β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途的制作方法

专利名称：β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物转化工程技术领域，涉及葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其 用途。更具体的说是利用葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈 皮中橙皮苷的生物利用度的方法。
背景技术：
生物转化法本质是由微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催 化剂对外源性底物进行的一种或几种化学反应。生物转化既可增加目标产物产量，克服化 学合成的缺点，又因其大多数是在室温、中性环境中作用，减少了产物分解、异构、消旋和重 排反应，反应具有位置选择性和立体选择性，因此生物转化具有无毒、无污染、低成本、高收 率、环境友好等特点。S. Singularis分离自Scolytus spp.昆虫幼虫粪便，由于此类真菌自然条件下的 生存环境决定了其体内可产生用于分解来自于蔬菜的苷类化合物的酶类。Ishikawa EIJI 等研究发现S. Singularis只能产生一种水解酶，称作BglA蛋白，并验证此酶是具有高半乳 糖苷酶活性的葡萄糖苷酶同工酶。橙皮苷是广泛存在于柑橘类果实中主要类黄酮苷类成份之一，药理研究证实其具 有抗氧化、调节脂类代谢、干扰肿瘤发生等生物活性。但橙皮苷与其他类黄酮一样口服生 物利用度不高，究其原因之一是其含有的配糖基团影响了其水溶性。相关研究表明橙皮苷 的苷元，橙皮素的口服生物利用度高于橙皮苷，因为橙皮素不含有配糖基团，不需要脱糖基 化。因此水解橙皮苷，脱去其配糖基团是提高其口服生物利用度的特异性方法之一。目前 研究的转化方法主要有化学法，如日本Hayashibara橙皮研究所采用糖基化方法制成糖基 化橙皮苷。但强烈化学反应会改变苷类化合物的结构和构型，导致产物不稳定或药效消失； 酶解法，如瑞士雀巢研究中心采用酶修饰方法，用橙皮苷酶水解橙皮苷获得橙皮素-7-糖 苷。酶解法转化苷类中药是以苷类提取物为作用底物，使用糖苷水解酶作为催化剂，工艺过 程复杂，不利于工业化生产。

发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白。本发明使用 3 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化陈皮中的主要活性成分橙皮苷，口服给药和静脉 给药两种给药途径的药代动力学结果均表明此酶的生物转化作用提高了橙皮苷的生物利 用度，因此我们探索微生物转化技术，利用ATCC标准真菌菌株S. singularis,采用现代分 子生物学技术，克隆、表达具有高0 “葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物转化橙皮 苷，将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而 提高苷类中药药效。本发明的另一个目的在于公开了 葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白在提高苷类中 药生物利用度方面的应用，特别是将橙皮苷转化为苷元药物方面的应用。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案一种编码葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，该基因具有SEQ ID N0:1。本发明所述的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列；本发明所述葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的重组表达质粒的载体为 pQE30-Xa-bglAo本发明进一步公开了 葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高苷类化合物 生物利用度药物方面的应用。特别是葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高陈皮 中橙皮苷的生物利用度药物方面的应用。实验结果表明本发明的葡萄糖苷酶同工酶BglA是一种新型的酶，这种酶不 但耐高温，而且热稳定性优良，特别是在体外水解橙皮苷，将橙皮苷转化为苷元药物方面具 有明显的作用。从而完成了本发明的工作。本发明首先公开了橙皮苷的提取及BglA蛋白体外水解橙皮苷的方法橙皮苷提取自陈皮，采用超声提取方法。4g陈皮被粉碎为粒径大小为1mm粉末， 200ml甲醇溶解，40°C，60mHz超声60min，重复一次。将甲醇超声提取液过滤后蒸发干燥，残 留物溶解于含5% (v/v)丙二醇的水中，终浓度为10mg/ml。所得溶液用0. lml, 0. 01M草酸 酸化，HPLC定量。然后将本研究克隆S. singularis的bglA基因，将之与表达载体pQE30_Xa 相连接组成重组质粒pQE-30Xa-bglA，并成功在E. coli中表达。本实验前期在microRNA水平体外研究发现橙皮苷可以抑制JSRV引起的人支气管 上皮细胞中致瘤性microRNA-17-92基因高表达，是一种可用于干扰人BAC发生的候选化学 预防肿瘤药物。但是研究发现橙皮苷体内生物利用度不高，且人群中由于能够特异性水解 不同苷类化合物的肠道菌群个体差异导致人群苷类化合物生物利用度个体差异，进而导致 药效差异，影响了橙皮苷在体内发挥生物活性。考虑到我国古老的中药炮制方法能够提高中国传统中药陈皮的药效，因此为探 讨陈皮经发酵炮制药效提高的机制，摸索提高橙皮苷生物利用度的生物转化方法，本研究 选择了 ATCC标准菌株Sporobolomyces singularis，从中提取其产生的BglA蛋白，并在 E. coli中表达其葡萄糖苷酶同工酶bglA基因。继而本发明使用提取于S. singularis 和表达于E. coli的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白体外生物转化橙皮苷提取物，通过观 察橙皮苷经生物转化后，大鼠血浆内总橙皮素药代动力学变化，来观察3 -葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白生物转化作用对橙皮苷生物利用度的影响。本发明的选用pQE30_Xa载体，除具有pQE载体的一些基本特征，如优化的启动 子_操纵元模式，包括来自噬菌体的T5启动子(由大肠杆菌的RNA聚合酶识别)和两个乳 糖操纵子识别序列；合成的核糖体结合位点RBS II，保证高效的翻译；有多个终止密码子， 无论目的片段从多克隆位点的哪里插入都可以正确的终止；两个强而有力的转录终止子 来自\噬菌体的t0和来自大肠杆菌rrnB操纵元的T1，可以有效预防转录中的通读现象 并保证表达质粒的稳定性；所有质粒含有0 -内酰胺酶(bla)基因；ColEl复制起点等特点 外，还在其N末端加入6X组氨酸标签，对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的 蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成 很大的影响；同时，此载体在6X组氨酸和外源蛋白之间含有一个Xa因子蛋白酶识别位点，Xa因子可以从识别位点的精氨酸后准确将外源蛋白分离而不带有任何载体加入的氨基酸。