专利名称：：葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法
技术领域：
：本发明属于细菌分子检测领域，特别是涉及一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是重要的食源性及医源性致病菌，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，而且其营养要求不高，耐盐性强，在多数种类的食品中均可存活，故食品受其污染的机会很多，如果条件适合，还会大量繁殖并产生足够剂量的肠毒素，这些毒性物质与食源性葡萄球菌中毒密切相关，是引起人类疾病的主要致病因子。食品安全事故中，首推2000年致使14000多人受感染的"雪印牛奶"事件，就是由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒事件，根据日本卫生部公布的数字，日本在1980-1999这二十年期间，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒共有2525次暴发，包括59964人；据美国CDC报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33%，加拿大的发生率更高，占细菌性食物中毒的45%(PanicoMG，CaporaleV，AgozzinoE.Investigatingonafoodborneoutbreak:analysisofthecriticalpoints.AnnIg.2006，18(3):191-197)。在我国，每年因葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件也屡见不鲜。葡萄球菌毒素引起的食物中毒除了最早被人们发现和熟知的五种肠毒素(SEA，SEB，SEC，SED，SEE)和毒性休克综合症毒素I(TSST-1)夕卜，近几年又陆续发现了SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SE0、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新的肠毒素，虽然已从基因水平确认了这些新型肠毒素，但关于其毒素蛋白及功能的研究甚少，甚至认为葡萄球菌肠毒素引起食物中毒病例中，95%是由先前发现的SEA-SEE几种肠毒素造成的。一些国家就其国内葡萄球菌分离株肠毒素基因型的分布作了调查，然而，不同报道的各型食源性葡萄球菌肠毒素所占的比例在各研究中都有所不同。至今为止，对已发现的葡萄球菌肠毒素系统分型鉴定方法仍未见报道。基因水平的探索导致新的葡萄球菌肠毒素不断被发现。金黄色葡萄球菌基因组含有多种IS元件、原噬菌体序列和致病基因岛等可移动元件，这些可移动元件的转移是导致金黄色葡萄球菌新肠毒素基因和高致病性毒株的不断产生的主要原因。葡萄球菌肠毒素基因簇和毒力岛等使得某些基因型肠毒素的出现呈现出很高的关联性。有研究表明，sek和sea毒素多伴生共存于同一菌株中，sek存在于葡萄球菌毒力岛SaPIl上，sea是由噬菌体①预u50A携带的，而噬菌体①预u50A又整合到毒力岛附近，其二者的紧密联系即可解释sea与sek的共存。另有研究称，毒力岛SaPIbov上包含基因tsst、sec和sel，也解释了这三者在同一菌株中同时出现的现象。目前，针对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测和诊断技术主要有四大类，即基于病毒抗原、抗体反应的免疫学方法和包括病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的核酸检测技术，以及传统的动物试验和新兴的生物传感器技术(高涛.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测7方法的研究进展[J].福建分析测试，2003，12(2):36-39.)。PCR技术能在数小时内使靶序列扩增上百万倍，并可直接进行样品检测，以其快速、灵敏、特异性强、操作简便、重复性好等优点，被广泛应用于生命科学等各个领域。但是，葡萄球菌肠毒素基因中AT含量较高，不同型肠毒素序列间的相似性也很高，而部分特定毒素基因型间还呈现密切的连锁关系，这给肠毒素的基因检测与分型带来困难。葡萄球菌是引起食物中毒最普遍的细菌之一，该菌产生的葡萄球菌肠毒素可引起中毒症状，造成呕吐、腹泻及休克等。葡萄球菌分布的广泛性、新型肠毒素基因产生的复杂与多样性、肠毒素强的耐热特性，使葡萄球菌肠毒素功能与检测的研究需求变得尤为突出。加强食品原料中葡萄球菌肠毒素检测与评价，成为食品安全控制的客观需要。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法。本发明的另一个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法。本发明的技术方案概述如下—种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，由下述步骤组成l)样品处理:取0.10.5ml样品，1000012000r/min，离心12分钟；2)DNA提取弃上清，加入400700iil灭菌水悬浮沉淀，1000012000r/min离心30秒1分钟；弃上清，加入100300iil试剂A于3540。C下作用2030分钟，加入试剂B，再于4555。