专利名称：：提高半纤维素木聚糖降解率的酶组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及两种木聚糖酶和一种木糖苷酶，特别涉及在嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodentitrificans)NG80-2中两种可以降解木聚糖的木聚糖酶和一种可降解木糖苷的木糖苷酶对木聚糖的协同作用。
背景技术：
：随着当今社会的飞速发展，人口增长和资源消耗使得可再生资源的开发与利用成为国际社会和学术界共同关注的问题。木聚糖是半纤维素的主要组成成份，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中一种巨大的可再生生物资源，也是最容易提取、降解和利用的一类半纤维素。木聚糖酶和P木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。P-l，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖主链内部的P_l，4_木糖苷键，使木聚糖降解为短链的低聚木糖，并有少量木糖生成；而13-D-木糖苷酶(13-xylosidase，EC.3.2.1.37.)则作用于短链的低聚木糖，通过催化低聚木糖的末端来释放木糖残基(见图1)。两种酶协同作用，可以增加木聚糖的降解效率，其产物具有重要的工业应用价值。例如，在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在造纸工业的纸浆漂白中，P-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能；在医药行业中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。因此对于木聚糖酶和木糖苷酶协同作用的研究具有广泛而重要的用途。本发明人曾于2004年11月17日申请嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用(申请号200410072759)该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMC-1228;随后本发明人在08.11.14，又分别申请了耐高温木聚糖酶XynAl和编码该酶的基因与应用(申请号200810153076.2);耐高温木聚糖酶XynA2和编码该酶的基因与应用(申请号200810153077.7)耐高温木糖苷酶XynBl和编码该酶的基因与应用(申请号200810153078.1)耐高温木糖苷酶XynB2和编码该酶的基因与应用(200810153079.6)公开了由嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因组DNA借助PCR扩增而得到的木聚糖酶XynAl、XynA2构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木聚糖酶。以及由嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因组DNA借助PCR扩增而得到的木糖苷酶XynBl、XynB2构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木糖苷酶。这些公开文件作为参考文献一并引入本发明。业界公知的国外有关利用木聚糖酶和木糖苷酶协同作用于木聚糖底物的文献报道主要集中在Anoxybacillus(厌氧芽孢杆菌属)、Sulfolobus(硫化叶菌)、Thermomonospora(高？益单抱菌属)禾口Aureobasidium(短梗毒)等菌株中，例如A丽ybacillusflavithe丽sBC中的木聚糖酶与Sulfolobussolfataricus0a(硫磺矿硫化叶菌)中的木糖苷酶协同作用时，对燕麦木聚糖、桦树木聚糖和山毛榉木聚糖的降解率比木聚糖酶单独作用时提高了2倍、1倍和0.8倍，分别达到3.48、2.193禾口4.79mg/ml(Kambourova，M.，etal，Hydrolysisofxylanathightemperaturebyco_actionofthexylanasefromAnoxybaci1lusflavithermusBCandtheP-xylosidase/a-arabinosidasefromSulfolobussolfataricus0aa，J.Appl.Microbiol.2007Jun.102(6):1586-93.);ThermomonosporafuscaBD25(褐色热单孢菌)中的木聚糖酶与木糖苷酶协同作用时对燕麦木聚糖的降解率是比木聚糖酶单独作用时提高了1倍，达到5.6mg/ml(T皿cer，M.