专利名称：以肿瘤细胞miR-221/222为药靶的抗癌重组腺病毒和构建方法及用途的制作方法
以肿瘤细胞miR-221/222为鄉的抗癌重会II^病毒和构建方法及用途
M领域本发明属于生物医药技术与恶倒中瘤的基因治疗技术领域，涉皿纟朋泉病毒和 ，^iiM粒，具体为以肿瘤细胞miR-221/222为药耙的抗癌重測泉病，M^iM粒的构建 及抑制AI^瘤、？H爐和胃癌的生长，对i^l中瘤具有放疗增敏作用。
背景技术：
微RNA(micraRNA或miRNA)为长度约21 25核苷酸的小型非编码RNA 倉滩i朋鹏定的目标mRNA，并在緑后7jC平MiliSa耙mRNA的,和(或)抑制翻微程 而，负调控基因泰ii的作用。miRNA-221/222是成湊的miRNA，与^M母细M、前列J^S、 甲鄉乳头鹏雜关。
Ciafie、等小^ffl微阵列的方法比较了 9例原发l4K质母细胞瘤与核磁據强ifc^ 2 cm处 "正常瘤周脑组织"的miRNA ^ii谱，发5IM:半数的肿瘤组织过就包括miR-221在内的9种 miRNA。 Gillies翔究发现，細胶质母细鹏中，miRNA-221 、 miRNA-222舰与p2严mRNA 的3LUTRs结合来斷氏p27—1的泰li。这为脑KM母细胞瘤,了一种潜在的新的治疗途径。 Galardi等发现miR-221与miR-222明，响前列腺癌LNCaP细胞虫荧光素酶的表达。可以看出 p27一是miR-221 、miR-222的IES因。Pallante寧在分析乳头状甲>|^髓的miRNA ^i谱时发现， miRNA-222最高增高60倍，平均增高13.7倍。除了J^I中瘤，miRNA-221与miRNA-222
细m、 tos、弥漫性大B细胞淋巴瘤、 癌、肾癌和膀胱癌中均异常表。
发明内容本发明目的^ffl遗传工程的方法在细胞内获得耙向敲低raiRNA泰逸的构g 案，为皿出
目的之一，Jift可以用于产生siRNA的DNA序列组； 目的之二， li^含有目的一序列组的M,质丰级^I建方法；
目的;tH， MI含有目的一序列组的Br彌毒穿梭载体及^J建方法；
目的之四，鹏目的H^舰穿梭载糊建的^彌毒；以及，
4目的之五，,^t亥^iiM粒和l;編毒的用途。
本发明顿遗传工程的方法在细胞内获得耙向謝氐miRNA教的构建方案，该方案可以获取 重fflM毒和真核^ii质粒，并可自于肿瘤治疗，运用该方法可以在实验割牛下抑制人源, 质瘤、胃癌、乳&鶴等肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，同时上调抑癌基因PUMA、 PTEN、 Cx43 和p27的皿，下调DNAPKcs和miR-21的皿；对肿瘤细M有增强效旁观者 鹏和Mh冶疗 增敏的作用。
本发明的技术方案M如下
第一、本发明,了四种用于产生siRNA的DNA序列 DNA序列1
5'- CTCGAGTTTAITAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAArGTAGCT -3， DNA序列2
5，- CTCGAGnTAnAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT -3' DNA序列3
5'- CACCGGATCCAITGTCTGCTGGGnTCnTnTGAArAAAGAGCTC -3' DNA序列4
5，- CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCACAGACAATGGArCC -3，。
第二本发明提供了包含J^四组DNA序列的组合的^t亥^iM禾M^I建方法 具術口下质粒为DNA序歹!J-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/PgenesiM。质粒 DNA序列-1 、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/ Pgenesil-l的通用结构如图2示。质粒构 建方法如下，将序列表中的DNA序列1/DNA序列2、 DNA序列3/DNA序列4退，^i链结 构，fflffl克H^于质粒载体用以构建餓^i质粒，获得以肿瘤细胞miR-221/222为舰的 抗癌重taM粒。最终在Pgenesil-l中形成的酶切位点顺序为MluI—hU6 promoter—KCNH11 — Hindffl—KCNH12—mU6 promoter—BamHI—EcoRI—SalI。第三、本发明在发明1的基础上构建了穿梭载体以及腺病毒