C下作用2030分钟，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，1000012000r/min，离心510分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:l的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入22.5倍体积预冷至4°C的无水乙醇，混匀，室温下放置2030分钟以沉淀DNA;1000012000r/min，离心510分钟；去上清，用体积浓度为7075%乙醇洗涤12次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于1050iil试剂C中，即为DNA提取液，28。C保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为1050mM、1050mM、210mg/ml、1050iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是0.51.0mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA1050yg/ml，三羟甲基氨基甲烷520mM，乙二胺四乙酸钠0.52mM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的PCR管，每支PCR管中加入任意一组PCR引物对，所述PCR引物对由引物1和引物2组成，每支PCR管中加入O.51.0iU25iiM引物l，O.51.Oii125iiM引物2，13ii1DNA提取液，2.5单位/ii1的Taq酶0.51.Oii1，2.55.Oii110XPCRbuffer,2.04.0ii1dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.04.0ii125mMMgCl2，加灭菌去离子水至50ii1;30005000r/min离心25秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①9496°C预变性25分钟；②9496。C变性30秒1分钟；③4550。C退火40秒1分钟；72。C延伸40秒1分钟，②③④共510个循环；⑤9496。C变性30秒1分钟；5055。C退火40秒1分钟；⑦72。C延伸40秒1分钟，⑤⑥⑦共2535个循环；最后72"延伸610分钟；4"保温610分钟，得扩增样品；根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型，从表1中选择PCR引物对表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>14seq引物15'-ATGAATATGAAGCGAAGAG-3'引物25'-TTTGCTTACCATTGACCC-3'15scr引物15'-AGGATAAAGCGGTAATAGC-3'引物25'-TCATATGCCGACCCATC-3'16引物15'-CAATTGAATAAAGCGAGTGAA-3，引物25，-CGCCATACATACACGT-3'4)PCR扩增产物分析取510iil扩增后的样品，与26iil质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.51.0iig/ml溴化乙锭的质量比为0.81%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；表2:扩增长度(bp)肠毒素基因型170seb380ssc207sed400187sef320seg155seh314sei339sek380sel214sem337sen222SCO168seq442319所述步骤3)反应条件优选的是①94t:预变性3分钟；②94t:变性30秒，③48t:退火40秒，72。C延伸40秒，②③④共5个循环；⑤94。C变性30秒，51。C退火40秒，⑦72t:延伸40秒，⑤⑥⑦共30个循环；最后72t:延伸6分钟；4。C保温6分钟，得扩增样PRo—种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法，由下述步骤组成1)样品处理取0.10.5ml样品，1000012000r/min，离心12分钟；2)DNA提取弃上清，加入400700iil灭菌水悬浮沉淀，1000012000r/min离心30秒1分钟；弃上清，加入100300iil试剂A于3540。C下作用2030分钟，加入试剂B，再于4555。C下作用2030分钟，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，1000012000r/min，离心510分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:l的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入22.5倍体积预冷至4t:的无水乙醇，混匀，室温下放置2030分钟以沉淀DNA;1000012000r/min，离心510分钟；去上清，用体积浓度为7075%乙醇洗涤12次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于1050iil试剂C中，即为DNA提取液，28。