本发明的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白所具有的积极效果在于(1)利用0 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮的主要 活性成分橙皮苷的生物利用度。相比较于橙皮苷提取物对照组，经葡萄糖苷酶同工酶 BglA蛋白作用组血浆总橙皮素浓度明显增高，达到最大血药浓度的时间T_明显缩短。从 而本研究建立了一种提高苷类化合物生物利用度，进而提高其药效的新方法。(2)初步探讨了陈皮经炮制药效增加的机制，即生物利用度低的橙皮苷可被 3 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用转化为橙皮素。(3)提取自S.singularis菌株的BglA蛋白和表达自E.coli菌株的BglA蛋白均 具有3 _葡萄糖苷酶同工酶活性，体外可将橙皮苷水解为其苷元橙皮素。(4)首次在一个实验室中同时进行橙皮苷和橙皮素的口服给药和静脉给药两种给 药方式的药代动力学平行对比实验。发现橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除较慢，从而补充 了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。首次说明苷体内血浆快速清除率和目前已知的苷 具有低水溶性、在肠上皮细胞上的低透过性或/和肠上皮细胞对其的外排作用一样，都与 苷类化合物低生物利用度有关联。


图 1 为 pQE30_Xa 载体图；图2HPLC代表性图谱，其中(A)橙皮苷标准品(tR = 20. 38min)和橙皮素标准 品(tR = 10. 77min)图谱；⑶空白大鼠血浆图谱；(C)大鼠血浆中0. 02 u mol/L橙皮素和 0. 02 u mol/L橙皮苷图谱；图3bglA基因RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；图4pQE30-Xa_bglA 酶切结果图；图5BglA蛋白SDS-PAGE电泳图；其中1 细菌细胞提取物；2 分子量标准；3 :BglA 蛋白；图6橙皮苷被BglA蛋白和0 -葡萄糖苷酶体外生物转化图；图7单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素药代动力学变化。大鼠被随机分为5组， 每只大鼠静脉注射相当于31i!m0l/kg橙皮苷。血浆样本使用葡萄糖醛酸酶水解，血浆 内药物水平以血浆总橙皮素表示。每一数值以5 土SEM (n=5)表示；图8单次口服给药后大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化。大鼠被随机分为5组， 每只大鼠口服相当于31i!m0l/kg橙皮苷。血浆样本使用葡萄糖醛酸酶水解，血浆内药 物水平以血浆总橙皮素表示。每一数值以$ 土SEM(n=5); 图9橙皮苷和橙皮素肠道内代谢途径，包括橙皮苷体外被BglA蛋白水解及体内被 肠道细菌水解、橙皮苷和橙皮素的转运途径，以及两者体内代谢途径。
具体实施例方式为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的 细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。实施例1
5
1.材料1. 1 试剂橙皮素标准品0 -葡萄糖苷酶PNP-GlcM-MLV逆转录酶BamH I 内切酶Hind III 内切酶10XK buffer2 X Ligation Master MixAmp小型质粒提取试剂盒凝胶回收试剂盒IPTGSDS蛋白分子量ladderUsukizyme考马氏亮蓝G250YWG-C18 (4. 6X150mm,5um)蛋白月东酵母提取物麦芽提取物琼脂粉其他相关试剂均为分析纯或HPLC级1. 2 菌株1. 2. IS. Singularis购自ATCC (American Type Culture Collection)，菌株号 24193，接种于 YM 培养 基，24°C生化培养箱培养。1. 2. 2E. coli T0P10基因型为 F-mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) <P 801acZ A M15 A lacX74nupG recAlara D139 A(ara-leu) 7697galE15galK16rpsL (StrE) endAl X、购自 Invitrogen 公司。1. 2. 3E. coli Ml5 (pREP4)基因型为NalsStrsRifs Thi_lac_Ara+Gal+MtrF_RecA_Uvr+Lon+,购自 Qiagen 公司1. 3pQE30_Xa 载体购自Qiagen公司，其酶切位点如图1所示。1. 4 动物6周龄雄性Wistar大鼠(180 220g) 25只，购自北京实验动物中心，许可证号 SCXK-Military-2002，饲养于室温(23士2°C )，实验前适应性饲养lw。1. 5培养基
Sigma Sigma Sigma Invitrogen TaKaRa TaKaRa TaKaRa Qiagen 上海生工 Invitrogen Invitrogen Sigma Sigma MB I
日本Kyowa Amresco SHIMADZU 上海生工 上海生工
上海源聚生物科技有限公司 上海生工
1.5.1YM 培养基 1L蒸馏水中含有酵母提取物3g，麦芽提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g， pH 5. 0。高压灭菌备用。1. 5. 2LB液体培养基1L蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，用ION NaOH调节pH值至 7.0，高压灭菌备用。1. 5. 3LB固体培养基1L LB液体培养基中加入琼脂粉15g溶解，高压灭菌备用。1. 5. 4 含 Amp LB 培养基经灭菌后呈液态的LB培养基冷至50°C时，加入Amp至终浓度为50 u g/ml。1. 6常用溶液及配制1. 6. 11M IPTG, 200mg IPTG溶于1ml去离子水中，过滤除菌分装，_20°C保存。1.6. 21M〇&(12储存液，200ml纯水中溶解54g，用0. 22iim的除菌滤器过滤，每 10ml分装保存于-20°C ； 100mM的工作液将储存液用4°C预冷的无菌纯水稀释至100mM。 1. 6. 310% SDS，在90ml水中溶解10g电泳级的SDS，加热至68°C助溶，调pH至7. 2，加水定 容至1L。1. 6. 412 % SDS-PAGE 分离胶，纯净水 1. 6ml，30 % 聚丙烯酰胺 2. 0ml, 1. 5M Tris ‘ Cl(pH 8. 8)) 1. 3ml, 10% SDS 0. 