，ecal，Co-operativeactionsanddegradationanalysisofpurifiedxylan—degradingenzymesfromThermomonosporafuscaBD25onoat—speltxylan，J.Appl.Microbiol.2003.94:1030—1035);Aureobasidi咖pullulans(出芽短梗霉菌)中的木聚糖酶与木糖苷酶协同作用时对亚硫酸盐纸浆的降解率比木聚糖酶单独作用时提高了1.45倍，达到127.0iig/g(Christov，L.P.，etal，ModificationoftheCarbohyirateCompositionofSulfitePulpbyPurifiedaridCharacterizedP—XylanaseandP—XylosidaseofAureobasidi咖pullulans，Biotechnol.Prog.1999.15:196-200)。国内有关利用木聚糖酶和木糖苷酶协同作用于木聚糖底物的文献报道Trichodermareesei(里氏木霉)RutC230中的木聚糖酶和木糖苷酶协同作用对麦草桨的降解率比木聚糖酶单独作用时提高了8.6倍，达到94.62IU/ml(毛连山，尤纪雪，宋向阳，勇强，余世袁，内切木聚糖酶与木糖苷酶预处理对麦草浆漂白性能的影响，林产化学与工业.2003.6)。随着研究的不断深入，本发明人惊奇的发现一定比例的木聚糖酶和木糖苷酶混合后，在增加木聚糖的降解效率方面，具有明显的协同作用，而关于木聚糖酶和一种木糖苷酶混合的专利文献，国内外尚未见报道。本发明的目的是通过复合酶法降解木聚糖，重点需要解决的问题是提高单位菌体的酶产率、提高木聚糖酶和木糖苷酶的协同作用。为达到上述目的，本发明提供如下的技术方案—种提高半纤维素木聚糖降解率的酶组合物，其特征在于它是由木聚糖酶XynAl或XynA2与木糖苷酶XynB2组成；其中XynAl或XynA2:XynB2的重量份数比是1000:1。本发明所述的酶组合物，其中的两种木聚糖酶和一种木糖苷酶于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。本发明所述的酶组合物，其中两种木聚糖酶和一种木糖苷酶协同作用的底物包括燕麦木聚糖、桦树木聚糖、山毛榉木聚糖中的至少一种。本发明所述的酶组合物，其中XynAl或XynA2的浓度为0.001mg/ml，木糖苷酶XynB2的浓度为0.00000lmg/ml。本发明所述的酶组合物，其中两种木聚糖酶和一种木糖苷酶协同作用的反应温度为60-65°C，协同反应pH为6-9。本发明所述的酶组合物，其中XynAl与XynB2协同反应的pH为6时，两者协同作用效率最高；XynA2与XynB2协同反应的pH为9时，两者协同作用效率最高。本发明的木聚糖酶和木糖苷酶协同作用于不同来源的木聚糖底物可使其降解效率有不同程度的提高，说明嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2对各种环境的适应能力。
发明内容4本发明公开的提高木聚糖降解率的酶组合物与现有技术相比，有益效果在于本发明的木聚糖酶和木糖苷酶协同作用于不同来源的木聚糖底物可使其降解效率有不同程度的提高，在工业化应用中具有明显的优势。图1是本发明的木糖苷酶降解寡聚木聚糖作用示意图；图2是本发明的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynB2在不同pH下的相对活力；图3是本发明的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynB2在不同温度下的相对活力；图4是本发明的木聚糖酶XynA2和木糖苷酶XynB2在不同pH下的相对活力；图5是本发明的木聚糖酶XynA2和木糖苷酶XynB2在不同温度下的相对活力。具体实施例方式以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详细说明如下；同时为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。木聚糖酶XynAl、XynA2、XynB2的活力测定方法如下实施例11.木聚糖酶XynAl的制备将重组菌H1739(构建方法见专利200810153076.2)单克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm培养12小时，然后将培养物按1%(v/v)接种量接入200ml含50iig/mlKan的LB培养基，37°C，220rpm培养至0D6。。为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.05mM，45tH秀导3小时。5000rpm离心5min收集菌体，悬于含50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，14000g离心20min，上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingS印harose)镍亲合柱层析纯化。2.