C保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为1050mM、1050mM、210mg/ml、1050iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是0.51.0mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA1050yg/ml，三羟甲基氨基甲烷520mM，乙二胺四乙酸钠0.52mM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:取16支PCR管，每支PCR管中加入一组PCR弓|物对，所述PCR弓|物对由引物1和引物2组成，每支PCR管中加入0.51.Oii125iiM引物l，O.51.Oii125yM引物2，13ii1DNA提取液，2.5单位/ii1的Taq酶0.51.Oii1，2.55.Oii110XPCRbuffer,2.04.0iildNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.04.0ii125mMMgCl2，加灭菌去离子水至50ii1;30005000r/min离心25秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①9496。C预变性25分钟；②9496。C变性30秒1分钟；③4550。C退火40秒1分钟；72。C延伸40秒1分钟，②③④共510个循环；⑤9496。C变性30秒1分钟；5055。C退火40秒1分钟；⑦72。C延伸40秒1分钟，⑤⑥⑦共2535个循环；最后72"延伸610分钟；4"保温610分钟，得扩增样品；所述PCR引物对如表1所示；4)PCR扩增产物分析取510iil扩增后的样品，与26iil质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.51.0iig/ml溴化乙锭的质量比为0.81%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果各PCR扩增产物的核酸条带与表4中相应的扩增长度一致，则可判断样品中葡萄球菌肠毒素基因型；表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所述步骤3)反应条件优选的是①94°C预变性3分钟；②94°C变性30秒，③48°C退火40秒，72°C延伸40秒，②③④共5个循环；⑤94。C变性30秒，5rC退火40秒，⑦72。C延伸40秒，⑤⑥⑦共30个循环；最后72t:延伸6分钟；4t:保温6分钟，得扩增样品。本发明的第一个方法可快速检测特定葡萄球菌肠毒素基因型，具有高敏感、高特异性和高准确性，检测时间縮短为几个小时，本发明的第二个方法可对不同分离来源的葡萄球菌肠毒素基因进行系统分型，并为分析各毒素型间的关系提供技术支持。以上两种方法在食品安全检疫、疾病诊断、分子流行病学研究上具有重要意义。图1为不同方法提取的DNA电泳结果。(其中M，DL2000Markerl，一般碱裂解法；4，高效提取方法(加入溶菌酶和蛋白酶K);5，空白对照)图2为疑似奶样肠毒素基因扩增检测结果(其中M，DL2000Marker;1-3泳道分别为sek，sel，sem检测结果)图3为各型肠毒素基因扩增阳性结果。(其中从左至右各泳道分别为M，DL2000Marker;1-16泳道分别为seb，sec，sed，sef，seg，seh，seli，sea，sek，sel，sem，sen，seo，seq，ser，seu型肠毒素阳性扩增结果)图4为菌株PYNl-3各型肠毒素基因扩增结果。(其中M，DL2000Marker;1-4泳道分另ll为seg，sei，sem，sen;5，空白X寸照；6—8^永道分另U为ser，seo，seu)图5为菌株2838各型肠毒素基因扩增结果。(其中1_8泳道分别为sea，seb，sec，sed，sef，seg，seh，sei;M，DL2000Marker;9-16泳道分别为sek，sel，sem，sen，seo，seq，ser，seu)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。葡萄球菌具有较厚的细胞壁，对其基因组分离、提纯时往往存在提取效率低的问题，影响了后续的操作。本发明设计了一种新的葡萄球菌培养物基因提取的溶液配方及操作程序，快速简便，可显著提高葡萄球菌基因组的获取丰度。实施例1一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，包括如下步骤1)样品处理取疑似奶样0.5ml，12000r/min，离心1分钟；2)DNA提取弃上清，加入500ii1灭菌水悬浮沉淀，12000r/min离心30秒；弃上清，加入200ii1试剂A于37"下作用25分钟，加入试剂B，再于5(TC下作用25分钟，12000r/min，离心8分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，12000r/min，离心5分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:l的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，12000r/min，离心8分钟；取上清并加入2.5倍体积预冷至4。