专利名称：一种新型嗜热链球菌细菌素的生产方法
技术领域：
本发明涉及嗜热链球菌细菌素的生产方法。
背景技术：
细菌素是由细菌产生的，通常只作用于与产生菌同种的其它菌株或亲缘关系很近的种的 一种蛋白类抗菌物质。它是一种多肽或多肽与糖和脂的复合物。
乳酸菌所产的细菌素引起人们的特别兴趣。因为这些菌种总体上被认为是安全的。另外， 产细菌素的乳酸菌大多数来自于自然中的食物，所以它们特别适合用于食品中。
目前，对细菌素的研究主要是通过筛选发现产细菌素菌株，并对其特性进行研究。随着 对细菌素研究的进一步深入,有必要探明细菌素分子特性以及遗传学特性,而细菌素的纯化是 这些研究的重要基础。目前已经纯化出多种细菌素，纯化细菌素的方法多种多样，主要有 有机溶剂沉淀法、吸附法、热变性法、离子交换、凝胶层析、高效液相色谱等等。
近几年，寻找性状良好并能产细菌素的发酵剂菌种成为研究的目标。嗜热链球菌是链球 菌属的一种，革兰氏阳性，不产芽孢，无鞭毛，兼性厌氧，成对或成链状出现。嗜热链球菌 为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌， 调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。嗜热链球菌细菌素是 由嗜热链球菌产生的细菌素，是具有抗菌活性的肽类，在食品方面的应用很重要，尤其与乳 产品的生产有关。产细菌素发酵剂菌株在发酵酸奶的生产过程中可以使酸奶不易受杂菌污染， 并保证发酵过程的稳定性及产品的安全性。
目前国内论文尚未见到嗜热链球菌细菌素生产和应用的相关报道。关于嗜热链球菌产细
菌素的专利只有1994年雀巢公司申请的嗜热链球菌细菌素专利(专利申请号94190654.X)。 该专利报道了两种新的嗜热链球菌细菌素氨基酸序列，这两种细菌素的信号肽、编码细菌素 的核苷酸序列，特别是编码具有SEQ ID N0:3顺序细菌素的操纵子、产生至少一种该细菌素 的菌株，特别是CNCM I-1351菌株、含有至少一种该细菌素上清提取液的生产方法，该细菌 素在食品，特别是乳酪和酸奶以及化妆品生产中用作抗病原体的活性剂，其提取方法采用的 是三氯醋酸沉淀法。
国外一些文献有对嗜热链球菌产细菌素相关报道。Olivier Mareiset等人报道了采用装填 15-Phe树脂的HR16/10色谱柱从嗜热链球菌发酵液中分离纯化嗜热链球菌细菌素13,该细菌素 是由抗菌肽ThmA和加强因子ThmB组成的。A. G. Mathot等分离到产细菌素的嗜热链球菌580， 该菌产的细菌素对热不稳定，60 'C热处理1 h后活性完全丧失。
发明内容
本发明的目标是提供一种新型嗜热链球菌细菌素的生产方法。
本发明提供的嗜热链球菌细菌素是由嗜热链球菌(5^e/ tocoo^s AemopM^) CGMCC 1.1864发酵生产并经分离纯化后得到的。
嗜热链球菌细菌素的发酵生产方法采用的培养基为改良MRS培养基，其组成为葡萄 糖10~30 g/L、蛋白胨1~10 g/L、牛肉膏1~10 g/L、酵母膏0.5~5 g/L、 K2HP04'3H20 0.1~2 g/L、 乙酸钠0.5 5g/L、拧檬酸铵0.1~2 g/L、 MgS04.7H20 0.01~0.58 g/L、 MnSO40.01 0.25 g/L、 吐温-80 0.01~0.1 mL/L。
培养方式为三角瓶静置培养或低速摇床振荡培养，或发酵罐培养。
所述方法中的培养条件为28~37 'C，培养时间为12~36 h，培养至菌体密度约106~109 cfb/mL。
发酵得到的嗜热链球菌细菌素按照以下方法进行纯化
将按所述培养方法得到的发酵液调节pH 5.0-6.5， 4~30 'C振荡2~12 h使细菌素充分吸附 到菌体上。然后，离心收集菌体，用pH6.0的磷酸钠溶液(5mmol/L)洗涤菌体1~3次，最 后将菌体悬浮于pH 2.0的NaCl溶液(100mmol/L)中，振荡5~12 h后离心去除菌体。取上 清液调节pH 6.0，旋转蒸发，浓縮10 20倍，所得细菌素粗提液采用Sephadex G-25层析柱 进一步除盐和杂蛋白。凝胶层析洗脱条件为流速为0.5~2 mL/min,用去离子水进行洗脱， 合并收集的嗜热链球菌细菌素活性峰溶液。
