专利名称：利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速、高密度的培养曱烷氧化细菌生产曱烷氧化 菌素的方法。
背景技术：
曱烷氧化细菌是自然界中一类能够以曱烷为唯一碳源和能源进行 生长的特殊的微生物。曱烷氧化细菌的典型特征是含有曱烷单加氧酶。曱烷氧化 细菌首先通过曱烷单加氧酶催化将甲烷氧化为曱醇，生成的曱醇可进一步氧化为 甲醛，曱醛再转化为细胞生物物质或深度氧化为曱酸，最后经过曱酸脱氢酶催化 的反应生成二氧化碳，曱烷氧化细菌在此过程中获得生长所需的碳骨架和能量。铜在曱烷氧化细菌中扮演着重要的生物学角色。曱烷氧化细菌的生长和曱烷 单加氧酶的合成都受到铜的调节，同时铜还参与了曱烷单加氧酶活性中心和内膜 系统的构建。甲烷氧化细菌能够分泌对铜具有强亲和力的曱烷氧化菌素捕捉周围 环境中的铜，与铜结合的甲烷氧化菌素会被曱烷氧化细菌识别而重新回到细胞中 从而起到富集铜的作用。由于甲烷氧化菌素与铜结合后具有较强的超氧化物歧化酶活性，分子量小， 结构稳定，是非常有潜力的天然食品抗氧化剂资源。利用甲烷为碳源在低铜条件下发酵培养曱烷氧化细菌，使其向发酵介质中分 泌曱烷氧化菌素是获得曱烷氧化菌素的主要途径。然而， 一般情况下，由于曱烷在水溶液中的溶解度低，碳源不足导致曱烷氧 化细菌生长速度慢，发酵液中细胞密度低，细胞分泌到发酵液中的曱烷氧化菌素 的浓度也低。曱烷氧化的中间产物甲醇也可以作为甲烷氧化细菌的碳源和能源， 但曱烷氧化细菌对曱醇的耐受性差，直接添加体积百分含量为0.01% (v/v)的 液态曱醇就会导致曱烷氧化细菌迅速失活而无法生长。这些已成为限制曱烷氧化 菌素实际应用的瓶颈问题。因此，对甲烷氧化细菌进行快速、高密度培养来获得曱烷氧化菌素具有着重 要的实用意义。
发明内容
本发明目的是提供一种工艺较为简单、成本低廉、快速、高密度 的利用曱烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法。本发明目的是这样实现的是在 常规培养曱烷氧化细菌的液体培养基中添加曱醇，在发酵液中获得曱烷氧化菌 素。曱醇在液体培养基中的体积百分含量为0.01-1%。所使用的甲烷氧化细菌是 以曱醇蒸汽作为碳源首先对曱烷氧化细菌进行驯化培养，然后逐渐增加培养基液态曱醇浓度使其适应而得到的能耐受1%浓度曱醇的曱烷氧化细菌。在甲醇的体 积百分含量为0.01-1 %的液体培养基中培养甲烷氧化细菌过程中，釆用抽真空法 置换入曱烷-氧气混合气，对其进行曱烷-曱醇共培养，其中，曱烷和氧气的体积比范围为1:1-1:10。 5 、 一种利用曱烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法，其特 征在于权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利要求4任一项所述方法培 养得到的曱烷氧化细菌生产曱烷氧化菌素的方法。为解决上述技术问题，本发明 采取以下技术方案 一种快速、高密度的培养曱烷氧化细菌生产曱烷氧化菌素的 方法，包括以下2个方面1、 以曱醇蒸汽作为碳源首先对甲烷氧化细菌进行驯化培养，然后逐渐增加 液态甲醇浓度使其适应，得到能耐受体积百分浓度为1%甲醇的甲烷氧化细菌。2、 在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中添加甲醇，其它培养条件与常 规培养方法相同。用上述方法对曱烷氧化细菌进行培养时，只需将曱醇直接加入常规培养曱烷 氧化细菌的液体培养基中即可，其在培养基中的体积百分含量优选为0.01-1%。 此外，在上述的含甲醇液体培养基培养甲烷氧化细菌过程中，还要向所述液体培 养基中釆用抽真空法置换入曱烷-氧气混合气，对其进行甲烷-甲醇共培养，待发 酵液变黄后，可在发酵液中得到曱烷氧化菌素。本发明公开了一种快速、高密度培养甲烷氧化细菌生产曱烷氧化菌素的方 法。该方法是在釆用甲醇蒸汽对甲烷氧化细菌进行驯化使曱烷氧化细菌能耐受 1%浓度曱醇的的基础上，在培养基中添加甲醇。在用本发明的方法对曱烷氧化细 菌进行培养时，甲醇在水中的高溶解度解决了碳源供应不足无法满足细胞的大量 生长需要的问题。与常规培养方法相比，本发明的方法可以极大程度地提高甲烷 氧化细菌的生长细胞密度，且培养方法简单，发酵液中曱烷氧化菌素含量高，其 有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在曱烷氧化菌素的工业应 用中发挥巨大作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对木发明作进一步详细说明。
