到载体上的酶液量多即固定化效果好；反之，固定化效果差。本发明的方法必须保证测定过氧化物酶酶液酶活的准确性，以及作为参比的酶液要与固定化用酶液经历相同的过程，以便排除干扰，减小误差。从而保证该评价方法的准确性、可靠性。本发明的有益效果是本发明的方法克服了由于直接测定固定化酶酶活，产物大多为有色物质，易被固定化载体吸附的缺点，结果的可靠性更高，适用于对固定化酶固定化效果进行评价。具体实施例方式以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。本发明适用于固定化过氧化物酶效果的评价方法，其特点是利用计算固定化后未固定上的剩余酶液酶活与做为参比的总酶酶液活比例。具体评价方法为1、酶液的提取本实施例中蔬菜(巻心菜)原料按1:1的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎、定性滤纸过滤分离得过氧化物酶粗酶液；2、酶的固定化及固定化效果评价将过滤分离得到的过氧化物酶粗酶液与预处理好的H型阳离子交换树脂一起磁力搅拌固定65min后，分别测定固定化后未固定上的剩余酶液酶活和做为参比的总酶液，并计算上述两种酶活比例。固定完并测定出上层残留酶液后用蒸馏水洗去未固定上的酶液，将洗净的固定化酶存于保护液中待用。实施例1:称取预处理过的C150S树脂质量3倍的巻心菜过氧化物酶粗酶液(10U/ml)，分别置于两个125ml广口瓶中。其中一个用于固定化，其内装有预处理过的树脂；另一个作为参比，两个广口瓶中过氧化物酶粗酶液经历相同的过程。其具体操作条件如下固定时温度温度30°C;固定时水浴摇床转数150r/min;固定缓冲pH5.00.025M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；固定化时间65min固定完后，准确测定固定化后残余酶液酶活及做参比用总酶活，计算出两种酶活比例。改变其中固定化条件，其他条件不变，同样方法计算固定化后残余酶活比例，则残留酶活比例较低者固定化效果较好，认为为巻心菜过氧化物酶的最优固定化条件。分别选取不同的PH、缓冲离子强度、缓冲种类、固定时酶液酶活、固定时酶液与树脂比例(ml:g)固定，固定完后分别测定残余过氧化物酶酶活以及作为参比的总酶活，求得残余酶活比例。测定巻心菜过氧化物酶酶活方法在比色皿中加2.7ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入0.1ml邻苯二胺——乙醇溶液和0.2mlH202溶液，预热分光光度计，以此为空白调零。放样品的比色皿中加2.6ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其他同空白，加入O.lml酶液，搅拌均匀。在430nm波长下，测定混合物OD值随时间的增加。按以上方法进行巻心菜过氧化物酶酶活测定，并求得残余酶活比例，选取残余酶活比例小者为最优固定化条件(结果如下表所示)，最优固定化条件为PH4.8;缓冲种类柠檬酸-柠檬酸三钠；缓冲液离子强度0.24;固定时酶液酶活14U/ml;固定时树脂与酶液比例(g:ml)1:3。过氧化物酶固定化条件的优化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>固定时酶液酶活10U14U18U残余酶活比例0.05630.01420.0383注以上表中除选定因素外，其他因素条件保持一致10权利要求1、一种过氧化物酶固定化效果的评价方法包括下列步骤a、过氧化物酶固定化取过氧化物酶酶液，将其固定于固定化载体上，固定化反应完成后，检测未固定上的残留酶液的过氧化物酶总酶活；b、取与步骤a来源相同的过氧化物酶酶液，以相同体积的该过氧化物酶酶液作为参比，除不使用固定化载体外，与步骤a采用完全相同的固定化反应条件同步进行固定化反应，在与步骤a经历相同的固定化反应时间后，检测参比的过氧化物酶总酶活；c、计算步骤a获得的残留酶液的总酶活与步骤b获得的参比的总酶活的比例得到残余酶活比例。2、如权利要求1所述过氧化物酶固定化效果的评价方法，其特征在于，步骤a和b中，过氧化物酶总酶活的检测方法为在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，以&02和邻苯二胺为底物，检测加入一定体积的酶液后，在430nm波长下，混合物OD值随时间的增加，以每分钟OD变化1定义为一个酶活力单位，以下列公式计算获得过氧化物酶酶活其中，E为过氧化物酶活力，D为酶液的稀释倍数，K为反应时间为横坐标作出的OD与时间曲线最初的直线部分的斜率K，V为检测反应中加入的酶液的体积。3、如权利要求1或2所述过氧化物酶固定化效果的评价方法，其特征在于，以步骤c中，残余酶活比例越小，固定化效果越好。4、如权利要求1-3所述任一过氧化物酶固定化效果的评价方法用于筛选过氧化物酶固定化的优化条件。全文摘要本发明公开了一种过氧化物酶固定化效果的评价方法，该评价方法为间接方法，通过测定固定完后上层残留酶液与作为参比的总酶活的比例对酶固定化效果进行评价，从而克服了直接测定过氧化物酶催化产物，由于过氧化物酶催化的产物大多为有色物质，易被固定化载体吸附而造成结果的不准确的缺点，结果的可靠性更高，适用于对固定化酶固定化效果进行评价。文档编号C12Q1/28GK101603074SQ20091005473公开日2009年12月16日申请日期2009年7月14日优先权日2009年7月14日发明者斐徐,李学辉,李思超,章海鹏申请人:上海理工大学