专利名称：表达传染性胰腺坏死病毒vp2蛋白的重组干酪乳杆菌及制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是生物制品，本发明还涉及这种生物制品的制备方法。具体地说是表达传染性胰腺坏死
病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及制法。
(二)
背景技术：
传染性胰腺坏死是由传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreas necrosis virus, IPNV)引起鲑科鱼类 的一种高度传染性和急性病毒性疾病，典型症状为游动异常，病鱼体色深暗，腹部膨胀，眼球突出，皮下、 肝胰腺等内脏实质器官出血坏死，高致病力毒株对两月龄的幼鱼致死率髙达90%,感染后幸存的鱼终生带 毒，通过粪便和精卵排出病原，成为潜在的传染源。因该病流行范围广，发病和致死率高，给我国和世界 各国鲑鳟养殖业带来重大的经济损失。疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。IPNV主要经皮肤、消化道和 鳃感染鲑科鱼类，局部的黏膜免疫是传染性胰腺坏死特异性免疫应答的主要特征，鱼肠道、鳃黏膜表面Ig 含量的高低直接决定IPN的发生与否和疾病表现的严重程度。而针对本病黏膜免疫特点,采用口服免疫是 较为理想的预防途径。因此选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效 的刺激黏膜免疫系统所产生的黏膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。
IPNV有两种主要结构蛋白，分别为外衣壳蛋白VP2和内衣壳蛋白VP3。VP2蛋白占病毒粒子蛋白的62免， 含有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，能够诱导病毒中和抗体为鱼类机体提供免疫保护作用，同时VP2并携 带毒力决定因素及细胞培养适应因子，因此,VP2蛋白在IPNV诊断和免疫防治方面发挥着重要作用。目前 报道的用于IPNV VP2蛋白的表达主要宿主菌是大肠杆菌和酵母。大肠杆菌是一类应用最为广泛的表达异 源蛋白的宿主菌，因为大肠杆菌生长速度快，并且具有良好代表性的遗传学特征，目前仍然广泛被应用来 表达异源蛋白，但是在大肠杆菌中表达的融合蛋白以不溶的包涵体形式存在,不具有生物活性，并且大肠 杆菌含有有毒的细胞致热源，因此其表达产物需要做广泛的检测后才能被使用。酵母普遍被认为是食品级 安全的表达宿主具有大肠杆菌所没有的优点，但是融合蛋白产量又很低，并且酵母菌表达的目的蛋白需将 酵母细胞壁破碎后才能口服免疫鱼，均不能作为活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够用于防治传染性胰腺坏死的安全、有效的黏膜免疫活菌疫苗，即表达 传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreas necrosis virus, IPNV) VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制法。
(一) 要解决的技术问题 本发明的目的是这样实现的
它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO: M 209003，命名为pPGl-IPNV VP2/Lacto6acz7/M5 cose!' 393的重组干酪乳杆菌，保藏日期2009年1月6日。
根据传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进 行PCR，获得含有IPNV VP2基因主要抗原位点的1095bp目的片段(图1)，将扩增得到的IPNV VP2基因克 隆到质粒pMD18-T中(图2)，并转化于大肠杆菌JM109菌株中，得到PMD18-T-IPNV VP2/JM109,将pMD18-T-IPNV VP2双酶切回收的VP2与表面表达的载体质粒pPGl进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌 Zscto》ac27/ws case/ 393细胞内，含阳性重组质粒pPGl-IPNV VP2的干酪乳杆菌命名为pPGl-IPNV VP2/厶case/ 393。将重组pPGl-IPNV VP2/Z. case/ 393在乳糖的诱导下进行表达。
扩增IPNV VP2基因上、下游引物序列分别
PI 5 'Ggatcc aGAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3'
P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
(二) 技术方案
采用本发明的方法获得的产物经检验结果为-1.干酪乳杆菌表达载体的酶切鉴定结果