为了进一步描述嗜热链球菌细菌素的特性，对抗菌活性进行了测定
测试菌株金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、李斯特氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、 弗氏志贺氏菌、绿脓假单胞杆菌、干酪乳杆菌。
抑菌活性分析方法先在无菌平皿中倒入10mL加热融化的素琼脂(2%)，待其充分冷 却凝固后，放入己灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排列整齐。分别将培养好的测试菌株稀 释至106~107 cfWmL,将灭菌好的15 mL固体MRS培养基冷却至50 。C左右，加入测试菌液1 mL，迅速混合均匀，倒入放有牛津杯的平皿中，冷却后用无菌镊子取出牛津杯。将嗜热链球 菌细菌素提取液100ixl加入到牛津杯形成的小孔中，37'C过夜培养，用游标卡尺测定抑菌圈 直径。
实验结果表明(如表1所示)，纯化的嗜热链球菌细菌素抑菌谱较广，不但能抑制革兰氏 阳性菌，对革兰氏阴性菌也有抑制效果，还可以抑制部分芽孢杆菌。
4表1嗜热链球菌细菌素抑菌谱指示菌来源抑菌圈直径(mm)
金黄色葡萄球菌ATCC 6358915.10
藤黄八叠球菌CMCC 29001—
李斯特氏菌实验室保藏12.02
大肠杆菌CGMCC 1,9013.84
鼠伤寒沙门氏菌CGMCC 1.117413.18
弗氏志贺氏菌CGMCC 1.186812.66
绿脓假单胞杆菌实验室保藏14.02
干酪乳杆菌实验室保藏15.12
对嗜热链球菌细菌素的部分生物学特性进行了测定
(1) 对酶的敏感性将蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、a-胰凝乳蛋白酶及cc-淀粉酶 分别配制成10 mg/mL的溶液，分别取100 |nl加入到400 pl嗜热链球菌细菌素提取液中，使 各种酶的终浓度为2mg/mL， 37'C下处理4h，未加酶的嗜热链球菌细菌素提取液作为对照， 检测酶对嗜热链球菌细菌素活性的影响。结果表明，嗜热链球菌细菌素提取液经以上各种酶 液处理后，无抑菌圈出现，即细菌素活性消失，对照抑菌圈直径不变，表明嗜热链球菌细菌 素为一种肽类物质。
(2) 对酸的稳定性将嗜热链球菌细菌素提取液用5 mol/L HC1和5 mol/L NaOH调节 pH为2.0 11.0。 37'C下温育4h,再将pH调至6.0，分别测定其抑菌活性。结果表明，嗜热 链球菌细菌素在pH3.0~9.0范围内活性保持稳定，pH>9.0时活性降低。
(3) 对热的稳定性将嗜热链球菌细菌素提取液在100'C处理2h，以未热处理的样品 为对照，测定其抑菌活性。结果表明活性基本不变。
具体实施例方式
下面用实例来说明本发明的技术方案，但不以实施例限制本发明。 实施例1
采用嗜热链球菌(areptocoaw//^wo; Wto) CGMCC 1.1864生产嗜热链球菌细菌素。 采用改良MRS液体培养基，该培养基配方为葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、
酵母膏5 g/L、 K2HP(V3H20 2 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸铵2 g/L、 MgS04'7H20 0.58 g/L、
MnS04 0.25 g/L、吐温-80 0.1 mL/L。 115 'C灭菌20 min。
首先在装有50 mL改良MRS液体培养基三角瓶中接种嗜热链球菌单菌落，30 'C静置培