05ml，10%过硫酸铵 0. 05ml，TEMED 0.002ml。1.6. 5考马斯亮蓝蛋白定量染液，将lOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇 中，加入100ml磷酸，然后加水定容至1L，滤纸过滤，4°C保存。1. 7主要仪器超声波仪KQ-100A中国昆明HPLC仪LC-6日本岛津2.方法2. 1橙皮苷提取橙皮苷提取自陈皮，采用超声提取方法。4g陈皮被粉碎为粒径大小为0. 5 1mm 粉末，200ml甲醇溶解，40°C 60mHz超声60min，重复一次。将甲醇超声提取液过滤后蒸发干 燥，残留物溶解于含5% (v/v)丙二醇的水中，终浓度为10mg/ml。所得溶液用0. lml 0. 01M 草酸酸化，HPLC定量。2. 2 从 S. Singularis 中提取 BglA 蛋白收集处于对数生长中期的S. Singularis细胞，离心(2，000Xg,5min)。使用50mM 磷酸钠缓冲液(PH 7. 0)冲洗沉淀两次后，使用50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 4. 0)溶解沉 淀，37°C下使用(wAOUsukizyme作用2h。可溶性产物与上清液混合均勻得粗提物。2.3.克隆、表达bglA基因2. 3. 1 总 RNA 提取及 RT-PCR(1)当 S. Singularis 生长到对数生长期(OD660 = 2X 108cells/ml)时，使用 50mM磷酸柠檬酸缓冲液冲洗细胞。在150 ill冲洗液加入500 ill Trizol，震荡混勻 30s，冰上放置5min。(2)加入氯仿(0. 2ml氯仿/ml Trizol)，剧烈震荡15s，冰上放置 lOmin。(3)4°C 12，OOOrpm离心15min，取上清移至新管。(4)加入异丙醇(0. 5ml异丙醇/mlTrizol)，混勻震荡，冰上放置 lOmin。(5)4°C 12，OOOrpm 离心 15min，弃上清。(6)75% 乙 醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，垂直震荡，4°C 12，OOOrpm离心5min。重复一次。(7)弃上清， 室温干燥沉淀，DEPC水溶解RNA。-70°C保存。(8)RT:冰浴中加入总 RNA5. 0u 1Oligo(dT) 181. 0u 1混勻离心3-5s，70°C 5min，冰浴lmin，离心3_5s。继续加入dNTP(lOmM)2. 5 u 15XRT buffer4. 0 u 1RNase inhibitor(40U/ml) 0. 5u 1M-MLV(10U/u 1)2. 0u 137 °C lh，70°C 15min，所得 cDNA 分装，-20°C 保存。(9)PCR反应体系利用GeneBank 中已公布的 S. Singularis bglA 基因序列(GI :62533244)，用 Gene Runner软件设计引物。引物由Invitrogen公司合成。引物序列如下上游引物5' -CGC GGATCCATGATGCTGCATGCGGCAC-3‘(序列表 3)
下游引物5' -CCCAAGCTT TCAGAGGTGGTTGCGACC-3 ‘(序列表 4)
PCR反应体系
模板cDNA4u 1
lOXEx Taq buffer5u 1
dNTP1 u 1
上游引物1 u 1
上游引物1 u 1
Ex Taq0. 5u 1
ddH2037. 5u 1
总体积50 u 1
经优化后的PCR循环参荽文为94°C 2min, 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2min 30 个循环，
72°C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶检测仪检测结果。PCR产物用TaKaRa琼脂糖凝 胶DNA纯化试剂盒回收、定量、分装，-20°C保存。2. 3. 2重组载体的构建及鉴定(1)酶切BamH I 1 u 1, Hind III I 1111，共用10父1( buffer lyl，DNA 片段 5 Pi (或质粒4 ill)，ddH20 2 ill (或3 ill)，总体系为10 ill。混勻，离心3 5s，37°C酶切 2h。回收酶切产物，2%琼脂糖凝胶电泳定量。(2)连接质粒 lii 1，DNA片段4ii l，2XLigation MasterMix 5 ii 1，总体系 10 ii 1。 混勻，16°C连接过夜。(3)重组载体转化E. coli TOP 10感受态细胞①将10 u 1连接产物加入50 yl感 受态细胞中，混勻，冰浴30min。②42°C热休克30s，立即置冰浴中。③加入500 yl 37°C预 温LB液体培养基，37°C 200rpm振摇培养lh。④取适量上述转化菌液涂布于37°C预温含 Amp LB平板，37 °C培养过夜。
(4)重组载体的筛选和鉴定①PCR鉴定。挑取含Amp LB平板上单菌落接种于含 Amp LB液体培养基中，37°C 200rpm振摇培养过夜。按试剂盒说明书用小型质粒提取试剂 盒从菌液中提取质粒。以提取的质粒DNA为模板，用前述引物进行PCR扩增，扩增条件与参 数同前，琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶检测仪检测结果。②酶切鉴定，酶切反应体系如表2所 示。③测序鉴定，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的重组质粒由北京赛博基因有限公司测序鉴 定，鉴定正确的质粒命名为pQE30-Xa-bglA。表2重组质粒pQE30-Xa-bglA酶切反应体系(单位μ 1) 混勻，离心3-5S，37°C酶切过夜，2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。2. 3. 3重组载体表达将构建正确的重组表达质粒pQE30-Xa_BglA转化E. coli M15 (pREP4)，操作步骤 同上。将培养过夜的阳性克隆菌液，按1 100接种4ml Amp抗性LB，37°C摇床培养至OD值 处于0.6 0.8之间。加入终浓度为0. 4mM IPTG，37°C振摇培养3h。取菌液lml，12，OOOXg 30s收集沉淀，加入100 μ 1 IXSDS加样缓冲液重悬，同蛋白Marker—起70°C lOmin，离心 12，OOOXg lmin，取上清，Bio-Safe考马氏亮蓝G250染色，12% SDS-PAGE凝胶电泳分析结^ ο2. 4BglA蛋白的β -葡萄糖苷酶活性检测使用对硝基-β -D-吡喃葡萄糖苷(ΡΝΡ- β -Glc)作为底物，孵育混合物(总体积 =lml)包含1. 5mM PNP-β -Glc，50mM磷酸缓冲液(pH6. 0)以及0. Iml BglA蛋白真菌提取 物或E. coli表达纯化产物。37°C孵育4h后，加入4ml 0. 25M Na2CO3终止反应。420nm波 长下测量吸光度。2.5体外BglA蛋白水解橙皮苷实验分别从S. Singularis和E. coli中提取BglA蛋白，检测出其酶活性后，进行体外 BglA蛋白水解橙皮苷实验。