专利名称：一种产紫杉醇的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产紫杉醇的真菌。
背景技术：
恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康，而且癌症是目前人类疾病中仅次于 心脑血管疾患的第二大死因。
紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物 碱类药物。由于红豆杉(又名紫杉)是珍稀树种，生长速度缓慢，并且其生 物学特性对生态环境要求较高，天然更新能力差，所以种群数量极为有限， 属濒危保护植物，资源十分有限，因此国内外学者都在积极地研究开发紫杉 醇的新药源。
微生物发酵生产是降低成本、大量获取紫杉醇的最理想方法。1993年美 国蒙塔那州立大学化学家Andrea Stierle和植物病理学家Gary Strobd在蒙塔那 西北部国家冰川公园的短叶红豆杉中分离到一株内生真菌T^com^M 朋Ae朋Ge，在Stierle等的工作一经发表，美国细胞克隆公司就出价100万美 元支持蒙塔那州立大学的这项研究。由于紫杉醇巨大的医用价值，致使国内 外的学者纷纷加入产紫杉醇微生物的研究，但是目前分离得到的可用于紫杉 醇微生物发酵的菌株依然屈指可数，难以满足市场和研究的需要。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种新的产紫杉醇的内生真菌，增加可用于紫 杉醇微生物发酵的菌株数量。
本发明产紫杉醇的内生真菌HD86-9 (^^erg/〃w m'ger var. toc/HD86-9) 属于黑曲霉紫杉变种(Apwg77/w w'gw var. tod D. P. Zhou, K. Zhao et W. X. Ping, var. wov)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2006年12月 25日，保藏号为CCTCCM 206137。
本发明产紫杉醇的内生真菌HD86-9采用现有常规发酵方法和发酵条件 进行产紫杉醇发酵，发酵液中紫杉醇产量为273.46pg/L。本发明产紫杉醇的内生真菌HD86-9经形态学、18S rDNA序列和ITS分 析为黑曲雾紫杉变种(j5pew/〃uy "/ger var. tod D. P. Zhou, K. Zhao et W. X. Ping, var.朋v)，属于新种。本发明不仅增加了一种产紫杉醇的内生真菌，而 且为将来产紫杉醇微生物的基因改造，奠定了物质基础。
本发明产紫杉醇的内生真菌HD86-9(黑曲霉紫杉变种HD86-9 m'ger var. tod HD86-9)属于黑曲霄紫杉变禾中(y4s/ e^7'〃ws m'ger var. tod D. P. Zhou, K. Zhao et W. X. Ping， var.朋v)，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2006年12月25日，保藏号 为CCTCCM 206137。
图1是产紫杉醇的内生真菌HD86-9菌落形态图；图2是产紫杉醇的内生 真菌HD86-9分生孢子头的光学显微镜观察图(X1000倍)；图3是紫杉醇的 内生真菌HD86-9分生孢子头的电子显微镜观察图；图4是产紫杉醇的内生真 菌HD86-9分生孢子的扫描电子显微镜观察图(X5000倍)；图5是产紫杉醇 的内生真菌HD86-9与Genbank中收录的相近菌株的18S rDNA所构建的系统 发育树；图6是产紫杉醇的内生真菌HD86-9与Genbank中收录的相近菌株的 ITS区(包括5.8SrDNA)所构建的系统发育树。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施 方式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9 "^wg///^ "/ger var. tod HD86-9)属于黑曲霉紫杉变种"s/ ^g"/船m.ger var. D. P. Zhou, K. Zhao et W. X. Ping, var. "ov)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 日期为2006年12月25日，保藏号为CCTCCM 206137。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9经18S rDNA序列比对(NCBI数据库)与 曲霉属Jwwg///w内各种之间有极高的同源性，同源性为98%以上，因此确 认产紫杉醇的内生真菌HD86-9在进化地位上与曲霉属的亲缘关系 较近。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9与Genbank中收录的相近菌株的18S rDNA所构建的系统发育树如图5所示。产紫杉醇的内生真菌HD86-9与Genbank 中收录的相近菌株的ITS区(包括5.8S rDNA)所构建的系统发育树如图6 所示。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是产紫杉醇 的内生真菌HD86-9为东北红豆杉(rams cwj^W"to Sieb. et Zucc.)树皮中的 内生真菌菌株。其它与实施方式一相同。
本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9从东北红豆杉(rax^ Sieb. etZucc.)树皮中分离得到。本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9按 以下步骤分离获得 一、将东北红豆杉树皮先用无菌水冲洗(去掉树皮表面 的尘土等杂质)，再用质量浓度为75。/。的酒精浸泡3 10min，然后用无菌水冲 洗(冲洗去酒精)，在用无菌剪刀剪成面积为0.5cmX0.5cm的东北红豆杉树 皮小块；二、将东北红豆杉树皮小块分别栽种于PDA培养基、查氏(Czapek) 培养基和马丁 (Martin)琼脂培养基平板后在25"C条件下恒温培养至东北红 豆杉树皮小块周围明显长出菌丝；三、采用尖端菌丝挑取法挑取菌落接种于 PDA固体培养基，在28匸恒温条件下培养3 5天，选择平板上生长速度快、 菌落直径大的单菌落，再接种于改良S-7培养基在25i:、 120r/min的恒温摇 床上避光培养、发酵12天，之后采用薄层层析及高效液相色谱法分别进行定 性和定量分析，选取产紫杉醇微生物得到本实施方式产紫杉醇的内生真菌 HD86-9。