木糖苷酶XynB2的制备将重组菌H1860(构建方法见专利200810153079.6)单克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm培养12小时，然后将培养物按1%(v/v)接种量接入200ml含50iig/mlKan的LB培养基，37。C，220rpm培养至0D600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.lmM，在37t:、180rpm诱导3小时。5000rpm离心5min收集菌体，悬于含50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，14000g离心20min，上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingS印harose)镍亲合柱层析纯化。3.木聚糖酶XynAl与木糖苷酶XynB2的协同作用1)反应体系pH的确定上述实施例一中得到的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynB2在不同pH下的比活力如图2所示，从该图可以看出，在pH6.0时，木聚糖酶XynAl具有65%的活性，木糖苷酶XynB2具有100%的活性，两者协同作用效率最高。2)反应体系温度的确定上述实施例1中得到的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynB2在不同温度下的比活力如图2所示，从该图可以看出，在65t:时，木聚糖酶XynAl具有90X的活性，木糖苷酶XynB2具有100%的活性，两者协同作用效率最高。3)协同作用效率检测本实验以目前可购买到的三种木聚糖燕麦木聚糖(Sigma货号为X0627)、山毛榉木聚糖(Sigma货号为X4252)、桦树木聚糖(Sigma货号为X0502)为底物，进行了协同作用检测。具体方法为配制木聚糖酶XynAl与木糖苷酶XynB2的协同作用的反应体系(100iU):分别加入燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖、桦树木聚糖底物至终浓度1%(w/v)，木聚糖酶XynAl终浓度为0.001mg/ml，木糖苷酶XynB2的终浓度为0.000001mg/ml(阴性对照不加木糖苷酶)，用50mMp朋.0的citrate-sodiumcitrate缓冲液补至100ii1。混匀，在65t:水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应，加入150iU的1%DNS试剂(3，5二硝基水杨酸1%;苯酚0.2%;硫酸钠0.05%;酒石酸钾钠20%;氢氧化钠1%。避光放置两周后使用。)沸水浴10分钟，然后在540nm处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成lymol还原糖所需酶量，定义为l个酶活力单位。测定结果见表l。实施例21.木聚糖酶XynA2的制备将重组菌H1398(构建方法见专利200810153077.7)单克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm培养12小时，然后将培养物按1%(v/v)接种量接入200ml含50iig/mlKan的LB培养基，37。C，220rpm培养至0D600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.lmM，在37t:、180rpm诱导3小时。5000rpm离心5min收集菌体，悬于含50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，14000g离心20min，上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingS印harose)镍亲合柱层析纯化。2.木聚糖酶XynA2与木糖苷酶XynB2的协同作用1)反应体系pH的确定上述实施例1中得到的木聚糖酶XynA2和上述实施例2中得到的木糖苷酶XynB2在不同pH下的比活力如图2所示，从该图可以看出，在pH9.0时，木聚糖酶XynA2具有100X的活性，木糖苷酶XynB2具有64%的活性，两者协同作用效率最高。2)反应体系温度的确定上述实施例1中得到的木聚糖酶XynA2和上述实施例2中得到的木糖苷酶XynB2在不同温度下的比活力如图2所示，从该图可以看出，在65t:时，木聚糖酶XynA2具有大于95%的活性，木糖苷酶XynB2具有100%的活性，两者协同作用效率最高。3)协同作用效率检测本实验以目前可购买到的三种木聚糖燕麦木聚糖(Sigma货号为X0627)、山毛榉木聚糖(Sigma货号为X4252)、桦树木聚糖(Sigma货号为X0502)为底物，进行了协同作用检测。