专利名称：一种用于升高血小板的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血小板生成素模拟肽(TMP)及胰岛 素样生长因子IGF-I的融合蛋白工程菌的构建以及融合蛋白的制备。
背景技术：
原发或继发性造血功能障碍，尤其是严重血小板减少发生多、危害重、治疗难度 大，如何促进血小板数量和功能恢复是造血重建领域研究的热点和难点之一。血小板生成 素(TP0)是巨核细胞增殖、成熟和血小板产生的主要调节因子，并且在成熟血小板生成中， TP0的作用强于目前已知的几种相关造血因子。它通过与其受体c-Mpl结合而刺激巨核细 胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，控制循环血中血小板的数量和功能。然而作为 一个含300多个氨基酸残基的蛋白质，它也存在着免疫原性强、制备成本高、不能口服以及 引起副作用等方面的不足。1997年美国的Steven等报道利用噬菌体肽库筛选到一种与TP0无序列同源性而 具有与其相似功能的模拟肽。体外实验显示这段由14个氨基酸构成的短肽与c-Mpl受体 有很高的亲和力，具有刺激rhTPO依赖性细胞株Ba/F3/c-mpl的增殖功能。但由于血小板 生成素模拟肽(TMP)是14个氨基酸的短肽，在体内不稳定，极容易降解，而且不容易用基因 工程的方式制备。与现有的技术相比较，本发明所提供的融合蛋白其优势在于，融合蛋白中的IGF-I 是一种从血清中发现的具有促进多种细胞生长功能的活性多肽，由70个氨基酸残基组成 的单一肽链生长因子组成，其一级结构与胰岛素有很高的同源性，属于同一基因家庭，并且 在体内体外都具有部分胰岛素的代谢调节功能。经研究表明，IGF是动物生长的直接调节 物，能够刺激多种细胞的增殖与分化，促进蛋白质的合成和结缔组织及骨髓的产生。而且 IGF-I还能与一些生长因子合用，可促进相应细胞的分化成熟，例如，IGF-I与红细胞生成 素合用，能刺激红细胞的成熟；与单核粒细胞集落刺激因子合用能刺激粒细胞的生成与成 熟。IGF-I刺激RNA，DNA的合成和细胞增殖，特别是对细胞的有丝分裂具有重大意义，其对 骨.肌肉、脂肪组织、肝、肾、脑，的生长都有重要作用。由于IGF-I具有广谱的促进细胞生长的作用，因此将IGF-I与TMP融合，可通过与 TMP受体c-Mpl结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，加强TMP促 进血小板生成作用。本发明所提供的融合蛋白分子量小，利用生物技术方法生产成本低，稳 定性高，可以通过静脉、皮下、肌肉、腹腔注射等途径给药，与天然TP0比较，具有更好的升 血小板的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白，它由TMP及胰岛素样生长因子IGF-I组成。本发明的融合蛋白其主体部分包括两部分，其中TMP的氨基酸具有SEQID NO :1序 列；胰岛素样生长因子IGF-I多肽区具有SEQ ID NO 2序列。的两个主体部分保持各自的完整结构，所述的TMP与胰岛素样生 长因子IGF-I多肽区之间用连接肽进行连接，优选的所述的连接肽由0-10个氨基酸残基组 成，更优选0-5个氨基酸残基组成，实施例中是由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 5个氨基酸残基组 成的短肽。本发明的融合蛋白具有5种形式，融合蛋白各形式的DNA序列分别为SEQ ID NO 3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、或 SEQ ID NO :7 序列，DNA 序列显示各种形式 的融合蛋白中TMP与IGF-I多肽区之间DNA序列使用的是GGT TCT GGC TCT GGC，本领域技 术人员可以选用其他形式的连接肽DNA序列。本发明的另一目的是提供携带本发明融合蛋白DNA序列的重组表达载体。本发明的融合蛋白是利用基因重组技术制造的。本发明的融合蛋白根据氨基酸序列，利用氨基酸密码子的简并性特点，依据不同 表达宿主，包括大肠杆菌、酵母、CH0细胞等多种表达宿主的密码子偏嗜性，本领域人员可以 编码不同的核苷酸序列，使其在不同宿主内高效表达。本发明所设计的核苷酸序列可以化 学合成，也可以采用PCR方法获得。选择在大肠杆菌内高效表达的pET系列表达载体，在酵 母里表达的pPIC9k表达载体、在CH0细胞内表达的pcDNA3. 