本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9分离过程中使用的改良S-7培养 基是在Sterle等人(Sterle A, Strobel Q Stierle D. Taxol and taxant production by Taxomyces andreanae, an endophttic fungus of pacific yew. Science, 1993， 260(9》 214—216)原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度 1.5~5.0'mg/L。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点是产紫 杉醇的内生真菌HD86-9菌落质地为绒毛状、有放射状沟纹，菌落反面为黄色、 颜色由外向内逐渐加深至黄褐色或黑褐色；产紫杉醇的内生真菌HD86-9菌株 有气生菌丝，产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子结构大量，分生孢子头 为碳黑色、球形，分生孢子头直径为150 500pm，顶囊为球形或近球形、直
5径为30 80pm。其它与实施方式一或二相同。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子头老后分裂成几个圆柱状结构， 直径可达800|am或更大。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9在査氏酵母琼脂培养基、25t:条件下培养5 天，菌落平坦、直径为43 60mm。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9的菌落菌落形态如图1所示(PDA培养基)， 在光学显微镜下观察产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子头如图2所示， 在电子显微镜下观察产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子头如图3示，在 扫描电子显微镜下观察产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子如图4所示。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是产紫杉醇 的内生真菌HD86-9的顶囊全部表面可育，产孢结构为双层；产紫杉醇的内生 真菌HD86-9梗基的尺寸为12 35pmx5 l(Him，老时呈褐色；产紫杉醇的内 生真菌HD86-9瓶梗的尺寸为8 12|omx2 5nm;分生孢子为球形、直径为 20 33pm、壁粗糙，具有不规则的脊状突起。其它步骤及参数与实施方式三 相同。
产紫杉醇的内生真菌HD86-9的梗基在一定时间范围内随着菌龄的增加 而增大，通常为12 35pmx5 l(nim，大者可长达80pm。产紫杉醇的内生真 菌HD86-9的分生孢子与黑曲霉相比显著增大，分生孢子壁明显粗糙。
具体实施方式
五本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9按以下步骤制 备紫杉醇1)菌体活化及种子培养将产紫杉醇的内生真菌HD86-9接种于 PDA斜面，在28"C活化2 3次；然后活化后的菌种接于PDA液体培养基
(50mL/250mL三角瓶)，在28。C、 120r/min条件下摇床培养(种子培养)；2) 发酵培养将种子培养液以3% (v/v)接种量转入改良后的S-7培养基
(200mL/500mL三角摇瓶)中，在28。C、 120r/min条件下培养，每组设3个 平行样；3)紫杉醇提取摇瓶发酵培养12天后萃取发酵液，滤液和菌丝体 均回收，用等体积的乙酸乙酯分两次对滤液进行萃取，分液漏斗静止lh分层， 上层有机相中溶有紫杉醇，下层水相弃掉；同时研磨菌丝体并加入30mL的乙 酸乙酯，震荡萃取30min过滤，合并有机相用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，待 剩下5mL溶液，将溶液倒入平皿中，5(TC干燥，用少量的乙腈反复冲洗平皿
6表面的微量的紫杉醇，定溶至2mL， 4"C保存或检测。
本实施方式产紫杉醇的内生真菌HD86-9的发酵液中紫杉醇产量为 273.46pg/L。
权利要求
1、一种产紫杉醇的内生真菌，其特征在于产紫杉醇的内生真菌HD86-9(Aspergillus niger var.taxi HD86-9)属于黑曲霉紫杉变种(Aspergillus niger var.taxi D.P.Zhou，K.Zhao et W.X.Ping，var.nov)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2006年12月25日，保藏号为CCTCC M 206137。
2、 根据权利要求l所述的一种产紫杉醇的内生真菌，其特征在于产紫杉 醇的内生真菌HD86-9为东北红豆杉(r似w Sieb. et Zucc.)树皮中 的内生真菌菌株。
3、 根据权利要求1或2所述的一种产紫杉醇的内生真菌，其特征在于产 紫杉醇的内生真菌HD86-9菌落质地为绒毛状、有放射状沟纹，菌落反面为黄 色、颜色由外向内逐渐加深至黄褐色或黑褐色；产紫杉醇的内生真菌HD86-9 菌株有气生菌丝，产紫杉醇的内生真菌HD86-9的分生孢子结构大量，分生孢 子头为碳黑色、球形，分生孢子头直径为150 500nm，顶囊为球形或近球形、 直径为30 80jim。
4、 根据权利要求3所述的一种产紫杉醇的内生真菌，其特征在于产紫杉 醇的内生真菌HD86-9的顶囊全部表面可育，产孢结构为双层；产紫杉醇的内 生真菌HD86-9梗基的尺寸为12 351imx5 10pm，老时呈褐色；产紫杉醇的 内生真菌HD86-9瓶梗的尺寸为8 12pmx2 5^im;分生孢子为球形、直径为 20 33pm、壁粗糙，具有不规则的脊状突起。
5、 根据权利要求3所述的一种产紫杉醇的内生真菌，其特征在于产紫杉 醇的内生真菌HD86-9在査氏酵母琼脂培养基、25。C条件下培养5天，菌落平 坦、直径为43 60mm。
全文摘要
一种产紫杉醇的内生真菌，它涉及一种产紫杉醇的真菌。本发明提供一种新的产紫杉醇的内生真菌，增加可用于紫杉醇微生物发酵的菌株数量。产紫杉醇的内生真菌HD86-9属于黑曲霉紫杉变种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2006年12月25日，保藏号为CCTCC M 206137。本发明产紫杉醇的内生真菌HD86-9经形态学、18S rDNA序列和ITS分析为黑曲霉紫杉变种，属于新种。本发明不仅增加了一种产紫杉醇的内生真菌，而且为将来产紫杉醇微生物的基因改造，奠定了物质基础。
文档编号C12N1/14GK101486974SQ20091007143
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者周东坡, 平文祥, 强 李, 凯 赵 申请人:黑龙江大学