将序列表中的SEQ 1DN0.1/SEQ IDN0.2、 SEQ IDN0.3/SEQ ID NO.4退火形5J^X链 结构！ Mi!M克離軒穿梭载体，LR体外隨重輕pGSadeno腺病毒载体，但不仅限于所提 及的鹏毒和期鹏用穿梭载健组的病毒载体。线性^Jt彌毒DNA后转染293鹏细胞，获得 以肿瘤细胞miR-221/222为IPE的,重乡II泉病毒，但不仅限于所提及的腺病毒。
第四、本发明还鹏了餓^M粒和重会鹏病雜制^W帝,瘤生长药物中的用途。
本发明的船和积极麟
本发明通过在多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子，在U6启动子下游 连接反义的miR-221和miR-222成熟序列片断，所获得的重纟fi^毒和^t亥^iiM粒倉继^M 瘤、胃癌、？Lft鱸等肿瘤细胞内复制增殖；插入的反义miR-221/222cDNA片段泡中瘤细胞内高效 鋭，抑制肿瘤细胞miR-221/222的就。劍縮翻餓^i^粒柳瘤^摘物、娜治疗 增敏的制备中具有独特的实用价值。
本发明与化對,的miRNA抑制剂相比，以miR-221/222为!5lfi的，重乡fl^病毒，便利， 倉鹏高反义RNA的基因转导效率，产生明显的基因治;i^媒。
图1质粒即DNA序列组的腺病毒穿梭载,建图谱。
图2是酶切鉴定分析目的基因片段DNA序列1+2与目的基因片段DNA序列3^4连接成功。 图3是northern blot显示反义-miR221/222月繊毒可明显敲低^M瘤U251细胞的miR-221 、 miR-222的鋭。
图4是反义miR-221/222腺病毒转染的U251细胞有明显的Gl期阻滞(1:对照组2菊M 辦列组3:反义miR陽221/222鹏毒组)。
图5是反义miR-221/222腺病毒f数中瘤细胞增殖减漫。
图6反义miR-221/222 !^毒g^照谢可明显斷氐MCF-7细胞S期的细胞比例(1:对照组2: 转染无，列组3:反义miR-221/222 &彌毒组4:对照组+照射5:转M，列组+照射6:反义miR-221/222腺病毒组+照朝)。
图7反义miR-221/222 &彌毒对 [||癌细 MCF-7细胞有明显的Wm敏作用。
图8 Western blot显示反义miR-221/222 l;縮毒可上调MCF-7细胞p27kipl敏并与放蹄协
同作用(1:对照组2:转染无辦列组3:反义miR-221/222腺病毒组4:对照组+照谢 5:
转染无辦列组+照谢6:反义miR-221/222月線毒组+照谢)。
图9反义miR-221/miR222 i^毒可以明显抑制裸鼠移M的生长。
图10反义miR-221/miR222 &彌毒可以明显提高p27—3'UTR报告质粒的荧光3破，说明 p27kipl是miR-221/222的IES因。
图11反义miR-221/miR222腺病毒可以明显提高 li^癌细鹏MCF-7细胞的p27kipl 对照组2:转^J^列组3:反义miR-221/222麟毒组)。具体 ^
鄉例1以肿瘤细胞miR-221/222为繊的餓SiiM粒的构建(图1)
1. 合^^链目的基因片段的退，接
2. 稀^m火片段分别与线性顿粒pGenesill.1 、 pGenesill.2和pGenesill.3载体的连接
3. 各取5ul雜 ^tlft化感受态细胞DH5a，分别涂布矜KW抗性(终浓度为30ug/ml) 的LB平社，37。C恒温^l蹄过夜。
4. 从^h歸皿上^t兆取3个单克隆麟接种于3ml含Kana『抗性(终浓度为30ug/ml)的 LB歸液中，37。C恒温摇形^i夜。