养8 h。将培养好的种子以1%接种量接入装有200 mL改良MRS培养基的三角瓶中，30 'C下静置培养36h，至菌体量达到108~10ycfii/mL。 实施例2
采用改良MRS液体培养基，该培养基配方为葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、牛肉膏2 g/L、 酵母膏10 g/L、 K2HP04.3H20 1 g/L、乙酸钠1 g/L、柠檬酸铵1 g/L、 MgS04.7H20 0.1 g/L、 MnS04 0.05 g/L、吐温-80 0.05 mL/L。 115 。C灭菌20 min。
首先在装有50 mL改良MRS液体培养基三角瓶中接种嗜热链球菌单菌落，28 °C ， 50 r/min 摇床振荡培养6 h。将培养好的种子以2%接种量接入装有200 mL改良MRS培养基的三角瓶 中，28°C， 50 r/min摇床振荡培养18h，至菌体量达到108~109 cfu/mL。
实施例3
采用改良MRS液体培养基，该培养基配方为葡萄糖20 g/L、蛋白胨1 g/L、牛肉膏2 g/L、 酵母膏5g/L、 K2HP04'3H20 1 g/L、乙酸钠1 g/L、拧檬酸铵1 g/L、 MgS04.7H20 0.1 g/L、 MnS04 0.05 g/L、吐温-80 0.1 mL/L。 115 。C灭菌20 min。
首先在装有250mL改良MRS液体培养基的三角瓶中接种嗜热链球菌单菌落，30 'C静置 培养12h。将培养好的种子以lc/。接种量接入装有16L改良MRS培养基的发酵罐中，30'C， 用无菌空气维持罐压0.5 MPa，培养16 h。
实例4
采用改良MRS液体培养基，该培养基配方为葡萄糖10 g/L、蛋白胨1 g/L、牛肉膏1 g/L、 酵母膏0.5 g/L、K2HP04.3H20 0.1 g/L、乙酸钠0.5 g/L、柠檬酸铵0.1 g/L、MgS04.7H20 0.01 g/L、 MnS04 0.01 g/L、吐温-80 0.01 mL/L。 115 。C灭菌20 min。
首先在装有50 mL改良MRS液体培养基三角瓶中接种嗜热链球菌单菌落，37 。C静置培 养8h。将培养好的种子以5。/。接种量接入装有200mL改良MRS培养基的三角瓶中，37'C下 静置培养12 h。
实例5
将所得发酵液用5 mol/LNaOH调节pH 5.0， 4 'C振荡12 h使细菌素充分吸附到菌体上。 然后，5000 r/min离心10min收集菌体，用pH6.0的磷酸钠溶液(5 mmol/L)洗涤菌体1次， 最后将菌体悬浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，4 °C ， 150 r/min振荡5 h后5000 r/min 离心10min去除菌体。取上清液用5mol/LNaOH调节至pH6.0，旋转蒸发，浓縮10 20倍， 所得细菌素粗提液采用Sephadex G-25层析柱进一步除盐和杂蛋白。凝胶层析洗脱条件为 流速为0.5 mL/min，用去离子水进行洗脱。每4min接收l管。合并嗜热链球菌细菌素活性 峰溶液。
实例6
6将所得发酵液用5 mol/LNaOH调节pH 6.5， 25 'C振荡2 h使细菌素充分吸附到菌体上。 然后，5000 r/min离心10 min收集菌体，用pH6.0的磷酸钠溶液(5 mmol/L)洗涤菌体1次， 最后将菌体悬浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，25 °C 150 r/min振荡10 h后5000 r/min离心10min去除菌体。取上清液用5 mol/LNaOH调至pH 6.0，旋转蒸发，浓縮10~20 倍，所得细菌素粗提液采用Sephadex G-25层析柱进一步除盐和杂蛋白。凝胶层析洗脱条件 为流速为2mL/min，用去离子水进行洗脱。每2min接收l管。合并嗜热链球菌细菌素活 性峰溶液。