从p助18-T- IPNV VP2/JM109中提取质粒pMD18-T- IPNV VP2，与载体质粒同时用相应的限制内切酶 进行双酶切并以胶回收试剂盒进行回收纯化后进行16'C过夜连接，连接产物电转化入宿主菌干酪乳杆菌Za"o6a"77us 393，重组质粒pPGl-IPNV VP2单酶切后得到大小约为4 400 bp的基因片段，用5aMl I 、 JMl I双酶切后得到大小为1095 bp和3 300 bp基因片段。以Pl、 P2为引物进行PCR扩增，得到约 为1095bp基因片段，与预计大小相符合(见图3)。表明IPNV VP2基因片段已插入到表达载体pPGl中。序 列测定结果分析表明IPNV VP2基因已插入到表达载体质粒中。获得的阳性重组菌命名为重组pPGl-IPNV VP2/厶casei 393菌株。
2. IPNV VP2蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达及蛋白检测
对重组的pPGl-IPNV VP2/Z. case/ 393菌株和pPGl/厶cssei 393空质粒的菌诱导结果表明，重组蛋 白获得了表达，蛋白大小约在40 Kda左右。通过Western-blot检测表明重组蛋白具有与IPNV制备的抗 血清发生反应的能力，并具有良好的特异性，即反应原性(见图4)。
3. IPNV VP2蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达间接免疫荧光检测结果
pPGl-IPNV VP2/Z. casei 393重组菌和pPG1〃. casei 393对照菌所进行的间接免疫荧光实验结果表明， 重组菌pPG1-IPNV VP2/Z. case/ 393荧光显微镜检査可见明显的黄绿色荧光(见图5A),由此也表明，重 组菌所表达的外源蛋白是存在于菌体的表面位置；pPGl/厶casei393未发现绿色荧光，菌体被染成红色(见 图5B)。
基于IPNV的肠道致病特点和黏膜免疫特点，本发明以IPNV起主要免疫保护作用的VP2基因含有主要 抗原位点片段插入到乳酸菌表达载体，构建了表达IPNV VP2蛋白的重组乳酸菌表达系统，以期获得IPNV 口 服活菌疫苗，依靠乳酸菌天然的抗菌作用和VP2蛋白刺激的特异性黏膜免疫作用，达到预防本病的目的。
IPNV主要经皮肤、消化道和鳃感染鲑科鱼类，局部的黏膜免疫是传染性胰腺坏死特异性免疫应答的主 要特征，鱼肠道、鳃黏膜表面Ig含量的高低直接决定IPN的发生与否和疾病表现的严重程度。而针对本 病黏膜免疫特点,采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激黏膜免疫细 胞产生抗体并引起全身免疫，但口服免疫需要克服免疫保护性抗原在到达肠道粘膜之前在胃和肠道中被降 解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。乳酸菌作为表达和传 递异质性抗原的活载体系统具有许多优点，如载体对动物本身是安全的，而大肠杆菌，沙门氏菌作为活载 体系统就不能称为安全的生物制剂；某些乳酸菌又可合成一些生物活性物质和多种有机酸类，这些物质本 身具有抑菌抗菌。
本发明针对IPN发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染性疾病的第一道防线为目的， 利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道粘膜上的粘附，定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质，对粘 膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，因此所产生的粘膜免疫保护效果将更为理想。本发明中 构建了传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白干酪乳杆菌表达载体系统，表达了含有IPNV VP2蛋白主要抗原位点 的约40KDa的目的蛋白，免疫印迹实验和间接免疫荧光试验均表明，所表达的外源蛋白能够与IPNV免疫 血清发生反应，表明重组VP2蛋白与IPNV天然抗原一样具有相同的抗原性。
目前普遍认为，在宿主细胞表面表达外源抗原的活载体疫苗向粘膜免疫系统提呈抗原的最佳方式。本 发明所使用的使用的PPG1表达载体,具有ssUSP分泌信号肽,同时具有锚定结构,属表面表达型载体,表达 的目的蛋白能够锚定于干酪乳杆菌的表面。经诱导表达后，对其培养物上清液10倍浓缩后进行目的蛋白 的检查，结果未检测到表达的VP2蛋白，菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可见在预期的分子量大小有目的蛋 白的表达，Western-bolt检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达 的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平 奠定了重要的物质基础。