C的无水乙醇，混匀，室温下放置25分钟以沉淀DNA;12000r/min，离心5分钟；去上清，用体积浓度为75%乙醇洗涤2次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于40yl试剂C中，即为DNA提取液，4t:保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为30mM、30mM、6mg/ml、30iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是0.8mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA30yg/ml，三羟甲基氨基甲烷10mM，乙二胺四乙酸钠lmM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:取16支PCR管，每支PCR管中依照表1的顺序加入一组PCR引物对，包括1.0iU25iiM引物l，1.0ii125iiM引物2，再加入3iilDNA提取液，2.5单位/iU的Taq酶l.OiU，5.0ii110XPCRbuffer，4.0ii1dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，4.0ill25mMMgCl2，加灭菌去离子水至50y1;5000r/min离心5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①94t:预变性3分钟；②94。C变性30秒；③48。C退火40秒；72。C延伸40秒，②③④共5个循环；⑤94。C变性30秒；51。C退火40秒；⑦72。C延伸40秒，⑤⑥⑦共30个循环；最后72°C延伸6分钟；4°C保温6分钟，得扩增样品；4)PCR扩增产物分析取8iU扩增后的样品，与4iU质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.8iig/ml溴化乙锭的质量比为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；此外，用步骤(2)提取方法提取的DNA，经PCR结果表明(见图l)，与一般碱裂解法相比，此方法提取的DNA的丰度明显提高。实施例2—种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，包括如下步骤1)样品处理取疑似奶样0.1ml样品，10000r/min，离心2分钟；2)DNA提取弃上清，加入400ii1灭菌水悬浮沉淀，10000r/min离心1分钟；弃上清，加入100ii1试剂A于35。C下作用30分钟，加入试剂B，再于45。C下作用30分钟，10000r/min，离心10分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，10000r/min，离心10分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:1的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，10000r/min，离心10分钟；取上清并加入2倍体积预冷至4°C的无水乙醇，混匀，室温下放置20分钟以沉淀DNA;10000r/min，离心10分钟；去上清，用体积浓度为70%乙醇洗涤2次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于50iU试剂C中，即为DNA提取液，8t:保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为10mM、50mM、2mg/ml、10iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是0.5mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA10yg/ml，三羟甲基氨基甲烷20mM，乙二胺四乙酸钠2mM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:从表1中选择与sek、sel和sem葡萄球菌肠毒素基因型对应的引物对，分别加入PCR管，引物对包括O.5iU25iiM引物l，O.5iU25yM引物2，再加入1iUDNA提取液，2.5单位/ii1的Taq酶O.5ii1，2.5ii110XPCRbuffer,2.Oii1dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.OiU25mMMgCl2，加灭菌去离子水至50ii1;3000r/min离心5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①96。C预变性2分钟；②96。C变性40秒；③45。C退火1分钟；72。C延伸1分钟，②③④共10个循环；⑤96。C变性40秒；5(TC退火1分钟；⑦72。C延伸1分钟，⑤⑥⑦共25个循环；最后72t:延伸10分钟；4t:保温10分钟，得扩增样品；4)PCR扩增产物分析取5iU扩增后的样品，与2iU质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5iig/ml溴化乙锭的质量比为0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，扩增的核酸条带为214bp则可判断被检测的样品是sem葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品(见图2)。实施例3—种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，包括如下步骤l)样品处理取0.3ml样品，11000r/min，离心1分钟;2)DNA提取弃上清，加入700iil灭菌水悬浮沉淀，11000r/min离心1分钟；弃上清，加入300ii1试剂A于40。C下作用20分钟，加入试剂B，再于55。