具体方法为配制木聚糖酶XynA2与木糖苷酶XynB2的协同作用的反应体系(100iU):分别加入燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖、桦树木聚糖底物至终浓度1%(w/v)，木聚糖酶XynA2终浓度为0.001mg/ml，木糖苷酶XynB2的终浓度为0.00000lmg/ml(阴性对照不加木糖苷酶)，用50mMpH9.0的glycine-NaOH缓冲液补至100yl。混匀，在65。C水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应，加入150iil的1%DNS试剂(3，5二硝基水杨酸1%;苯酚0.2%;硫酸钠0.05%;酒石酸钾钠20%;氢氧化钠1%。避光放置两周后使用。)沸水浴10分钟，然后在540nm处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成1Pmol还原糖所需酶量，定义为1个酶活力单位。测定结果参见表1。表l木聚糖酶和木糖苷酶的协同作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从表1可以看出，当木聚糖酶XynAl与木糖苷酶XynB2协同作用或木聚糖酶XynA2与木糖苷酶XynB2协同作用时，对木聚糖的降解率比木聚糖酶XynAl或木聚糖酶XynA2单独讲解木聚糖的效率高，木糖苷酶XynBl单独作用时，并不能降解木聚糖。。以燕麦木聚糖为底物时，XynA2和XynB2协同作用后对木聚糖底物的降解率提高最明显，是XynA2单独作用时的1.32倍，XynAl和XynB2协同作用后对木聚糖的降解率是XynAl单独作用时的1.14倍。结果表明，木聚糖酶与木糖苷酶协同作用可增加木聚糖降解生成木糖的效率，而木糖产率的提高具有巨大的工业应用价值。实施例3工业应用实例由于小麦、大麦、燕麦、黑麦等饲料原料中存在大量的非淀粉多糖，对动物消化吸收存在一定的抗营养作用，在饲料中添加多糖降解酶不仅可以将其转化为营养性物质，还消除了抗营养作用，具有十分重要的意义。Graham等人(1992)研究发现，高木聚糖活性的半纤维素酶能降低猪饲料成本，减少饲料浪费。Choct等人(1992)报道，在肉鸡的小麦饲料中，燕麦木聚糖与表观代谢能，氮沉积、饲料转化率和增重下降相关，在这些小麦日粮中添加木聚糖酶，表观代谢能、增重、饲料转化率、蛋白质沉积率及粪便都得到了改善。近年来随着无氯漂白的大力提倡及广泛应用，木聚糖酶也被引入纸浆无氯漂白流程，PedersenJ研究了木聚糖酶的加入对阔叶木(桦木)硫酸盐浆漂白达到同样白度可比原漂白阶段减少10%的臭氧用量。我国也广泛开展了这方面的研究工作，木聚糖酶预处理用于桉木、松木、蔗渣硫酸盐浆及麦草浆漂白流程中取得良好效果，陈嘉川等研究发现木聚糖酶可明显改善麦草浆的滤水性、脆性、物理强度和白度，减少总有效氯用量。桦木木聚糖(适用于造纸)。燕麦木聚糖适用于(饲料酶角度考虑)请举出一种燕麦木聚糖为底物时或以桦树木聚糖为底物时的实际例子。在桦木木聚糖(适用于造纸)。燕麦木聚糖(饲料酶角度考虑)方面，复合酶水平为1500IU/Kg，木聚糖酶降解程度达到23.09%，与未加酶处理差异显著P<0.05。参考文件200810101057.5(应用的实际例子)。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。8权利要求一种提高半纤维素木聚糖降解率的酶组合物，其特征在于它是由木聚糖酶XynA1或XynA2与木糖苷酶XynB2组成；其中XynA1或XynA2∶XynB2的重量份数比是1000∶1。2.权利要求1所述的酶组合物，其中的两种木聚糖酶和一种木糖苷酶于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。3.权利要求1所述的酶组合物，其中两种木聚糖酶和一种木糖苷酶协同作用的底物包括燕麦木聚糖、桦树木聚糖、山毛榉木聚糖中的至少一种。4.权利要求1所述的酶组合物，其中XynAl或XynA2的浓度为0.001mg/ml，木糖苷酶XynB2的浓度为0.00000lmg/ml。5.权利要求1所述的酶组合物，其中两种木聚糖酶和一种木糖苷酶协同作用的反应温度为60-65°C，协同反应pH为6-9。6.权利要求5所述的酶组合物，其中XynAl与XynB2协同反应的pH为6，XynA2与XynB2协同反应的pH为9。全文摘要本发明涉及一种提高半纤维素木聚糖降解率的酶组合物，特别涉及两种木聚糖酶XynA1或XynA2和一种木糖苷酶XynB2的组合物。其中XynA1或XynA2∶XynB2的重量份数比是1000∶1。本发明公开的两种木聚糖酶分别与一种木糖苷酶协同作用于不同木聚糖底物的反应体系，反应温度均为65℃，XynA1或XynA2与XynB2协同作用的pH分别为6.0和9.0，两种酶协同作用可大大促进半纤维素木聚糖的降解率，本发明的木聚糖酶和木糖苷酶协同作用于不同来源的木聚糖底物可使其降解效率有不同程度的提高，在工业化应用中具有明显的优势。文档编号C12N9/42GK101696400SQ200910071168公开日2010年4月21日申请日期2009年11月5日优先权日2009年11月5日发明者冯露,李晓敏,王磊申请人:南开大学;