图1传染性胰腺坏死病毒VP2基因的RT-PCR扩增结果凝胶电泳图 l.DNA MarkerDL2000; 2. VP2基因PCR扩增产物(1095 bp) 图2重组质粒pMD18-T-VP2酶切、PCR鉴定结果
l.DNA Marker DL15000: 2.BatnHI单酶切；3.PCR阴性对照；4、 5. fe别I和J力oI双酶切；6. DNA MarkerDL2000: 7、 8. PCR鉴定结果 图3重组质粒pPG1-IPNV VP2酶切、PCR鉴定结果
1. DNA Marker DL15000: 2、 3. fe/JiH I和J加I双酶切4、 5. BamHI、 J力ol单酶切；6. DNAMarkerDL20007. PCR鉴定结果
图4重组干酪乳杆菌pPGl-IPNV VP2/Z .casei393表达VP2蛋白SDS-PAGE及Western-blotting鉴 定结果
a:重组菌pPGl-IPNV VP2/厶诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果.1. protein marker (116kD 18.4kD); 2.pPGl-IPNV VP2/厶casei393未经乳糖诱导;3 . pPGl-IPNV VP2/厶casej'393经l %乳糖 Lactose诱导；
b:目的蛋白Western-blot鉴定结果.将蛋白转印NC膜，先后与兔抗IPNV VP2血清和HRP标记羊抗 兔IgG作用，显色后观察结果:1. protein marker (116kD 18.4kD) ;2.经乳糖诱导的pPGl-IPNV VP2/厶casei393， Western blot鉴定出现预期大小的免疫反应带；3.未经乳糖诱导的重组菌，Western blot结果未出现预期的反应带。
图5重组干酪乳杆菌pPG1-IPNV VP2/厶免疫荧光结果
a: pPGl-IPNVVP2/厶casw'393经诱导表达后，间接免疫荧光检测菌体表面出现黄绿色荧光；b:未经 诱导的pPGl-IPNV VP2/Z. casei393菌体表面未出现荧光反应，菌体被伊文思蓝染成红色。 具体实施例方式
下面结合附图举例对本发明做更详细的描述
1. IPNV VP2基因干酪乳杆菌表达载体的构建
用质粒DNA小量提取试剂盒从大肠杆菌pMD18-T-IPNV VP2/JM109和含质粒pPGl干酪乳杆菌 Zac&力aw7勿s ^se/ 393中提取重组质粒pMD18-T-IPNV VP2及质粒pPGl。将pPGl和pMD18-T- IPNV VP2 分别进行双酶切后分别对目的片段进行回收纯化。将回收的PPGl和VP2的纯化产物进行连接，将连接产 物电转化于感受态细胞ZacM力aw77"s case/ 393，含阳性重组质粒pPGl-IPNV VP2的干酪乳杆菌命名为 pPGl-IPNV VP2/Z. case/ 393。
2. IPNV VP2蛋白干酪乳杆菌中的诱导表达
将pPGl-IPNV VP2/L casei 393单个菌落接种5mL MRS液体培养基中过夜培养使菌种活化,活化菌种 按l : 20比例接种于10mL含lW乳糖的MRS培养基中，30'C诱导16h。诱导前和诱导后样品各lmL以12 000r/min 离心5min,菌体用100uL 10mg/mL的溶菌酶，37。C水浴作用60min ，12 000r/min离心5min ，弃上清，加入1X PBS和等量的2XSDS-PAGE样品缓冲液(含DTT)，混匀，沸水浴5min， 12000r/min离心5min,以蛋白质标准分 子量为参考,分别取出lml样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE及ffestern-blot分析。
3. 间接免疫荧光检测
取经诱导的重组干酪乳杆菌和含空质粒的干酪乳杆菌各O. 5mL离心去上清后，分别用PBS洗菌体3次； 加入兔源抗IPNV VP2蛋白高免血清，混匀，37'C作用60min,4 000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3 次；加入稀释的羊抗兔IgG/FITC荧光抗体，悬浮混合后37。C作用60min， 4 000r/min离心5min去上清,PBS 离心洗菌体3次；菌体沉淀物悬浮于200 n L PBS缓冲液中，取适量涂片，自然干燥后，预冷丙酮固定30min后, 荧光显微镜观察。
权利要求
1. 一种表达传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征是它是保藏在中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC NOM209003的重组干酪乳杆菌。