C下作用20分钟，11000r/min，离心10分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，11000r/min，离心10分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:1的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，11000r/min，离心10分钟；取上清并加入2.2倍体积预冷至4t:的无水乙醇，混匀，室温下放置30分钟以沉淀DNA;11000r/min，离心IO分钟；去上清，用体积浓度为75%乙醇洗涤1次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于10iU试剂C中，即为DNA提取液，2t:保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为50mM、10mM、10mg/ml、50iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是1.Omg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA50yg/ml，三羟甲基氨基甲烷5mM，乙二胺四乙酸钠0.5mM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:从表1中选择与seo葡萄球菌肠毒素基因型对应的引物对，加入PCR管，引物对包括O.8iU25iiM引物l，O.8iU25iiM引物2，再加入2iilDNA提取液，2.5单位/iU的Taq酶O.80ii1，4.Oil110XPCRbuffer,3.Oii1dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，3.0ill25mMMgCl2，加灭菌去离子水至50y1;4000r/min离心5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①95。C预变性4分钟；②95t:变性1分钟；③5(TC退火50秒；72。C延伸50秒，②③④共8个循环；⑤95。C变性1分钟；55。C退火50秒；⑦72。C延伸40秒，⑤⑥⑦共35个循环；最后72°C延伸8分钟；4°C保温8分钟，得扩增样品；4)PCR扩增产物分析取10ill扩增后的样品，与6ill质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含1.Oi!g/ml溴化乙锭的质量比为0.9%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，扩增的核酸条带大小为222bp，则可判断被检测的样品含有葡萄球菌肠毒素基因型S60o实施例4:葡萄球菌肠毒素基因分型的特异性PCR引物设计1.在GenBank上查找、比对某一基因型的葡萄球菌肠毒素基因序列，并通过与异型肠毒素基因序列的同源性分析，将其序列保守片段作为靶目标；2.根据基因特点和引物设计原则，借助01igo6.0软件辅助设计特异性引物，委托Invitrogen公司合成，序列见表1和表2。实施例5—种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法，包括如下步骤1)样品处理取0.5ml菌株2838培养液，12000r/min，离心1分钟;2)-3)同实施例14)PCR扩增产物分析取8iU扩增后的样品，与4iU质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.8iig/ml溴化乙锭的质量比为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，各PCR扩增产物的核酸条带与表4中相应的扩增长度一致，则可判断样品菌株2838中葡萄球菌肠毒素基因型，见图5(其中1-8泳道分别为sea，seb，sec，sed，sef，seg，seh，sei;M，DL2000Marker;9-16泳道分另U为sek，sel，sem，sen，seo，seq，ser，seu)，从图中可以看出，菌株2838含有葡萄5求菌肠毒素基因型seb，sec，sef，sei，sel，sem，sen，seo，seu。实施例6—种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法，包括如下步骤l)样品处理:取0.lml菌株PYNl-3培养液，10000r/min，离心2分钟;2)同实施例23)PCR:从表1中选择与seg，sei，sem，sen、ser，seo，seu葡萄球菌肠毒素基因型对应的引物对，分别加入PCR管，引物对包括O.5iU25iiM引物l，O.5iU25yM引物2，再加入liilDNA提取液，2.5单位/ii1的Taq酶0.5ii1，2.5ii110XPCRbuffer,2.0ii1dNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.0ii125mMMgCl2，加灭菌去离子水至50iU;3000r/min离心5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①96。C预变性2分钟；②96。C变性40秒；③45。C退火1分钟；72。C延伸1分钟，②③④共10个循环；⑤96。C变性40秒；5(TC退火1分钟；⑦72。