每一酶反应体系(lml体积)包含0.5 μ M橙皮苷、50mM柠檬酸 磷酸缓冲液(PH6. 0)以及相当于0. Olmg酶活性的BglA蛋白。反应混合物在加入酶前先在 40°C预孵育5min，在加入酶后再在40°C孵育30min，最后煮沸5min终止反应。同时设立相 同反应条件下的两个对照，一为葡萄糖苷酶商品阳性对照，另一为橙皮苷空白对照。反 应体系中的橙皮苷和橙皮素用HPLC方法定量。用于HPLC检测的标本先经3，OOOXg离心 20min，取上清，再用500 μ 1甲醇提取，提取所得的有机相被转移到微离心管中，真空干燥。 干燥所得产物使用ΙΟΟμΙ甲醇再溶解并3，OOOXg离心lOmin，所得上清用于HPLC分析。每一实验重复三次。2. 6HPLC方法检测大鼠血浆标本中的橙皮苷和橙皮素。2. 6.1色谱条件使用YWG-C18(4. 6X150mm，5iim)色谱柱，流动相为甲醇0. 04M KH2P04(两者体 积比为40 60，使用H3P04调节pH到4. 0)，进样量为20 u 1，柱温为30°C，流速为lml/min, 检测波长为283nm。2. 6. 2血浆标本预处理取大鼠血浆标本50 ill，用等量溶于0. ImM醋酸钠缓冲液(pH6. 8)的3 -葡萄糖 醛酸酶H-5(500U/ml)37°C孵育90min，0. 01M草酸100 yl终止酶作用。向反应混合物中加 入500iU甲醇涡旋混勻2min，3000Xg离心lOmin，提取上清液体，真空干燥，100 yl甲醇 重悬、3，000 X g离心lOmin，取上清进行HPLC检测。2. 6. 3分析方法确证本研究代表性HPLC谱图如图2所示。配制一定浓度的橙皮苷和橙皮素标准品溶 液，进样20 yl，得图2(A)，显示橙皮苷的保留时间tK = 20. 38min，橙皮素的保留时间tK =10. 77min，说明本研究所使用HPLC方法可完全区分橙皮苷和橙皮素；取大鼠空白血浆 50 u 1，按照血浆样本预处理方法2. 6. 2操作，进样20 u 1，得色谱图2 (B)；将一定浓度橙皮 苷和橙皮素标准品溶液加入到空白血浆中，依照同法操作，得色谱图2(C)。结果表明，大鼠 血浆中内源性物质不干扰本研究中使用的HPLC方法检测橙皮苷和橙皮素。2. 6. 4标准曲线和线性范围分别取空白血浆50iU，加入橙皮苷标准品和橙皮素标准系列溶液50iU，配制成 分别相当于橙皮苷和橙皮素血浆浓度为0. 002,0. 005,0. 02，0. 05，0. 2，0. 5和1 y mol/L的 样品，按上述方法进行操作，建立标准曲线。以待测物浓度为横坐标，待测物峰高度为纵坐 标，用加权(W= 1/C2)最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为橙皮苷和橙皮 素的标准曲线。橙皮苷的标准曲线方程为y = 0. 1676x-0. 0092，r2 = 0. 998 ；橙皮素的标 准曲线方程为y = 0. 1083x-0. 0065,r2 = 0. 998。则由本HPLC测量方法得到橙皮苷和橙皮 素的线性范围分别为3. 5 1000nmol/ml和1. 5 1000nmol/ml。2. 6. 5定量下限用空白血浆分别配制浓度为3. 5nmol/L的橙皮苷溶液和1. 5nmol/L的橙皮素溶 液，则分别相当于含橙皮苷血浆浓度为3. 5nmol/L和含橙皮素血浆浓度为1. 5nmol/L的样 品。对此两样品进行5样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。则在此待 测浓度下，橙皮苷和橙皮素的日内精密度(RSD)分别为13. 4%和12.9%，准确度(RE)分别 为16. 5%和17.8%。结果表明本研究所使用的HPLC法测量橙皮苷和橙皮素的定量下限分 别为 3. 5nmol/L 和 1. 5nmol/L。2. 6. 6方法精密度和准确度取空白血浆50 iU，按“标准曲线和线性范围”项下方法制备橙皮素低、中、高浓度 (0. 005,0. 05和0. 8 y mol/L)的质量控制样品，每一浓度进行5样本分析，连续测定3天，并 与标准曲线同时进行，计算质量控制样品的测得浓度，将测得浓度与配制浓度比较计算得 本研究HPLC测量方法的准确度和精密度，结果如表3所示。实验数据表明，橙皮素日内精 密度均小于7 %，日间精密度均小于11%，准确度在士4. 2 %之内，说明测定橙皮素的HPLC分析方法符合有关国际规范要求。2.6. 7提取回收率考察取空白血浆50 iU，按“标准曲线和线性范围”项下方法制备橙皮素低、中、高浓度 (0. 005,0. 05和O.Symol/L)的质量控制样品，考察样品提取回收率。结果发现三种浓度下 样品的回收率均>95%。表3检测大鼠血浆中橙皮素HPLC方法的精密度和准确度，(n = 5) 2. 7橙皮苷大鼠体内药代动力学实验2. 7.1 口服给药实验雄性Wistar大鼠(6周龄，180 220g)试验前一天禁食，试验前称重，按体重随 机分组，每组5只，共分5组，即为橙皮苷提取物组、橙皮苷提取物经S. Singularis中提取 BglA蛋白作用组、橙皮苷提取物组经表达于E. coli中BglA蛋白作用组和两个标准品对照 组，即橙皮苷标准品组和橙皮素标准品组。给药剂量参照中国药典推荐的陈皮剂量，经换 算，用于大鼠的剂量为橙皮苷18. 9mg/kg，橙皮素9. 4mg/kg。口服给药后取血时间分别为灌 胃后0，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14和24h。经颈静脉插管采集血液标本。血液标本采取后 经10，000乂8离心21^11，在301^11内收集血浆贮存于-20°C。HPLC检测前血浆标本的预处 理如前2. 6. 2所述。2. 7. 2静脉给药试验雄性Wistar大鼠(6周龄，180 220g)试验前一天禁食，试验前称重，按体重随机 分为5组，每组5只。分组情况和给药剂量与口服给药组相同。药物经静脉给药前先经过 滤，10，OOOXg离心2min，并经溶血性检测为非溶血性物质，再高压灭菌后静脉注射。取血 时间分别为静脉注射后0，0.5，1，2，4，6，8，12和24h。经颈静脉插管采集血液标本。血液标 本采取后经10，000\8离心2!^11，在30111111内收集血浆贮存于_20°C。HPLC检测前血浆标 本的预处理如前2. 6. 2所述。2. 8检测指标及统计学分析大鼠血浆总橙皮素检测结果药物动力学分析采用WinNonlin分析软件(Version 5. 2Build 200701231637,Pharsight,CA)。药代动力学各参数计算采用非房室模型分析、线 性插值法及标准方程方法，各个参数所采用的计算公式如下所示。分别计算每只大鼠的血 药浓度曲线，使用SPSS 11. 5进行参数多组比较的方差分析。
公式 3
公式 4