5. 用试剂盒小量提M粒(中鼎公司)，并分别用SacH,切鉴定
6. 挑取克隆正确的质粒转化菌液GYL 1-1.1-1、 GYL2-1.2-5和GYL3-1.1-9,GYL丰l.2-13去 测序。经测序结粉析均为插入正确的克隆质粒，而_&^翻#^计标准。
7. 质粒GYL 1-1.1-1、 GYL 2-1.2-5的Hindm+BamHI目切分别回收大片段和小片段(约 350bp):质粒GYL3-1.1-1、 GYL4-1.2-5的Hindm+BamHI双酶切分别回收大片段和小片段(约 350bp)。
8. 质粒GYL1-1.1-1回收大片段与质粒0￥12-1.2-5回收小片段的i^g，质粒GYL3-l.l-9回收大片段与质粒0￥14-1.2-13回收小片段的连接
9. 取5ul过赔接产鹏化感受态细胞DH5a，涂布矜Kanaf抗性(终浓度为30ug/ml)的 LB平肚，37。C恒温歸箱培养过夜。
10. 从線皿JJ陬3个单克隆離接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为30ug/ml)的LB培 鎌中，37。C恒鹏棘养过夜。
11. 用试剂盒小量提KJt粒(中鼎公司)，并分别用MuI+BamHI做酶切鉴定。 实施例2 Ml^毒构建实验
1. 从pGenesil-l _h l LR体外同源重组将上例中得到的GYL1+2及GYL3+4 shRNA 框移至pGSadeno lz彌毒魏载体上LR体外同源重组，中提试剂盒(维特洁)提M粒，用 Pl-Scel/I-Ceul双酶切鉴定提取的质粒并1 % Agarose W电泳(图2)。
2. ^m会II^泰Pad酶切重会I^病毒质粒,将Pacl线性化的腺病毒DNA转染HEK 293， 将上步的裂解上清感染再次HEK293 、放#錄。
鄉例3 mj^毒介导反义miR22節上调p27kipl抑审i臓母细鹏U251细敝长 的体夕鹏
1. 细胞歸和转染U251恶I^M"瘤体外细胞在DMEM完全歸液中常规培养。腦 细胞分3组，分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222鹏毒转导组。转染方法按照 MOI=50进行，转导48-72小时。
2. RNA提m^ Northern blot:将^5tm^好的3纟IlfflTO Trizol试剂按照说明书将总RNA 提取出来。然后以齡样品20吗的ih賊10%聚丙稀变性 !4行电泳，然后用尼;fe^4行
转膜。随后将转好的raca紫外交s^a行固定。固定好的膜可以与Miis行杂交。杂^aa
Dig Luminescent Detection Kit "(^M^像。
3. Western blot分析转染前后p27,变化将5xl07待检验细胞Jt^ii,十二^SfTa 纳上样缓冲、^^去收获蛋白，20nl上样量(约1()7细胸上銜L)进行电泳。
,4. MTT法(噻腔比色分析法)检测转染后U251细胞增殖率分别为对照组、对照病毒转导组和反义miR-221/222腺病毒转导组。转染后48小时开始。
5. M细JW检测转染后细jra期分布将U251细胞接种于6 L板。转导后48小时后消 化，细脱悬液，离心，弃上清，按照GENMED细胞周期流式细胞分ff^剂盒产品说明书(杰 美公司，上海)^i己细胞；、 细胞仪分别检测周期分布。
6. Northern blot法检测转染后miR陽221、 miR-222的^]feK平。反义miR-221/222鹏毒转导 组使miR-221、 miR-222的表达水平明显下降。转染对照病毒组及对照组的microRNA-221 、 miaoRNA-222 ^i7jC平没有改变。观察期内反义miR-221/222 !^毒转导组U251细皿^1度 较转 照病毒组和对照组明显缓慢。反义miR-221/222自毒转导组U251细胞出现了明显的 Gl期阻滞，G1占46,2X，而对照组、转舰照麟组分别为28.6%、 26%。
