专利名称：一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的快速分离方法及所用到的引物。
背景技术：
厌氧反硝化细菌主要用于硝酸盐污水的处理，同时近年来用厌氧反硝化细 菌控制硫酸盐还原的研究较多，并且取得了很好的效果。
目前，厌氧反硝化细菌的分离周期较长，分离过程中工作量大，厌氧条件 难以控制，同时不易获得纯菌株；还存在即使获得了菌株，却不是目的功能菌 株，而且非目的菌株对硝酸盐和亚硝酸的降解效果不好。厌氧反硝化细菌的分 离难，导致许多的基础理论的研究无法进行，随着环境的日益恶化，特别是地 下水硝酸盐污染的加剧，厌氧反硝化细菌的分离和相关的研究凸显初重要性。
发明内容
本发明目的是为了解决现有厌氧反硝化细菌的分离周期长、工作量大和不 易获得目的功能菌株和纯菌株的问题，而提供一种厌氧反硝化细菌的快速分离 方法及所用到的特异性引物。
厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤实现 一、采用DNA抽提试 剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性引物对DNA进行PCR扩增， 选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌氧菌液态培养基中，采用 Himgate厌氧操作技术(亨盖特厌氧操作技术)进行厌氧反硝化细菌的分离培 养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛 得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化 细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液 体培养基中进行富集培养7~14天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌 的DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反 硝化细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养 的菌液进行镜鉴和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行 PCR扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株，即完成厌氧反硝化细菌的快速分离；其中步骤一中PCR扩增程序为94'C预热 5min、 94。C变性30s、 55.9。C复性45s、 72。C延伸90s、循环30次和72。C延伸 10min ; 步骤 一 中特异性引物为上游特异性引物 5'-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3，， 下游特异性引物 5'-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3';步骤一中PCR扩增的反应体系如下
10xPCR Buffer 2pL
dNTPs(0.3mmol/L) 2jiL
上游引物(0.1pmol/L) lpL
下游引物(0.1pmol/L) l(iL
,E(0.3U/)iL) 0.3(iL
DNA样品(2吗/L) 2fiL
补足dH20 至20pL ;
步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KN03、 2.0g的NaN03， 0.03g的 MgS04'7H20、 0.5gWK2HPO4、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的 FeCl2*6H20、 0.2g的CaCl2'2H20和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤二中 厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO3、 2.0g的NaNO3、 0.03g的MgS04'7H20、 0.5g的K2HP04、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的FeCl2'6H20、 0.2g 的CaCly2H20、 12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤一和步骤 三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中 细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。
厌氧反硝化细菌的快速分离方法所用到的特异性引物，上游特异性引物为 5，-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3，， 下游特异性引物为 5'-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3，。
本发明中厌氧反硝化细菌的快速分离与现有厌氧反硝化细菌的分离方法 相比，周期縮短了40%~50%，工作量小；通过特异性引物的PCR扩增，避免
了非厌氧反硝化细菌对检测的干扰，使得整个实验结果误差小，准确可靠，容 易获得目的菌株和纯菌株，且对硝酸盐和亚硝酸的降解效果好。
图1为具体实施方式
六中分离得到的厌氧反硝化细菌的扫描电镜图，图2为具体实施方式
六中分离得到的厌氧反硝化细菌的原子力显微镜观察图，图3 为具体实施方式
六中分离得到的厌氧反硝化细菌的系统发育分析图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于,以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤
实现 一、采用DNA抽提试剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性 引物对DNA进行PCR扩增，选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌 氧菌液态培养基中，采用Himgate厌氧操作技术进行厌氧反硝化细菌的分离培 养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛 得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化 细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液 体培养基中进行富集培养7~14天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌 的DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反 硝化细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养 的菌液进行镜鉴和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行 PCR扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株， 即完成厌氧反硝化细菌的快速分离；其中步骤一中PCR扩增程序为94"C预热 5min、 94。C变性30s、 55.9。C复性45s、 72。C延伸90s、循环30次和72。C延伸 10min ;步骤 一 中特异性引物为上游特异性引物
5'-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3，，下游特异性引物