实例7
将所得发酵液用5 mol/LNaOH调节pH 6.0, 30 'C振荡6 h使细菌素充分吸附到菌体上。 然后，5000 r/min离心10 min收集菌体，用pH6.0的磷酸钠溶液(5 mmol/L)洗涤菌体3次， 最后将菌体悬浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，30 。C振荡2 h后5000 r/min离心 10min去除菌体。取上清液用5mol/LNaOH调节至pH6.0，旋转蒸发，浓縮10 20倍，所得 细菌素粗提液采用Sephadex G-25层析柱进一步除盐和杂蛋白。凝胶层析洗脱条件为流速 为lmL/min，用去离子水进行洗脱。每2min接收1管。合并嗜热链球菌细菌素活性峰溶液。
权利要求
1、一种采用发酵法生产嗜热链球菌细菌素的方法。其特征在于所述方法中的菌种为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC 1.1864，培养温度为28～37℃，培养基为改良MRS培养基，其组成为葡萄糖10～30g/L、蛋白胨1～10g/L、牛肉膏1～10g/L、酵母膏0.5～5g/L、K2HPO4·3H2O 0.1～2g/L、乙酸钠0.5～5g/L、柠檬酸铵0.1～2g/L、MgSO4·7H2O0.01～0.58g/L、MnSO40.01～0.25g/L、吐温-800.01～0.1mL/L。培养方式为三角瓶静置培养或低速摇床振荡培养，或发酵罐培养。培养时间12～36h，培养至菌体密度约106～109cfu/mL。
2、 根据权利要求1的方法，将发酵得到的嗜热链球菌细菌素进行纯化的方法。分离纯化 的主要步骤包括pH吸附释放法、旋转蒸发浓縮、凝胶层析。
3、 根据权利要求2的方法进行嗜热链球菌细菌素纯化。其特征在于将按所述培养方法 得到的发酵液调节pH 5.0~6.5， 4~30 'C振荡2~12 h使嗜热链球菌细菌素充分吸附到菌体上。
4、 根据权利要求2的方法进行嗜热链球菌细菌素纯化。其特征在于离心收集吸附了嗜 热链球菌素的菌体，用pH6.0的磷酸钠溶液(5mmol/L)洗涤菌体1~3次，最后将菌体悬浮 于pH2.0的NaCl溶液(100mmol/L)中，振荡5~12 h后离心去除菌体。
5、 根据权利要求2的方法进行嗜热链球菌细菌素纯化。其特征在于取离心后上清液调 节pH6.0，旋转蒸发，浓縮10-20倍。
6、 根据权利要求2的方法进行嗜热链球菌细菌素纯化。其特征在于将所得细菌素粗提 液采用Sephadex G-25层析柱进一步除盐和杂蛋白。凝胶层析洗脱条件为流速为0.5~2 mL/min，用去离子水进行洗脱，收集活性组分。
7、 该嗜热链球菌细菌素对热、酸稳定，10(TC处理2h，活性基本不变，在pH3.0 9.0范 围内活性稳定。抑菌谱较广，可应用于乳制品、肉制品、饮料、水果蔬菜、速冻食品、面食、 化妆品或洗涤用品、表抗菌材料、医药产品等。
全文摘要
本发明提供一种采用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC 1.1864发酵生产和提取嗜热链球菌细菌素的方法。该方法包括将活化的嗜热链球菌转接入改良MRS培养基中，在合适温度下培养一定时间得到含有嗜热链球菌细菌素的发酵液。嗜热链球菌细菌素的提取步骤主要包括利用嗜热链球菌细菌素对生产菌的吸附作用对其进行粗提，然后利用凝胶层析除去无机盐和杂蛋白进行精制。该提取方法简单、成本低、分离效果好。
文档编号C12P21/02GK101608201SQ20091006970
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月13日 优先权日2009年7月13日
发明者曹美娜, 琳 李, 王国良, 范宝庆, 莫治文, 谭之磊, 贾士儒 申请人:天津科技大学