7. 结果Northern blot法检测转染后miR-221、 miR-222的表ii7K平。反义miR-221/222腺 病毒转导组使miR-221、 miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的 microRNA-221 、 microRNA-222表ii7]C平没有改变(图3)。反义miR-221/222腺病毒转导组U251 细胞出现了明显的G1期阻滞，Gl占46.2%,而对照组、转染无意序列组分别为28.6%、 26% (图 4)。观察期内反义miR-221/222l7彌毒转导组U251细胞生^d!S较转染无意序列组和对照组明显 缓漫(图5)。
鄉伊"MJ^毒介导反义miR221/222上调p27对IU^细鹏MCF-7的^l^敏作
用
1. 细胞i歸和转染MCF-7孚ll總体外细胞在DMEM完全:fe&^t中常规i歸，MCF-7乳 鹏体外细麟i歸与转染方法同上。MCF-7细胞分3组，分别为对照组、对照病毒转导组和反 义miR-221/222腺病毒转导组。转染方法按照MOI=50进行，转导48-72小时。
2. 照谢方法細美国ra安walian600識力口速器6MV X线，源戯巨为100cm，剂量率为 3.2Gy/min。
3. MTT法(噻P^比色分析法)检测转染后MCF-7细胞增殖率分别为对照组、对照病毒 转导组和反义miR-221/222 l;彌毒转导组。转染后24小时 4Gy照谢，24小时后开始测MTT。
4. 流式细Mt测转染后细胞周期分布将MCF-7细胞接种于6孔板，分为6组分组为对照组、对照照射组、转染无意序列组、转染无意序列照射组、反义miR-221/222 ft彌毒转导组和反 义miR-221/222腺病毒转导照浙组。转染后45小时后给予4Gy照射，3小时后消化成单细胞悬液， 离心，弃上清，按照GENMED细鹏期戯细胞分^臓剂,品说明书(杰美公司，上海)标 记细胞；、駄细胞仪分别检测五组细胞的周期分布。
6. 平板克隆形成实验测定下调miR-221/222 ^i^MCF-7细胞的方Mli敏作用对已转染好 的Hl且细胞分别进行OGy， 2Gy， 4Gy， 6GyX线照射(源戯巨-100ci^齐!j量率二320cGy/mi^瓦 里安600C加速器6MVX线照谢)。用0.25%胰酶消^^ ^细脱悬液，根据不同照射剂量种植 不同细臓的细胞于已有全i^^基的培养皿中，观测10 14天，随后用PBS冲洗，用Giesma液 她10溯，用清7K冲洗，在SYNGENE ChemGenius成像系社成像并计算克隆数(细 〉 50个细胞的克隆)。转皿程中对细lfiit成的毒副作用il5i^行照射的三组U251细胞的贴壁效率
(plating efficiency PE)来评测。PE-克隆形j^/细胞接种数xlOOX。然后按下列公式i十算出 MCF-7细胞的各治疗组在不同照谢剂量点的存活率(survival fection SF)。 SFH十算所得克隆激 (细胞接种数xPE)。
7. Western blot分析转染前后p27kipl ^ii变化将5x107已转染的五组待检^ffl胞培微夜 后十二驢肌,上样缓冲'M^收获蛋白，20pl上样量(约107细鹏上銜L)进行电泳；方 法同上。
8. 结染用Northern blot法检测转染后miR-221、 miR-222的表ifeR平。反义miR-221/222 自毒组使miR-221、 miR-222的^i7K平明显下降。转染^^意序列^S^照组的microRNA-221、 microRNA-222 ^izK平没W^变。观察期内反义miR-221/222 l;彌毒组MCF-7细l&^^ijg较 转^^意序列组和对照iP月显缓慢。与照J^结^5明显协同作用。反义miR-221/222 毒组 MCF-7细胞出现了明显的G1期阻滞，G1占63.0X，而对照组、转染无意序列组分别为30.6%、 29.8%。对照组与反义miR-221/222 B;彌毒鹏x2检验x2戯11.25， p戯0.002，有统i恃意 义。绘照谢后G1期细胞比例与未照谢对比无明显变化，而G2有明显增高，致^^照谢后S期细 胞比例明显下降。反义miR-221/222l^毒组MCF-7细脱照浙后S期占10.7X，而对照组、转染 无意序列组分别为45.4%、 38.2%，明显高于反义miR-221/222 !