具体实施例方式是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中添加甲醇，在发 酵液中获得甲烷氧化菌素。甲醇在液体培养基中的体积百分含量为0.01-1%。所 使用的甲烷氧化细菌是以甲醇蒸汽作为碳源首先对甲烷氧化细菌进行驯化培养， 然后逐渐增加培养基液态甲醇浓度使其适应而得到的能耐受1%浓度曱醇的甲 烷氧化细菌。在甲醇的体积百分含量为0.01-1 %的液体培养基中培养甲烷氧化细 菌过程中，采用抽真空法置换入曱烷-氧气混合气，对其进行甲烷-甲醇共培养， 其中，曱烷和氧气的体积比范围为1:1-1:10。 5 、 一种利用曱烷氧化细菌生产甲 烷氧化菌素的方法，其特征在于权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利 要求4任一项所述方法培养得到的甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特 别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度， 所有培养基中的溶剂均为去离子水。无机盐培养基成分如下(g/L) : NH3C1: 0.5; K2HP04: 0.49; KH2P04 7H20: 0. 40;MgS04 ■ 7H20: 0. 3; CaCl2 . 2H20: 0. 02; KN03: 1. 6; NaCl: 0. 3; FeS04 7H20: 0. 004;MnS04 ,H20: 0. 0004; ZnS04 . 7H20: 0. 00034; Na2Mo04 '2H20: 0. 00024; CuS04 .7H20:0. 00001; pH7. 0。
实施例l 、曱烷氧化细菌的甲醇驯化
以甲烷氧4匕细菌"/cAo《/7or/wz7 IMV 3011为例，具体过程如
下
曱醇驯化在一个内部中心固定有玻璃管的500毫升三角瓶中进行，将IO毫升曱醇添加到三角瓶中心的玻璃管内，玻璃管顶端的小孔允许甲醇蒸汽扩散出来，将150毫升无才几盐培养基添加到三角瓶中，甲烷氧化细菌i/^力y/o;f/i7W; "/c力o^wW咖IMV 3011接种量为5%。接种后每隔24小时采用抽真空法置换入新鲜的曱烷-氧气(l:lO, V/V)混合气，32摄氏度，300转/分钟摇床培养，培养72~96小时后取培养物7.5毫升接入新鲜的150毫升无机盐培养基中继续驯化培养。反复操作11次后开始逐渐向培养基中添加从0, 01 % ( V/V)到1 % ( V/V )的液态曱醇继续驯化培养，培养过程中每隔24小时换入新鲜的混合气。经过驯化后最终得到可以在含有l'/。甲醇的液体培养基中生长的曱基弯菌乂fr/c力os/;or/咖IMV 3011。
实施例2、本发明的甲烷氧化细菌培养方法与曱烷氧化细菌常规培养方法的
比较
对甲醇驯化后的曱烷氧化细菌#e^r/^/"M打/c力o^oW咖IMV 3011进行本发明培养方法与甲烷氧化细菌常规培养方法的培养效果比较，具体过程如下
1. 甲烷氧化细菌^fe^^oy/i7^ "/c力M/;o/7咖IMV 3011的常规培养用常规方法对曱烷氧化细菌#"Ay/oW/zM m'c力o^wW咖IMV 3011进行培
养，具体方法为
将曱烷氧化细菌vJfe^^/f^// ^ "/c力o"oW咖IMV 3011以5%接钟量接种在含有100毫升无菌液体培养基的500毫升密闭的三角瓶中，采用抽真空法将空气置换为曱烷-氧气(1:10， V/V)的混合气，32摄氏度，300转/分钟进行培养，每隔24小时取样，采用光密度法，在SP-756P型分光光度计上测定波长600纳米处的光密度值，并采用抽真空法置换入新鲜的甲烷-氧气(1: 10, V/V)的混合气，在相同条件下继续培养，培养96-120小时后中止培养。