1表达载体。在大肠杆菌内pET3a+最适合该融合蛋白的表达、且纯化方法也比较简单，不会存 在标签难以去除的问题。将其构建到表达载体pET3a+上，使其在大肠杆菌内高效表达。 其存在形式为包涵体，制备方法为培养工程菌，离心收集菌体，破菌，收集包涵体，包涵体 经洗涤、变性、复性后，分别使用阳离子层析介质和阴离子层析介质进行纯化，获得纯度为 95%以上的样品。将所获得的纯度较高的融合蛋白与TP0(市售)进行升血小板实验。实验方法为 所有小鼠腹腔注射卡钼150mg/kg，即成血小板缺失模型。造模后1天，分别注射市售TP0及 融合蛋白，连续14天，分别于给药前及给药后3-4天所有小鼠采血，检测血小板数值。结果 表明，TMP与IGF-1融合蛋白有明显的升高血小板的作用。本发明的融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂，药物载体包括水、盐水、糖 类等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水液体制剂和冻干制剂。本发明的融合蛋白及其药物制剂可用于治疗多种血小板减少症等疾病，包括各种 原发性及继发性血小板减少，如再生障碍性贫血、原发性血小板减少性紫癜、肿瘤放化疗引 起的血小板减少及多种免疫性血小板减少症。与现有技术比较，本发明的优势在于本发明所提供的融合蛋白具有TMP及胰岛素样生长因子两种多肽的生物学活性， 通过这种融合蛋白表达的方式使TMP更为稳定，延长其半衰期，并且使两种多肽产生优势 互补，使得融合蛋白在促血小板生成方面的作用更为明显。同时将IGF-I与TMP融合，可通 过与TMP受体靶向结合而刺激巨核细胞增殖与分化，能够使得IGF-I具有靶向作用，而促进 血小板生成，减少其使用剂量，从而减少其对其他细胞及器官的影响。本发明所提供的融合 蛋白使两种多肽实现了优势互补，加强了其促巨核细胞增殖-血小板生成的作用，并降低 了 IGF-I对其他细胞的影响，具有高效、副作用低的促血小板生成的作用。胰岛素样生长因子IGF-I与生长激素(GH)相比，在某种程度上可以把GH看作是 IGF-I前体，许多GH的促生长功能是通过IGF-I的效应实现的。IGF单独使用能取得很好的效果，而生长激素使用时常需要大剂量的anabolics和胰岛素的配合使用才能获得好的 效果。因此，IGF-I与TMP的融合蛋白能够更好的发挥促血小板生成作用，同时IGF-I由70 个氨基酸构成，而GH由191个氨基酸构成，IGF-I与TMP的融合蛋白更易于生物工程方法 制备，且本发明所提供的融合蛋白分子量小，易于吸收，可以通过静脉、皮下、肌肉、腹腔注 射等方式给药。本发明以IGF-TMP融合蛋白为例，以附图的形式进行说明，但以下说明并不构成 对本专利的限制。本领域人员利用本发明的技术路线，可以制备其他不同形式的IGF与TMP 融合蛋白，如TMP-M-IGF、TMP-M-IGF-M-TMP、TMP-TMP-M-IGF、IGF-M-TMP-TMP 等。
图1为pET/IGF-M-TMP重组质粒的构建图2为pET/IGF-M-TMP重组质粒双酶切鉴定电泳图 3 为 pET/IGF-M-TMP 融合蛋白的 SDS-PAGE 电泳图4为融合蛋白升血小板活性分析结果
具体实施例方式以下通过实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限 制。下面以大肠杆菌为宿主菌具体叙述一下该融合蛋白的构建与制备过程。实施例1 工程菌构建方法融合基因片段的人工合成根据大肠杆菌密码子使用频率表，选择在大肠杆菌中高效表达的密码子，人为设 计IGF-M-TMP(M序列为GSGSG)融和蛋白基因的序列，委托上海生工生物工程有限公司合 成。现以IGF-M-TMP(IMT)为例详细叙述其构建和制备过程。IGF-M-TMP融合基因表达质粒的构建取IGF-M-TMP融合基因的质粒，使用Nde I和BamH I进行双酶切回收小片段，同 时取pET-3a+原核表达载体，使用Nde I和BamH I进行双酶切回收大片段，将回收的两个 片段利用T4连接酶连接，转化进大肠杆菌DH5 a中，筛选阳性重组子。经双酶切鉴定和序 列测序分析确定后将其命名为pET-IMT。pET-IMT表达工程菌的构建将pET-IMT的表达质粒分别转化进表达菌株BL21 (DE3)中，挑取若干菌落，经LB 过夜培养，次日提取质粒，经Nde I和BamH I酶切鉴定后，选择若干阳性克隆经LB过夜培 养，次日以1 % 10 %的浓度转接至新的LB培养基中，培养2-4个小时，监测0D值达到 0. 