^彌毒组，对1;瞎异有统计賴义(图6)。 M31克隆形成失实^M示反义miR-221/222共转染可明显增加MCF-7细胞旻照射后的增 殖性死亡几率。如图4显示对照组、转染无意序列组在2Gy的细胞存活與suwivalfectionSF)分别 为51.59%、 49.6%， 4Gy的SF分别为32.43%、 28.36%， 6Gy的SF分别为9.72%、 8.75%。而 反义miR-221/222腺病毒组2Gy、 4Gy、 6Gy的SF分别为25%、 12.5%、 1.28%,明显低于对照 组和转染无意序列组，经统i悖分析(p<0.05)，差异有统计賴义(图7)。反义miR-221/222腺 病毒组可明MJi调MCF-7细胞中p27kipl表达，经照射后p27kipl ^ifi—步提高，说明反义 miR-221/222共转染^"照射在提高p27kipl ^ifeK平上有协同作用(图8)。
^6fi例5.反义-miR22iy222腺病毒转导上调p27kipl抑制] 母细鹏U251细鹏长的体 内鹏
1. 裸鼠移植瘤模型粒对数生长期的U251舰母细胞瘤细胞，经0.125%胰酶消化， lOOOtpmxlO射中常温离心去上清，以PBS离心洗涤2次。计算细麟，调整细胞浓輕5xl07/ml， 将细胞悬浮^lfiL清DMEMit^液中。然后用带6辦头的鄉翻 脱悬液200^1，接种于 裸鼠鼠鼷部皮下。该组接种裸鼠3只，为第一代荷瘤裸鼠。待移H0长M^径约7mm，断5M死， 在无菌斜牛下，解剖切鹏当大小的肿瘤组织，立即駄^lfiL清DMEM中，修剪肿瘤组织，去除 月旨肪和綱中瘤组织，并用^lfiL清DMEM洗涤，将其剪成lmm3大小的瘤^^种至櫬鼠左侧鼠 鼷部皮下。 一周后鄉t餽^^只长至约50mm3后，准备治疗。
2. 将已长成的荷瘤裸鼠分成3组，分别为对照组、转染无意序列组、和反义miR-221/222腺 病毒转染组。每组8只，共40只裸鼠。将已舰的转染舰取多点蹄的方法ai^进移鶴内， 每次鄉约30Ml。每三天魏一次，共激5次。从治疗开始测餓醜的最大径和最小径，按 公式V气ab2)/2计算肿瘤大小。每2天测量1次，赶第30天。30天时观察肿瘤大体形态，并取 肿瘤组织固定于10%福尔马鹏液中，石蜡包埋，组织切片，HE她，进《豫织病理检査。
3. 荧光原條交荧光原條交试剂 于陕西超英生嫩术有限公司，其中mir-221用地 高辛*祐，mir-222用,蛋白链菌素^H己。具,l條说明书进行。■ S-P免;Sa化试剂盒。 在同一标本的 病理切片中分别加入Ki67(l:100北京中杉公司)、p27kipl(l:100北京中杉公司)两种i抗，4'c过夜，然后加入生物素^i己n抗，辣M:氧化物酶t彩己的链霉卵白素，DAB显
色，苏木素复染。具体步骤按S-P免疫组化试剂盒说明书。以胞核染成黄褐色为阳性。高傲竟下 "200)计数1000个细te计算阳性细胞載率。阳性细胞敏率=(阳性细 总细|&|50><100%。
4.结果反义miR-221/222鹏毒转导组的移f魏生^IS明显慢于对照组和转染无意序 列组(图9)。使用荧光原,交法检测转染后miR-221、 miR-222的^ii7K平。反义miR-221/222 腺病毒转导组使miR-221、 miR-222的表达水平明显下降。转染无意序列组及对照组的 miaoRNA-221、 microRNA-222表达水平没有改变。在组织病理切片行免疫组化检测发现反义 miR-221/2221;彌毒组的p27kipl的阳性率明显高于对照组和转染无意序列组(p=0.001)。 Ki67的 表达正好与之相反。对照组和转染无意序列组的阳性率明显高于反义miR-221/222腺病毒组 (p=0.003)。
$5￡例6.敲低胃癌细鹏SGC7901细胞miR-221/222上调p27kipl ^ii^其生长抑制的体 夕鹏
1. 细胞:^#和转染SGC7901胃癌细胞在DMEM完全培养液中常规培养，其土§#^转染方 法和^a同上。RNA提^ Northern blot、 Western blot分析转染前后p27kipl ^i变化、MTT法