甲烷氧化菌素定量测定采用Diaion HP-20大孔吸附树脂层析后冻干称重法。具体步骤如下将培养好的发酵液离心去除细胞，剩余介质以13000 xg二次离心20分钟，上清液用Diaion HP-20大孔吸附树脂层析，然后用体积比60%甲醇和4(^水的溶液洗提DiaionHP-20，洗提液进行真空冷冻干燥，得到甲烷氧化菌素固体。由于曱烷氧化菌素与铜结合后会变成黄色，在394-422nm处有最大吸收，也采用在该波长范围内分光光度法进行定量测定。
2. 添加甲醇对甲坑氧化细菌ife^ yA^//7^ "/c力o^ or/V迈IMV 3011进行
培养将甲烷氧化细菌ife^r/os/zz^ "/c力o^or/咖IMV 3011以5%接钟量接种在含有100毫升无菌液体培养基的500毫升密闭的三角瓶中，同时添加甲醇使其浓度达到0.2%,釆用抽真空法将空气置换为曱烷-氧气(l:10, V/V)的混合气，32摄氏度，300转/分钟进行培养，每隔24小时取样进行细胞密度测定，采用抽真空法置换入新鲜的甲烷-氧气(1:10， V/V)的混合气并补加0. 2% (V/V)甲醇继续，培养96~120小时后中止培养，进行曱烷氧化菌素含量测定，方法同上。
经甲醇蒸汽驯化的曱烷氧化细菌#e^Ar/os//2fW ^r/c力o"or/咖IMV 3011在甲烷和甲醇中共同培养的细胞的产量高于以甲烷单独培养的细胞的产量，这主要是由于培养基中添加曱醇解决了曱烷在水中溶解度低导致的碳源供应不足，无法满足细胞的大量生长需要的问题。用本方法培养120小时发酵液中甲烷氧化菌素含量为36. 8毫克/升。
结果如表1所示:
碳源培养120小时细胞密度 (毫克干细胞/毫升)培养120小时发酵液甲烷氧> (毫克/升)
曱醇+曱烷1. 5936. 8
甲烷0. 7417. 1
权利要求
1、一种利用甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法，其特征在于是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中添加甲醇，在发酵液中获得甲烷氧化菌素。
2 、根据权利要求1所述的一种利用曱烷氧化细菌生产甲烷氧 化菌素的方法，其特征在于曱醇在液体培养基中的体积百分含量为 0.01-1 % 。
3 、根据权利要求1所述的一种利用曱烷氧化细菌生产曱烷氧 化菌素的方法，其特征在于所使用的曱烷氧化细菌是以曱醇蒸汽作 为碳源首先对曱烷氧化细菌进行驯化培养，然后逐渐增加培养基液态 甲醇浓度使其适应而得到的能耐受1 %浓度甲醇的曱烷氧化细菌。
4 、根据权利要求1或2所述的一种利用曱烷氧化细菌生产甲 烷氧化菌素的方法，其特征在于在甲醇的体积百分含量为0.01-1 %的液体培养基中培养甲烷氧化细菌过程中，采用抽真空法置换入曱 烷-氧气混合气，对其进行曱烷-曱醇共培养，其中，甲烷和氧气的体 积比范围为1:1-1:10。
5 、 一种利用曱烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法，其特征在 于权利要求1或权利要求2或权利要求3或权利要求4任一项所述 方法培养得到的曱烷氧化细菌生产曱烷氧化菌素的方法。
全文摘要
本发明涉及一种快速、高密度的培养甲烷氧化细菌生产甲烷氧化菌素的方法。其特点是是在常规培养甲烷氧化细菌的液体培养基中添加甲醇，在发酵液中获得甲烷氧化菌素。甲醇在液体培养基中的体积百分含量为0.01-1％。所使用的甲烷氧化细菌是以甲醇蒸汽作为碳源首先对甲烷氧化细菌进行驯化培养，然后逐渐增加培养基液态甲醇浓度使其适应而得到的能耐受1％浓度甲醇的甲烷氧化细菌。在甲醇的体积百分含量为0.01-1％的液体培养基中培养甲烷氧化细菌过程中，采用抽真空法置换入甲烷-氧气混合气，对其进行甲烷-甲醇共培养，其中，甲烷和氧气的体积比范围为1∶1-1∶10。本发明的方法可以极大程度地提高甲烷氧化细菌的生长细胞密度，且培养方法简单，发酵液中甲烷氧化菌素含量高，其有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌素的工业应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。
文档编号C12N9/08GK101519653SQ20091007172
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者周琦琼, 静 董, 辛嘉英 申请人:哈尔滨商业大学