公式 5结果3.1 重组质粒 pQE30-Xa_bglA 构建3. 1. 1获得目的基因bglA基因利用特异性引物，以S. Singularis总RNA逆转录的cDNA为模板，扩增bglA基因， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见1785bp片段，大小与预期结果相符，未发现非特异性扩 增条带，如图3所示。3. 1.2重组质粒鉴定3. 1.2. IPCR 鉴定bglA基因扩增产物经双酶切、纯化回收后，插入载体pQE_30Xa，转化Ε. co 1 i T0P10。经Amp平板筛选后，挑取菌落，摇菌，提取质粒，以质粒为模板进行PCR，琼脂糖凝胶 电泳后可见1785bp的片段。3. 1.2. 2 酶切鉴定重组质粒pQE30-Xa-bglA酶切结果如图4所示。可见单酶切的片段大小是空质粒 和基因片段大小之和，而双酶切的两条带与空质粒和目的基因片段大小符合。说明重组质 粒大小及插入方向是正确的。3. 1.2. 3 测序鉴定测序结果表明bglA目的基因插入正确，符合pQE30_Xa载体的读码框架。3. 2 重组质粒 pQE30-Xa_bglA 在 E. coll 中的表达经转染bglA基因后，从E. coli M15(pREP4)细胞中提取的BglA蛋白SDS-PAGE分 析结果如图5所示，电泳可见一大小为约为66Kda的明显条带。此条带的分子量大小与由 bglA基因氨基酸序列推导出的分子量期望大小65. 67KD十分符合。在没有转染bglA基因 的E. coli M15(pREP4)细胞提取物中没有检测到此明显蛋白条带。3. 3BglA蛋白体外水解橙皮苷橙皮苷体外被BglA蛋白水解结果如图6所示。橙皮苷空白对照组中未检测到橙皮 素产生。从S. Singularis分离出的BglA蛋白和在E. coli M15(pREP4)中克隆表达的BglA 蛋白均能将橙皮苷水解为橙皮素，而两种来源的BglA蛋白水解橙皮苷的情况与β -葡萄糖 苷酶商品对照组之间的差别无统计学意义(P > 0. 05)，说明β _葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋 白将橙皮苷由糖苷水解为苷元，而苷元比糖苷具有更强的活性。3. 4单次静脉给药后BglA蛋白生物转化橙皮苷对大鼠体内总橙皮素药代动力学 的影响。在既往橙皮苷药代动力学研究中发现，机体摄入的橙皮苷和橙皮素经吸收代谢 后，人体血浆中主要活性代谢产物是橙皮素葡萄糖醛酸化合物，而其他类型的活性代谢产 物，如橙皮素硫酸酯化合物及橙皮素葡萄糖醛酸硫酸酯化合物在血浆中仅少量存在。其他 橙皮苷药代动力学相关研究也发现如在检测血浆药物浓度前，血浆标本不使用β-葡萄糖醛酸酶作用，则将不能在血浆标本中检测到游离橙皮苷或橙皮素，从而从另一方面说明橙 皮苷摄入后在血浆中并非以原形或其苷元形式存在，而是以代谢化合物形式存在。因此根 据这些文献报道以及目前尚无橙皮素葡萄糖醛酸化合物标准品商品出售的情况，本研究在 HPLC检测前，也使用了 葡萄糖醛酸酶作用各血浆标本以释放橙皮苷苷元(见本部分方 法2. 6. 2)，并将0 -葡萄糖醛酸酶水解产物命名为“总橙皮素”。单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素血药浓度_时间曲线分析结果如图7所示。表4单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素药代动力学参数(1± 5，n = 5) a橙皮苷标准品和橙皮素标准品的AUCObs之间的差别有统计学意义(P < 0. 05)。b橙皮苷提取物+BlgA蛋白组AUCObs，Vz, CL和橙皮苷提取物对照组之间的差别 有统计学意义(P < 0. 05)。橙皮苷标准品和橙皮素标准品组几个重要药代动力学参数结果如表4所示。可见 静脉给药后，橙皮素标准品组AUC值(为61. 5nmol hr/ml)远远高于橙皮苷标准品组的AUC 值(为30. lnmol hr/ml)，可见其相对生物利用度约是橙皮苷标准品组的2倍。橙皮素标 准品组血浆清除率(为0. 56ml/hr)快于橙皮苷标准品组(为1. 17ml/hr)，可见此两组血浆 清除率差别趋势与此两组AUC值差别相一致。但是，橙皮素标准品组分布容积(为5. 40ml) 要比橙皮苷标准品组(为10. 73ml)小得多。本研究除了以橙皮苷标准品和橙皮素标准品为 研究对象，同时我们也给大鼠注射了经或不经0 _葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮 苷提取物，而据本研究体外实验结果BglA蛋白能够将橙皮苷水解为橙皮素。单次静脉给药 结果表明，橙皮苷提取物如不被0 -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用，而单独注射于大鼠 时，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化与橙皮苷标准品的类似；而如被葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白作用，不管是使用从S. Singularis细胞中提取的还是表达于E. coli中BglA 蛋白，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化都与橙皮素标准品的类似，如表4所示。但是当将橙皮苷提取物对照组与橙皮苷标准品组相对比时，可见橙皮苷提取物对 照组血浆总橙皮素的AUC更小、血浆清除率更快、分布容积更大，如表4所示。这一结果表 明由于本研究所用橙皮苷提取于中药陈皮，则提取物内可能还含有其他植物性化合物，而 这些植物性化合物会干扰橙皮苷体内代谢，从而影响到橙皮苷药代动力学各参数数值。
3. 5单次口服给药后BglA蛋白生物转化橙皮苷对大鼠体内总橙皮素药代动力学 的影响。本研究不但观察了大鼠经静脉注射给予经或不经BglA蛋白生物转化作用的橙皮 苷提取物的血浆总橙皮素药动学行为，而且观察了灌胃给予经或不经BglA蛋白生物转化 作用的橙皮苷提取物的血浆总橙皮素药动学行为，并通过比较相同剂量两种给药途径后的 药物动力学参数来计算大鼠给药后的绝对生物利用度，如表5所示。本研究结果表明，各实验组橙皮苷和橙皮素均能被实验中大鼠吸收。橙皮素标准 品组和两个经β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮 素达到最大血药浓度(Cmax)的时间约在摄入后4h，明显短于橙皮苷标准品组和橙皮苷提取 物对照组(Tmax = 6h)，如图8和表5所示。在橙皮苷提取物对照组和橙皮苷标准品组中，药 物口服2h后才可在大鼠血浆中检测到橙皮素，血浆总橙皮素在6h达到峰值，两组峰值分别 为0. 20 μ M和0. 35 μ M ；另一方面，在两个经β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮 苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化与橙皮素标准品的相类似。当大鼠摄入 橙皮素标准品或者经生物转化的橙皮苷提取物后，血浆总橙皮素在摄入后30min内即可被 检测到，三组均在摄入后4h达到Cmax (分别为0. 82 μΜ,Ο. 74μΜ和0. 95 μ Μ),如表5所示。 可见，此橙皮素标准品组和两个经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组 的Cmax和Tmax水平相类似，认为BglA蛋白生物转化能够将橙皮苷水解为橙皮素。另外，由于既往橙皮苷和橙皮素药代动力学方面的研究均是单独进行，所以本研 究是首次在同一实验室中进行的橙皮苷和橙皮素口服给药及静脉给药两种给药方式的药 代动力学平行对比实验。