5'-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3'; 步骤一中PCR扩增的反应体系如下
10xPCR Buffer 2pL
dNTPs(0.3mmol/L;) 2pL
上游引物(0.1pmol/L) lpL
下游引物(0.1pmol/L) lpL
,E(0.3U/pL) 0.3 fxL
DNA样品(2吗/L) 2pL
补足dH20 至20pL ;步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KN03、 2.0g的NaN03， 0.03g的 MgS04'7H20、 0.5gWK2HPO4、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的 FeCl2'6H20、 0.2g的CaCl2'2H20和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤二中 厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO3、 2.0g的NaNO" 0.03g的MgS04'7H20、 0.5g的K2HP04、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的FeCl2'6H20、 0.2g 的CaC1^2H20、 12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤一和步骤 三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中 细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。 本实施方式中DNA抽提试剂盒试剂盒按说明书操作。 本实施方式步骤一中厌氧菌液态培养基配制过程中驱除培养基中的氧气， 是在培养基煮沸过程中，通入体积纯度为99.99%的氮气以驱除氧气，同时向 培养基中加入还原剂(L-半胱氨酸)，利用其还原作用去除氧，降低氧化还原电 位(低于-100mV)，获得厌氧条件。
本实施方式步骤一中厌氧反硝化细菌的分离培养，是在35 38"C的厌氧条 件下培养7~12天。
本实施方式步骤一中对分离培养得到的菌进行检验，按《简明第八版伯杰 氏细菌鉴定手册》进行检验。
本实施方式步骤二中厌氧反硝化细菌的纯化培养，是在35 38'C的厌氧条 件下培养至长出菌落。
本实施方式步骤三中对富集培养的菌液进行镜鉴和革兰氏染色，按《简明 第八版伯杰氏细菌鉴定手册》进行检验。
本实施方式步骤四中获得的纯菌株进行功能验证，厌氧条件去除硝酸盐和 亚硝硝酸盐。
本实施方式步骤四中获得的纯菌株，进行生理生化鉴定、脂肪酸分析和 16srDNA系统发育分析，进一步证明纯菌株是厌氧反硝化细菌。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中厌氧菌 固体培养基的成分配置好后放入到电磁锅中，煮沸后加入L-半胱氨酸0.5g和
质量浓度为0.2%的刃天青溶液(指示剂)此时有氧气存在，培养基的颜色为粉红 色，不断加热煮沸，盖上锅盖，通入质量纯度为99.99%的氮气驱氧30 40min，
7直至培养基由粉红色变成无色，然后厌氧管分装，在12rc的条件下灭菌
20min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中富集培 养8 12天。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中富集培 养10天。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
五本实施方式厌氧反硝化细菌的快速分离方法所用到的特
异性引物，上游特异性引物为5，-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/qCGACGATC-3，， 下游特异性引物为5，-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3，。
具体实施方式
六本实施方式厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤 实现 一、采用DNA抽提试剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性 引物对DNA进行PCR扩增，选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌 氧菌液态培养基中，采用Hungate厌氧操作技术进行厌氧反硝化细菌的分离培 养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛 得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化 细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液 体培养基中进行富集培养IO天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反硝化 细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养的菌 液进行镜鉴和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR 扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株，即完 成厌氧反硝化细菌的快速分离;其中步骤一中PCR扩增程序为94'C预热5min、 94。C变性30s、 55.9。C复性45s、 72。C延伸90s、循环30次和72。C延伸10min; 步骤 一 中特异性引物为上游特异性引物 5'-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3，， 下游特异性引物 5，-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3'; 步骤一中PCR扩增的反应体系如下
10xPCR Buffer 2pL
dNTPs(0.3mmol/L) 2pL
上游引物(0.1iamol/L) lpL下游引物(0.1^imol/L)
,e(o.3u/jil;)
DNA样品(2吗/L) 补足dH20
2|jL
至20(xL
步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KN03、 2.0g的NaN03， 0.03g的 MgS04'7H20、 0.5gWK2HPO4、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的 FeCl2'6H20、 0.2g的CaCl2'2H20和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤二中 厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO3、 2.0g的NaNO3、 0.03g的MgS04'7H20、 0.5g的K2HP04、 10g的酒石酸钾钠、l.Og的KH2P04、 0.5g的FeCl2'6H20、 0.2g 的CaCl2'2H20、 12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH=7.5;步骤一和步骤 三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中 细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。
本实施方式中样品采自大庆油田地面注水系统，根据大庆油田现场采油情 况现状，选取大庆油田四厂杏九联合污水处理站。