(噻P^比色分析法)检测转染后SGC7901细胞增殖率、'E^细SM^测转染后细TO期分布同 以上步骤描述。
2. 虫荧光素酶活性实验:将SGC7901细胞接种于96孑L板，将反义miR-221/222 ^縮毒转染分 别与p3、UTR-P27和p3、UTRmut-p27进行共转染，同时，照，48小时后用Tecen多功畲^IM 长扫描分析检测系统分析虫荧光翻活性。
3. 结果反义miR-221/222 JI彌毒转导组使miR-221、 miR-222的^feK平明显下降。转染 无意序列^^t照组的microRNA-221、 mictoRNA-222表iizK平没有改变。反义miR-221/222腺 病毒转导与p3、UTR-P27同时转^^朋万检测的荧光活性明显高于其它组(图10)。观察期内反义 miR-221/222腺病毒转导组SGC7901细胞生錢度较转染无意序列组和对照组明显缓漫。反义miR-221/222腺病毒转导组SGC7901细胞出现了明显的G1期阻滞，Gl占63.7%，而对照组、转 染无意序列组分别为22.3%、 28.6%。各组经x2检验x2值为13.25， p働0.002,有统计学意义。 反义miR-221/222 l;彌毒转导组可明^Jl调SGC7901细胞中p27kipl泰逸，而转染无意序列组和 对照组的p27kipl ,较弱。
夕,
1. 细胞i^和转染孚Lft媳细，MCF-7细胞在DMEM完全i^^中常规培养，其培养与 转染方法和分组同上。RNA提TO Northern blot、 Western blot分析转染前后p27kipl鞑变化、 MTT法(噻B^比色分析法)检测转染后MCF-7细胞增殖率、^;细JW检测转染后细TO期 分布同以上步骤描述。
2. 结果反义miR-221/222臓毒转导组使miR-221、 miR-222的^i&K平明显下降。转染 无意序列组及对照组的microRNA-221 、 microRNA-222表达水平没有改变。观察期内反义 miR-221/222腺病毒转导组MCF-7细胞生长速度较转染无意序列组和对照组明显缓慢。反义 miR-221/222 re毒转导组MCF-7细胞出现了明显的Gl期阻滞，Gl占63.0%，而对照组、转染 无意序列组分别为30.6%、 29.8%。各组经x2检验x2働11.25， p働0.001,有统it^义。 反义miR-221/222鹏毒转导组可明^il调MCF-7细胞中p27kipl ■，而转^5意序列组和对 照组的p27kipl ^ii较弱(图11 )。序列表
《10〉天津医科大学总医院
<120〉以肿瘤细胞miR-221/222为药耙的^重S^病毒和构建方法及用途
<腸4
<210〉 1
〈211〉 46
<212> DNA
〈213〉 AX序列
〈400> 1
caccagctac attgtctgct gggtttcttt tttgaataaa gagctc 46
<210> 2 〈211〉 46 <212〉 DNA 〈213〉 AI序列 <400〉 2
ctcgagttta ttagctcaaa aaagaaaccc agcagacaat gtagct 46
<210〉 3 <211>46 <212〉腿 <213> AI)^列 <400>3
caccggatcc attgtctgct gggtttcttt tttgaataaa gagctc 46
14〈210〉4 <211> 45 〈212〉薩 〈213〉 AX序列 〈400〉4
ctcgagttta ttagctcaaa aaagaaaccc acagacaatg gatcc 4权利要求
1、一种用于产生siRNA的DNA序列组，包括如下四个序列DNA序列15‘-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3’DNA序列25’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3｀DNA序列35′-CACCGGATCCATTGTCTGCTGGGTTTCTTTTTTGAATAAAGAGCTC-3’DNA序列45’-CTCGAGTTTATTAGCTCAAAAAAGAAACCCACAGACAATGGATCC-3’。