C延伸1分钟，⑤⑥⑦共25个循环；最后72t:延伸10分钟；4t:保温10分钟，得扩增样品；4)PCR扩增产物分析取5iU扩增后的样品，与2iU质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5iig/ml溴化乙锭的质量比为0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，各PCR扩增产物的核酸条带分别为与表4中相应的扩增长度一致，则判断样品菌株PYN1-3中葡萄球菌肠毒素基因型，见图4(其中M，DL2000Marker;1-4泳道分别为seg，sei，sem，sen;5，空白对照；6-8泳道分别为ser，seo，seu)，从图中可以看出，菌株PYN1-3含有葡萄球菌肠毒素基因型seg，sei，sem，sen，ser，seo，seu。葡萄球菌肠毒素基因分型检测结果分析发明收集了来源于人、鸡、鸭、羊、牛、猪、兔、鼠、水貂、土壤和奶制品中的122株各类型葡萄球菌，包含了金黄色葡萄球菌(S.aureus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、华纳氏葡萄球菌(S.warneri)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、腐生葡萄球菌(S.s即rophyticus)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)禾口耳葡萄球菌(S.awricularis)等12个种属的葡萄球菌。利用16对葡萄球菌肠毒素特异性检测引物分别对发明中收集的122株葡萄球菌进行检测，扩增出了16种不同肠毒素基因型的阳性条带，呈现阳性结果，这说明了引物设计符合要求，达到检测各型肠毒素基因的目的。各型葡萄球菌肠毒素基因的PCR结果反映在电泳图上，见图3。从实践应用上验证了引物的特异性和PCR检测方法的有效性。1权利要求一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，其特征是由下述步骤组成1)样品处理取0.1～0.5ml样品，10000～12000r/min，离心1～2分钟；2)DNA提取弃上清，加入400～700μl灭菌水悬浮沉淀，10000～12000r/min离心30秒～1分钟；弃上清，加入100～300μl试剂A于35～40℃下作用20～30分钟，加入试剂B，再于45～55℃下作用20～30分钟，10000～12000r/min，离心8～10分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，10000～12000r/min，离心5～10分钟；取上清并加入等体积的体积比为25∶24∶1的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，10000～12000r/min，离心8～10分钟；取上清并加入2～2.5倍体积预冷至4℃的无水乙醇，混匀，室温下放置20～30分钟以沉淀DNA；10000～12000r/min，离心5～10分钟；去上清，用体积浓度为70～75％乙醇洗涤1～2次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于10～50μl试剂C中，即为DNA提取液，2～8℃保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为10～50mM、10～50mM、2～10mg/ml、10～50μg/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0；试剂B含蛋白酶K，浓度是0.5～1.0mg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA10～50μg/ml，三羟甲基氨基甲烷5～20mM，乙二胺四乙酸钠0.5～2mM，余量为灭菌水，pH为8.0；3)PCR根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型的个数，取相同数量的PCR管，每支PCR管中加入任意一组PCR引物对，所述PCR引物对由引物1和引物2组成，每支PCR管中加入0.5～1.0μl25μM引物1，0.5～1.0μl25μM引物2，1～3μlDNA提取液，2.5单位/μl的Taq酶0.5～1.0μl，2.5～5.0μl10×PCRbuffer，2.0～4.0μldNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.0～4.0μl25mMMgCl2，加灭菌去离子水至50μl；3000～5000r/min离心2～5秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①94～96℃预变性2～5分钟；②94～96℃变性30秒～1分钟；③45～50℃退火40秒～1分钟；④72℃延伸40秒～1分钟，②③④共5～10个循环；⑤94～96℃变性30秒～1分钟；⑥50～55℃退火40秒～1分钟；⑦72℃延伸40秒～1分钟，⑤⑥⑦共25～35个循环；最后72℃延伸6～10分钟；4℃保温6～10分钟，得扩增样品；根据需要检测的葡萄球菌肠毒素基因型，从表1中选择PCR引物对表14)PCR扩增产物分析取5～10μl扩增后的样品，与2～6μl质量比为0.25％的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙锭的质量比为0.8～1％的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测的样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；表22.