综上可见，当静脉给药时，与葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用组相比，橙皮苷 提取物对照组吸收较慢、AUC值减小约2倍；当灌胃给药时，橙皮素标准品组和橙皮苷标准 品组之间的AUC值之间相差3倍，而经与不经β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用橙皮苷 提取物组间AUC值之间的差别达到4倍多。灌胃给药结果与静脉给药结果相类似的是，由 于橙皮苷提取物中可能还含有其他植物性化合物成分，这些植物性化合物会干扰橙皮苷体 内吸收与代谢过程，因此橙皮苷提取物经口服给药的大鼠药代动力学结果与其标准品之间 也存在很大不同。表5单次口服给药后大鼠血浆总橙皮素药代动力学参数(7± s，η = 5) a橙皮苷标准品和橙皮素标准品的AUCObs之间的差别有统计学意义(P < 0. 05)。b橙皮苷提取物+BlgA蛋白组AUCObs，Vz, CL和橙皮苷提取物对照组之间的差别 有统计学意义(P < 0. 05)。讨论本发明结果亦显示此BglA蛋白具有葡萄糖苷酶活性，是葡萄糖苷酶同 工酶，体外可将橙皮苷水解为橙皮素(图6)。迄今，已克隆表达出的真菌BglA蛋白均具有 β -葡萄糖苷酶活性，其氨基酸序列分析结果表明这些真菌的BglA蛋白互相之间具有很高 同源性，表现出的β-葡萄糖苷酶活性均属于糖基水解酶家族1的B亚科，而此亚科包含的 酶均能够水解β-葡萄糖苷类。本研究克隆S. singularis的bglA基因，将之与表达载体 pQE30-Xa相连接组成重组质粒pQE-30Xa_bglA，并成功在E. coli中表达。本发明体外实验结果发现实验真菌菌株的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对 橙皮苷具有水解作用，提取自S. singularis菌株和表达自E. coli菌株的BglA蛋白均可 将橙皮苷水解为橙皮素(图6)；体内实验结果发现，大鼠通过口服或静脉给药方式摄入经 β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物后，相比较于橙皮苷提取物对照组， 大鼠体内血浆总橙皮素药代动力学有很大变化(图7和图8)，如血浆总橙皮素浓度明显增 高，达到最大血药浓度的时间Tmax明显缩短。同时发现，在两个经β-葡萄糖苷酶同工酶 BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮素的药代动力学与橙皮素标准品组的 相类似，并明显高于橙皮苷标准品组(表4和表5)。因此，利用葡萄糖苷酶同工酶BglA 蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮中橙皮苷的生物利用度。在本发明中，体外实验结果表明葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白具有将橙皮苷水 解为其苷元的能力，体内实验结果表明橙皮苷提取物经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生 物转化后，生物利用度提高。既往经Caco-2细胞模型、大鼠体内及人体体内药代动力学实 验均发现橙皮素比橙皮苷吸收得快。因此结合体内外实验结果，本研究认为相比较于橙皮 苷提取物对照组，BglA蛋白生物转化组橙皮苷生物利用度提高是由于在β -葡萄糖苷酶同 工酶BglA蛋白作用下橙皮苷被转化为橙皮素。本发明使用β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化陈皮中的主要活性成分橙 皮苷，口服给药和静脉给药两种给药途径的药代动力学结果均表明此酶的生物转化作用提 高了橙皮苷的生物利用度，因此本研究方法有助于将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中 应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药药效。
另一方面，由本研究结果，苷的最大血药浓度Cmax相对较低，而Tmax相对较长(图8)，可见橙皮苷的吸收差、排泄快，但是其半衰期较长(6h)。形成此长半衰期的原因首先是 由于橙皮苷吸收相长于橙皮素吸收相(表5)。研究已知机体内只有回肠和结肠部富含能 够分泌葡萄糖苷酶的细菌，所以摄入体内的大部分苷(即橙皮苷)需要进入回肠和结 肠代谢后才能被吸收。在回肠和结肠部，苷被肠道细菌产生的葡萄糖苷酶水解为相应 苷元而被吸收。正是由于苷在吸收前需要先经肠道细菌水解为相应苷，而只有在结肠和回 肠部苷才会被逐步水解为大量苷元，所以苷摄入后出现相对较长的Tmax，导致苷的吸收相延 长。 橙皮苷体内代谢半衰期较长的另外一个原因是在体内，其苷元橙皮素在被肠道细 胞吸收后要参与肠道再吸收和肝肠循环两个循环，本研究结果亦表明单次摄入橙皮苷时， 血浆总橙皮素浓度在摄入后24h仍然保持在一定水平(图7和图8)。苷被摄入体内后，先 被水解为其苷元，继而苷元被吸收入肠上皮细胞内。在肠上皮细胞内苷元在II相酶作用下 被进一步代谢，发生结合反应形成代谢结合物，如经葡萄糖醛酸化反应生成橙皮素葡萄糖 醛酸化合物和经硫酸酯化反应生成橙皮素硫酸酯化合物。这些代谢化合物生成后一部分被 肠上皮细胞和肝细胞排泄出体外，而另一部分被重新外排到肠腔中，如图9所示。在回结肠 部，这些代谢化合物可被肠道细菌产生的β-葡萄糖醛酸酶或/和硫酸酯酶水解而再次释 放出苷元，水解释放出苷元可被重吸收入血液循环。本研究认为相比较于橙皮苷提取物对照组，β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用 组和橙皮素标准品组生物利用度提高的另一个原因是由于苷在体内的清除率(clearance， CL)较快。清除率是指单位时间从体内消除的含药血浆体积或单位时间从体内消除的药物 表观分布容积。从研究结果可知，在口服给药和静脉注射给药这两种给药方式下观察，苷的 CL均快于苷元(表4和表5)。由于本实验是首次在同一实验室中同时进行的橙皮苷及其 苷元药代动力学实验，所以本实验结果首次说明橙皮苷(苷)在体内比橙皮素(其苷元) 清除得快。目前研究认为造成苷生物利用度低的原因包括苷在肠道细胞上的低透过性、苷 被细胞膜上的载体如多重耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein 2， MPR2)等的外排效应、以及当苷被消化成苷元而被吸收后的被进一步代谢过程’但尚未有关 于苷的体内清除与苷生物利用度低之间关系的报道，因此本研究结果是对现有苷低生物利 用度现象解释的补充。综上所述，本发明是在同一个实验室中，同时进行橙皮苷及其苷元，同时进行静脉 给药和口服给药的较全面的比较性研究。研究结果首次表明血浆快速清除率和目前已知的 低透过性、低水溶性、或/和肠道外排作用类似，都与类黄酮苷类的生物利用度低有关。由 于橙皮苷的苷元，橙皮素比其苷易于吸收、且清除较慢，从而苷元生物利用度高，因此遵循 传统的发酵方法，使用真菌的BglA蛋白作用于陈皮，可使陈皮中橙皮素的含量增多，生物 利用度提高，进而增强陈皮的生物活性。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述 申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明 书中所举实例实施方式的限制。序列表