2. —种表达传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的方法，其特征是根据传染性胰腺坏 死病毒VP2蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进行PCR，获得含有IPNV VP2基因主要抗原位点的1095bp目的片段，将扩增得到的IPNVVP2基因与表面表达的载体质粒pPGl进 行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌Za"ote" /"5 cosw' 393细胞内，含阳性重组质粒pPGl-IPNV VP2 的干酪乳杆菌命名为pPGl-IPNV VP2/i.mse/ 393。将重组pPGl-IPNV VP2/Z.ca5e/ 393在乳糖的诱导下进 行表达。根据权利要求1所述的表达传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的方法，其特征是所述的 引物序列为Pl 5 'GgatecaGAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC 3', P2 5' CtcgagTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG 3'。
3. 根据权利要求2所述的表达传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的制法，其特征是(1) IPNV VP2基因干酪乳杆菌表达载体的构建用质粒DNA小量提取试剂盒从大肠杆菌pMD18-T-IPNV VP2/JM109和含质粒pPGl干酪乳杆菌 Z。cto6ac///us 393中提取重组质粒pMD18-T-IPNV VP2及质粒pPGl 。将pPGl和pMD18-T- IPNV VP2 分别进行双酶切后分别对目的片段进行回收纯化。将回收的pPGl和VP2的纯化产物进行连接，将连接产 物电转化于感受态细胞Iacto6a 7/ 5 c"m' 393，含阳性重组质粒pPGl-IPNV VP2的干酪乳杆菌命名为 pPGl-IPNV VP2/Z孺d 393。(2) IPNVVP2蛋白干酪乳杆菌中的诱导表达将pPGl-IPNVVP2/丄.caw/393单个菌落接种5mL MRS液体培养基中过夜培养使菌种活化，活化菌种按 1 : 20比例接种于10mL含W乳糖的服S培养基中，30'C诱导16h。诱导前和诱导后样品各lmL以12 000r/min 离心5rain,菌体用100iiL 10mg/mL的溶菌酶，37。C水浴作用60min ,12 000r/min离心5niin ,弃上清，加入1X PBS和等量的2XSDS-PAGE样品缓冲液(含DTT),混匀，沸水浴5rain, 12000r/min离心5min,以蛋白质标准分 子量为参考,分别取出lml样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE及Western-blot分析。(3)间接免疫荧光检测取经诱导的重组千酪乳杆菌和含空质粒的干酪乳杆菌各O. 5mL离心去上清后,分别用PBS洗菌体3次； 加入兔源抗IPNV VP2蛋白高免血清，混匀，37。C作用60min,4 000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3 次；加入稀释的羊抗兔lgG/FITC荧光抗体，悬浮混合后37。C作用60min,4 000r/min离心5min去上清,PBS 离心洗菌体3次；菌体沉淀物悬浮于200li L PBS缓冲液中,取适量涂片，自然干燥后，预冷丙酮固定30min后， 荧光显微镜观察。
全文摘要
本发明提供的是一种表达传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreas necrosis virus，IPNV)VP2蛋白的重组干酪乳杆菌及制法。根据传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进行PCR，获得含有IPNV VP2基因主要抗原位点的1095bp目的片段，将扩增得到的IPNV VP2基因与表面表达的载体质粒pPG1进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393细胞内，含阳性重组质粒pPG1-IPNV VP2的干酪乳杆菌命名为pPG1-IPNV VP2/L.casei 393。将重组pPG1-IPNV VP2/L.casei 393在乳糖的诱导下进行表达。本发明中构建了传染性胰腺坏死病毒VP2蛋白干酪乳杆菌表达载体系统，表达了含有IPNV VP2蛋白主要抗原位点的约40KDa的目的蛋白，免疫印迹实验和间接免疫荧光试验均表明，所表达的外源蛋白能够与IPNV免疫血清发生反应，表明重组VP2蛋白与IPNV天然抗原一样具有相同的抗原性。
文档编号C12N1/21GK101508969SQ200910071260
公开日2009年8月19日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者乔薪瑗, 敏 刘, 李一经, 葛俊伟, 赵丽丽 申请人:东北农业大学