根据权利要求1所述一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法，其特征是所述步骤3)反应条件为①94。C预变性3分钟；②94。C变性30秒，③48。C退火40秒，72。C延伸40秒，②③④共5个循环；⑤94。C变性30秒，5rC退火40秒，⑦72。C延伸40秒，⑤⑥⑦共30个循环；最后72t:延伸6分钟；4t:保温6分钟，得扩增样品。3.—种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法，其特征是由下述步骤组成1)样品处理取0.10.5ml样品，1000012000r/min，离心12分钟；2)DNA提取弃上清，加入400700iil灭菌水悬浮沉淀，1000012000r/min离心30秒1分钟；弃上清，加入100300iil试剂A于3540。C下作用2030分钟，加入试剂B，再于4555。C下作用2030分钟，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入等体积的三羟甲基氨基甲烷饱和酚，充分振荡混匀，1000012000r/min，离心510分钟；取上清并加入等体积的体积比为25:24:1的三羟甲基氨基甲烷饱和酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，混匀后，1000012000r/min，离心810分钟；取上清并加入22.5倍体积预冷至4。C的无水乙醇，混匀，室温下放置2030分钟以沉淀DNA;1000012000r/min，离心510分钟；去上清，用体积浓度为7075%乙醇洗涤12次，让乙醇彻底挥发；将其沉淀溶于1050iil试剂C中，即为DNA提取液，28t:保存备用；其中试剂A含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠和溶菌酶，它们的浓度分别为1050mM、1050mM、210mg/ml、1050iig/ml，余量为灭菌水，三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠的pH均为8.0;试剂B含蛋白酶K，浓度是0.51.Omg/ml，余量为灭菌水；试剂C含有RNaseA1050yg/ml，三羟甲基氨基甲烷520mM，乙二胺四乙酸钠0.52mM，余量为灭菌水，pH为8.0;3)PCR:取16支PCR管，每支PCR管中加入一组PCR引物对，所述PCR引物对由引物1和引物2组成，每支PCR管中加入0.51.0ii125iiM引物l，O.51.0ii125yM引物2，13ii1DNA提取液，2.5单位/ii1的Taq酶0.51.0ii1，2.55.0ii110XPCRbuffer,2.04.0iildNTP，所述dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度为2.5mM，2.04.Oii125mMMgCl2，加灭菌去离子水至50ii1;30005000r/min离心25秒混匀，置于PCR仪内进行扩增；反应条件为①9496。C预变性25分钟；②9496。C变性30秒1分钟；③455(TC退火40秒1分钟；72。C延伸40秒1分钟，②③④共510个循环；⑤9496。C变性30秒1分钟；5055。C退火40秒1分钟；⑦72。C延伸40秒1分钟，⑤⑥⑦共2535个循环；最后72"延伸610分钟；4t:保温610分钟，得扩增样品；所述PCR引物对如表1所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4)PCR扩增产物分析取510iil扩增后的样品，与26iil质量比为0.25%的溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.51.0iig/ml溴化乙锭的质量比为0.81%的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果各PCR扩增产物的核酸条带与表4中相应的扩增长度一致，则可判断样品中葡萄球菌肠毒素基因型；表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.根据权利要求3所述一种葡萄球菌肠毒素基因分型的检测方法，其特征是所述步骤3)反应条件为①94。C预变性3分钟；②94。C变性30秒，③48。C退火40秒，72。C延伸40秒，②③④共5个循环；⑤94。C变性30秒，51°C退火40秒，⑦72。C延伸40秒，⑤⑥⑦共30个循环；最后72t:延伸6分钟；4t:保温6分钟，得扩增样品。全文摘要本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法及基因分型的检测方法，葡萄球菌肠毒素基因型的检测方法步骤1)样品处理；2)DNA提取；3)PCR；4)PCR扩增产物分析，扩增后的样品在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果扩增的核酸条带与表2中扩增长度一致，则可判断被检测样品是含有相应葡萄球菌肠毒素基因型的阳性样品；第一个方法可快速检测特定葡萄球菌肠毒素基因型，具有高敏感、高特异性和高准确性，第二个方法可对不同分离来源的葡萄球菌肠毒素基因进行系统分型，并为分析各毒素型间的关系提供技术支持。在食品安全检疫、疾病诊断、分子流行病学研究上具有重要意义。文档编号C12Q1/68GK101760553SQ20091007103公开日2010年6月30日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者刘业兵,庄世文,李琳,黄金海申请人:天津大学