〈110〉天津医科大学〈120〉β -葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途<160>4<210>1 <211>1785bp<212>DNA<213>S. singularis bglA 菌株<400>1atgatgctgc atgcggcact gctcgttgcg ctcccctgcg tggttcttgc tcgtcccgcc60ggtgcagtta cctaccccgg tgcgattcca cttagcttga ccagcaatta cgagacgccg120agtccgaccg ccatccccct ggagccgacc ccaacggcga ccggaaccgc cgaacttgat180gcgctctgga atttggtgga agcacagtac cctgttcaga cggcggctgt caccaccctg240gtgacggtgc ccgacgacta caagtttgaa gcagaccctc cttcctatgc tcttgctggc300tacgagacat cagaaattgc cggcttgaag ttcccgaagg ggttcaagtt tggcgtggcc360ggcgcggcta ttcaagtgga aggcgcagcg aaagcagagg gacgaggccc atccacttgg420gattacttgt gccaccatta cgcgtccaca cagtgcaaca actatgatcc tgacattacg480acgaaccatt actaccttta ccctcttgat ttcgcccggc tccagcatct aggcatcaac540acgtattcgt tttcaatctc ctggactcgt atataccctc tgggtgctgg ctacgttaac600gaagccggtt tggcgcatta cgacgcggta atccactcgg ccaagaagta cgggctggag660cctgtcggaa cagtatttca ctgggacacc cctctcagcc tcatgctcaa atatggcgcg720tggcaagata ccggcgacca gatcgttaaa gatttcgtca catacgccac caccgtcttc780aaacgatacg gtaatgaagt caagacctgg ttcacgttca atgagcctcg cgtgttctgt840tctcaaaaca gtggccttcc ctataacctc acgtatcctg agggaatcaa ctcaacttca900gccgtcttcc ggtgtactta taacgtcctg aaagcccatg gccacgcggt taaggtttac960cgggatctcg ttgccagcgg aaccattgct gctggagaga tcggcttcaa gtcggacgac1020aactacccaa tcccagcgcg gcccggaaac gcggacgacg aggaatccgc caaacgtcac1080gaagcgttcc gaatcggaat ctttgcccag ccagtttacg gaaacggcga ctatcctgat1140gtagtaaaag agaccgttgg cgacatgctg cccgccctga cggatgagga caagggctac1200atcaagggca gcggcgacat cttcgccatt gacggttacc ggaccgatat ctcgcatgcc1260gcactgaatg gaatcgcgaa ttgcatcaga aaccagtcgg accctaactg gcctgtttgc1320gaggaagggt ctgacccgtt cgcccacgta tacccgtctg gtttcgccat cggccagtcc1380gccgatccgc tgtcgtcatg gctcgtcaac tccgccccat ttattcgcga ccagctgaag1440ttcctcactc aaacgtaccc ggcaaaggga ggtatttact tcagcgagtt tgggtgggcc1500gaggatgcgg agtacgaccg ccagctgttg taccaaatca cctgggacgg tcttaggacc1560cagtatctca ctgactacct gtcccaactc ctgctcgccg tccataagga tgggattaat1620cttcgcggcg cgttaacctg gagtttcgtc gacaactggg aatggggact ggggatgcaa1680cagaaattcg gattccagtt tgtcaatcag tcggacccag atctcaccag gaccttcaaa1740ctctctgcgc acgcttacgc tcaatttggt cgcaaccacc tctga1785<210>2
<211>594<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN <222>(1). . (594)<400>2Met Met Leu His Ala Ala Leu Leu Val Ala Leu Pro Cys Val Val Leu151015Ala Arg Pro Ala Gly Ala Val Thr Tyr Pro Gly Ala lie Pro Leu Ser202530Leu Thr Ser Asn Tyr Glu Thr Pro Ser Pro Thr Ala lie Pro Leu Glu354045Pro Thr Pro Thr Ala Thr Gly Thr Ala Glu Leu Asp Ala Leu Trp Asn505560Leu Val Glu Ala Gln Tyr Pro Val Gln Thr Ala Ala Val Thr Thr Leu65707580Val Thr Val Pro Asp Asp Tyr Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Ser Tyr859095Ala Leu Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Glu lie Ala Gly Leu Lys Phe Pro100105110Lys Gly Phe Lys Phe Gly Val Ala Gly Ala Ala lie Gln Val Glu Gly115120125Ala Ala Lys Ala Glu Gly Arg Gly Pro Ser Thr Trp Asp Tyr Leu Cys130135140His His Tyr Ala Ser Thr Gln Cys Asn Asn Tyr Asp Pro Asp lie Thr145150155160Thr Asn His Tyr Tyr Leu Tyr Pro Leu Asp Phe Ala Arg Leu Gln His165170175Leu Gly lie Asn Thr Tyr Ser Phe Ser lie Ser Trp Thr Arg lie Tyr180185190Pro Leu Gly Ala Gly Tyr Val Asn Glu Ala Gly Leu Ala His Tyr Asp195200205Ala Val lie His Ser Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Glu Pro Val Gly Thr210215220Val Phe His Trp Asp Thr Pro Leu Ser Leu Met Leu Lys Tyr Gly Ala225230235240Trp Gln Asp Thr Gly Asp Gln lie Val Lys Asp Phe Val Thr Tyr Ala245250255