2、 一种包^fe利要求1戶做的DNA序列组的^t亥^iM粒。
3、 一种权利要求2折丞的真核^iiM粒的构建方法，，征在于将序列表中的SEQ ID NO.l/SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4退火形^K链结构，fflil3E克^S針质粒 载体用以构建，^iiM粒，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药耙的,重乡，粒。
4、 一种基于反义RNA技术的、以肿瘤细胞miR-221/222为I5IE包^K利要求1戶舰的DNA 序列组的腺病毒穿梭载体，，征是S^应用2个反义RNA序列，在U6启动子下游分别连接反 义的miR-221和miR-222成熟序列的^ii模扳，皿的2个反义RNA序列，:序列表中的DNA 序列1/ DNA序列2， DNA序列1为IBC链、DNA序列2为反义链，DNA序列3/ DNA4序列， DNA序列3为IBC链、DNA序列4为反义链。
5、 一#^利要求4臓的鹏毒穿梭载体的构建方法,^t寺征在于将序列表中的SEQ ID NO.l/SEQ IDN0.2、SEQ IDN0.3/SEQ IDN0.4退火形^i链^J， ffiMM克,接于穿梭 载体，获得以肿瘤细胞miR-221/222为药耙的,腺病毒穿梭载体。
6、 一种基于反义RNA駄的、以肿瘤细胞miR-221/222为舰的繊重乡皿斓毒，辦征 在^W^毒是在pGSadeno基因组多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子， 在U6启动子下游连接反义的miR-221和miR-222成熟体RNA序列构成，所述的序列是反义miR-221成熟序列的RNA序列5'- GAAACCCAGCAGACAAUGUAGCT —3，反义miR-222熟序列的RNA序列5'-GAAACCCAGCAGACAATGGAUCC -3，。
7、 一种权利要求6戶腿的重纟孤夷病毒的构建方法，，征在于，首先按照*$1利要求5戶腿的 方法构，利要求4所述的腺病毒穿梭载体，然后LR体外同源重t!MpGSadenol7彌毒载体，线 性化&彌毒DNA后转染293爐细胞，获得以肿瘤细胞miR-221/222为舰的繊重t孤彌毒。
8、 权利要求6臓的重组鹏雜制柳制肿瘤生长药物中的用途。
9、 权利要求2臓的獻亥^iiM粒在制糊制肿瘤生长药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种应用遗传工程的方法在细胞内获得靶向敲低miRNA表达的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物制备中的用途。用定向克隆、同源重组、转染、腺病毒纯化等技术，获得重组腺病毒和真核表达质粒，即在多克隆位点下游分别插入针对人源性和小鼠源性U6启动子，在U6启动子下游连接反义的miR-221和miR-222成熟序列片断(序列表中的序列1至4)，所获得重组腺病毒和真核表达质粒能选在胶质瘤、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞内复制增殖；插入的反义miR-221/222cDNA片段在肿瘤细胞内高效表达，抑制肿瘤细胞miR-221/222的表达；对肿瘤细胞具有强效旁观者效应。该腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物、放射治疗增敏的制备中具有独特的实用价值。
文档编号C12N15/79GK101503685SQ200910067879
公开日2009年8月12日 申请日期2009年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者康春生, 张安玲, 张春智, 浦佩玉, 王广秀, 贾志凡, 磊 韩 申请人:天津医科大学总医院