本实施方式中厌氧反硝化细菌的快速分离与现有分离方法相比，周期縮短 了50%，且获得了目的菌株的纯菌株。
本实施方式中分离得到的厌氧反硝化细菌进行生理鉴定，如图1和图2 所示，细菌为短杆菌、菌体大小为宽0.4 0.8lamX长1.0 2.5(im;本实施方式 中分离得到的厌氧反硝化细菌进行生化鉴定，细菌革兰氏染色呈阴性、接触酶 试验为阳性、甲基红试验为阴性、水解淀粉试验为阳性、水解油脂试验为阳性、 乙酰甲基醇试验为阴性、产吲哚试验为阳性、柠檬酸盐利用试验为阳性、石蕊 牛奶还原且酸凝固、硝酸盐还原试验为阳性、液化明胶试验为阴性、产生H2S 试验为阴性、产氨试验为阳性、尿素水解试验为阳性、葡萄糖氧化发酵产酸、 葡萄糖发酵试验为阴性、果糖发酵试验为阴性、乳糖发酵试验为阴性、蔗糖发 酵试验为阴性、乙醇发酵试验为阴性、生长温度为20 40°C、生长pH值为 7.5、平板菌落呈圆形、表面隆起、白色。
本实施方式中分离得到的厌氧反硝化细菌进行脂肪酸分析，脂肪酸主要分
含量分别为9.05%、 35.65%、 27.78%和6.00%占到脂肪酸总数的78.48%。
9本实施方式中分离得到的厌氧反硝化细菌经测序后获得1446bp的16S rDNA序列，GenBank登录号为DQ450463，采用邻接法(NJ)构建系统进化树， 如图3所示，系统发育树15个菌株的平均遗传距离为0.065，系统进化表明， 菌株的16S rDNA序列与T7zm/era sp.(AM231040)的相似性为99%，结合菌株 的形态学和生理学特性，初步鉴定为T7zm^rasp.属于厌氧反硝化细菌。序列表
<110>哈尔滨师范大学
<120>—种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物
<160>2
<210> 1 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>上游特异性引物 <220>
<221> misc—feature <222> (3，4，11) 〈223〉y-t或c， s-g或c
<400> 1
gcyyaccaag scgacgatc 19
<210>2 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列
<220><223>下游特异性引物 <■> 2
accagggtat ctaatcctg 19
权利要求
1、一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤实现一、采用DNA抽提试剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性引物对DNA进行PCR扩增，选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌氧菌液态培养基中，采用Hungate厌氧操作技术进行厌氧反硝化细菌的分离培养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液体培养基中进行富集培养7～14天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反硝化细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养的菌液进行镜鉴和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株，即完成厌氧反硝化细菌的快速分离；其中步骤一中PCR扩增程序为94℃预热5min、94℃变性30s、55.9℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min；步骤一中特异性引物为上游特异性引物5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’，下游特异性引物5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’；步骤一中PCR扩增的反应体系如下10×PCR Buffer 2μLdNTPs(0. 3mmol/L) 2μL上游引物(0. 1μmol/L)1μL下游引物(0. 1μmol/L)1μLrTaq E(0. 3U/μL)0.3μLDNA样品(2μg/L) 2μL补足dH2O 至20μL；步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KNO3、2.0g的NaNO3，0.03g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH2PO4、0.5g的FeCl2·6H2O、0.2g的CaCl2·2H2O和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤二中厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO3、2.0g的NaNO3、0.03g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH2PO4、0.5g的FeCl2·6H2O、0.2g的CaCl2·2H2O、12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤一和步骤三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。
2、 根据权利要求1所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征 在于步骤二中厌氧菌固体培养基的成分配置好后放入到电磁锅中，煮沸后加入 L-半胱氨酸0.5g和质量浓度为0.2%的刃天青溶液(指示剂)此时有氧气存在， 培养基的颜色为粉红色，不断加热煮沸，盖上锅盖，通入质量纯度为99.99% 的氮气驱氧30 40min，直至培养基由粉红色变成无色，然后厌氧管分装，在 12rC的条件下灭菌20min。
3、 根据权利要求2所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征 在于步骤三中富集培养8~12天。
4、 根据权利要求2所述的一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征 在于步骤三中富集培养10天。
5、 一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法所用到的特异性引物，其特征在 于上游特异性引物为5，-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3，，下游特 异性引物为5，-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3，。
全文摘要
一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物，它涉及一种细菌的快速分离方法及所用到的引物。它解决了现有厌氧反硝化细菌的分离周期长、工作量大和不易获得目的功能菌株和纯菌株的问题。方法一、提取样品中微生物DNA进行PCR扩增，分离培养，初筛出厌氧反硝化细菌；二、制备特异性培养基进行纯化至长出菌落；三、菌落富集培养，进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、重复分离、纯化和富集培养，鉴定再进行PCR扩增去除重复菌株，然后重复分离和纯化培养至获得纯菌株。上游引物为SEQID NO1，下游引物为SEQ ID NO2。本发明分离周期缩短了40％～50％，工作量小，容易获得目的菌株和纯菌株。
文档编号C12Q1/68GK101519643SQ20091007169
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者王月媛, 胡建民, 利 魏 申请人:哈尔滨师范大学