Thr Thr Val Phe Lys Arg Tyr Gly Asn Glu Val Lys Thr Trp Phe Thr260265270Phe Asn Glu Pro Arg Val Phe Cys Ser Gln Asn Ser Gly Leu Pro Tyr275280285 Asn Leu Thr Tyr Pro Glu Gly lie Asn Ser Thr Ser Ala Val Phe Arg290295300Cys Thr Tyr Asn Val Leu Lys Ala His Gly His Ala Val Lys Val Tyr305310315320Arg Asp Leu Val Ala Ser Gly Thr lie Ala Ala Gly Glu lie Gly Phe325330335Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Pro lie Pro Ala Arg Pro Gly Asn Ala Asp340345350Asp Glu Glu Ser Ala Lys Arg His Glu Ala Phe Arg lie Gly lie Phe355360365Ala Gln Pro Val Tyr Gly Asn Gly Asp Tyr Pro Asp Val Val Lys Glu370375380Thr Val Gly Asp Met Leu Pro Ala Leu Thr Asp Glu Asp Lys Gly Tyr385390395400lie Lys Gly Ser Gly Asp lie Phe Ala lie Asp Gly Tyr Arg Thr Asp405410415lie Ser His Ala Ala Leu Asn Gly lie Ala Asn Cys lie Arg Asn Gln420425430Ser Asp Pro Asn Trp Pro Val Cys Glu Glu Gly Ser Asp Pro Phe Ala435440445His Val Tyr Pro Ser Gly Phe Ala lie Gly Gln Ser Ala Asp Pro Leu450455460Ser Ser Trp Leu Val Asn Ser Ala Pro Phe lie Arg Asp Gln Leu Lys465470475480Phe Leu Thr Gln Thr Tyr Pro Ala Lys Gly Gly lie Tyr Phe Ser Glu485490495Phe Gly Trp Ala Glu Asp Ala Glu Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Tyr Gln500505510lie Thr Trp Asp Gly Leu Arg Thr Gln Tyr Leu Thr Asp Tyr Leu Ser515520525Gln Leu Leu Leu Ala Val His Lys Asp Gly lie Asn Leu Arg Gly Ala530535540Leu Thr Trp Ser Phe Val Asp Asn Trp Glu Trp Gly Leu Gly Met Gln545550555560Gln Lys Phe Gly Phe Gln Phe Val Asn Gln Ser Asp Pro Asp Leu Thr
565570575Arg Thr Phe Lys Leu Ser Ala His Ala Tyr Ala Gln Phe Gly Arg Asn580585590His Leu<210>3<211>28bp
<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcggatcca tgatgctgca tgcggcac28<210>4<211>27bp<212>DNA<213>人工序列<400>4cccaagcttt cagaggtggt tgcgacc2权利要求
一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，该基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列。
3.—种重组表达质粒，它含有权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶编 码基因。
4.权利要求3所述的重组表达质粒，所述重组质粒的载体为pQE30-Xa-bglA。
5.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制备提高苷类化合物 生物利用度药物方面的应用。
6.权利要求1所述的葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制备提高陈皮中橙皮 苷的生物利用度药物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA的基因SEQ ID NO1及SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明利用ATCC标准真菌菌株S.singularis，采用现代分子生物学技术，克隆、表达具有高β-葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物转化橙皮苷，将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药有效成分的药理作用。本发明首次在一个实验室中同时进行橙皮苷和橙皮素的口服给药和静脉给药两种给药方式的药代动力学平行对比实验。发现橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除较慢，从而补充了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。
文档编号C12N15/63GK101864439SQ20091006849
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者张晶, 朱泽, 李伟霞, 李光明, 李咏梅, 杜文才, 胡明 申请人:天津医科大学