4 0. 6时开始使用0. 5 2mmol/L IPTG诱导表达2到4小时，收集菌体，表达产物经 SDS-PAGE分析，筛选高表达的菌株，扫描分析发现表达量均在30%左右，且表达产物大部 分为包涵体。实施例2 融合蛋白的制备对筛选出的高表达菌株进行大规模的诱导表达，收集菌体后使用破菌液(10 50mmol/L TrisUO 100 u g/ml溶菌酶，pH8. 0 8. 5)悬浮菌体，室温搅拌20 60min， 现象为细胞破碎，核酸释放，菌液粘稠，然后使用超声细胞破碎仪冰浴破碎，离心后获得一 定量的包涵体，观察包涵体的状态。
使用包涵体的洗涤液(0.1 0. 5 % TritonX-lOOUO 50mmol/L Tris-HCl、 0. 1 5mmol/L EDTA，pH8. 0 8. 5)对其进行2_3次的洗涤、确保清洗干净，离心后收集包 涵体，使用(10 50mmol/L Tris-HCl,5 20mmol/L DTT、6mol/L 盐酸胍或 8mol/L 尿素， PH8.6)抽提液以1 5 1 40的体积进行变性抽提，离心后取上清，使用(10 50mmol/ L Tris-HCl、0. 01 0. 5mmol/L GSSG)的复性液以1 50 1 150的体积进行稀释复 性。然后将所得复性液进行超滤浓缩，调pH至8. 0 8. 5，使用10 50mmol/ LTris-Cl(pH8. 0)的平衡液平衡阴离子交换柱，上样。随后将穿过液的pH调节到4. 5，使用 10 50mmol/L NaAc-HAc, pH4. 0 4. 5的平衡液平衡阳离子交换柱，上样后再次平衡，再 使用0 lmol/L NaCl进行线性梯度洗脱，使其进一步的纯化浓缩。电泳检测获得的融和 蛋白纯度可达到95%以上。实施例3 融合蛋白的升血小板活性测定所有小鼠腹腔注射卡钼150mg/kg，即成血小板缺失模型。造模后1天，所有小鼠随 机分为3组，雌雄各半。给药组6只，腹腔注射50 yg IMT原液，连续14天；阳性药组6只， 腹腔注射1. lX104IU/kg市售TP0，连续14天；空白组8只，腹腔注射生理盐水0. 5ml，连续 14天。给药前所有小鼠采血，检测血小板数值。给药后3-4天采血一次，具体采血间隔视小 鼠状态决定，检测血小板数值。结果实验结果表明，如图3所示本发明构建的融合蛋白可以显著抑制注射卡帕的小 鼠外周血血小板的减少，显示出较强的升血小板活性。SEQUENCE LISTING(序列信息表)<110>哈药集团生物工程有限公司<120> 一种融合蛋白及其制备方法<130><160>7<210>1<211>14<212>RPT<213>Atificial<220><223>TMP氨基酸序列<400>1lie Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala1510<210>2<211>68<212>RPT<213>Atificial
<212>DNA0099]<213>Atificial0100]<220>0101]<223>编码TMP与胰岛素样生长因子融合蛋白_3的DNA序列0102]<400>50103]atgattgaaggtccgtatctgcgtcagtggttagccgcacgcgcgggttctggctctggc600104]actctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggtttc1200105]tacttcaacaaaccgactggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggtatc1800106]gttgacgaatgctgcttccgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgctccg2400107]ctgaaaccggctaaatctgctggttctggctctggcatcgagggcccgtacttacgccag3000108]tggctggcggctcgtgcctaa3210109]<210>60110]<211>3060111]<212>DNA0112]<213>Atificial0113]<220>0114]<223>编码TMP与胰岛素样生长因子融合蛋白_4的DNA序列0115]<400>60116]atgattgaaggtccgtatctgcgtcagtggttagccgcacgcgcgatcgagggcccgtac600117]ttacgccagtggctggcggctcgtgccggttctggctctggcactctgtgcggtgctgaa1200118]ctggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggtttctacttcaacaaaccgact1800119]ggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggtatcgttgacgaatgctgcttc2400120]cgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgctccgctgaaaccggctaaatct3000121]gcttaa3060122]<210>70123]<211>3060124]<212>DNA0125]<213>Atificial0126]<220>0127]<223>编码TMP与胰岛素样生长因子融合蛋白_5的DNA序列0128]<400>70129]atgactctgtgcggtgctgaactggttgatgctctgcagttcgtttgcggtgacagaggt600130]ttctacttcaacaaaccgactggttacggttctagcagccgtcgtgctccgcagactggt1200131]atcgttgacgaatgctgcttccgtagctgcgacctgcgtcgtctggaaatgtactgcgct1800132]ccgctgaaaccggctaaatctgctggttctggctctggcattgaaggtccgtatctgcgt2400133]cagtggttagccgcacgcgcgatcgagggcccgtacttacgccagtggctggcggctcgt3000134]gcctaa30权利要求
一种融合蛋白，其特征在于由血小板生成素模拟肽区(TMP)和胰岛素样生长因子IGF-I多肽区组成。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于TMP的氨基酸具有SEQID N0:1序 列；胰岛素样生长因子IGF-I多肽区具有SEQ ID NO 2序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于其连接方式可以为TMP-M-IGF、 IGF-M-TMP、TMP-M-IGF-M-TMP、TMP-TMP-M-IGF、IGF-M-TMP-TMP 中的任意一种。其中，TMP 代表血小板生成素模拟肽，IGF代表胰岛素样生长因子IGF-I，M代表连接肽。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于TMP和IGF-I多肽区之间设有连接肽 进行连接。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于连接肽为0到10个氨基酸组成的连 接肽，更优选0-5个氨基酸。
6.编码权利要求1-5所述融合蛋白的DNA序列，其具有SEQID NO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、或 SEQ ID NO :7 序列。
7.一种表达载体，其特征在于包含权利要求6所述的DNA序列的重组表达载体。
8.制备重组融合蛋白的方法，包括用权利要求7重组表达载体转化、转染或转导宿主 细胞，分离、纯化所述重组融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备重组融合表达蛋白的方法，其特征在于表达所用的宿 主为动物细胞、酵母、细菌，原核表达优选大肠杆菌。
10.权利要求1所述的融合蛋白用于制备治疗血小板减少症的药物的用途。
全文摘要
本发明提供了由血小板生成素模拟肽(TMP)和胰岛素样生长因子IGF-I组成的一种新型的融合蛋白以及这种融合蛋白的制备方法，本发明所提供的融合蛋白具有升高血小板的生物学活性。
文档编号C12N15/62GK101863982SQ20091007181
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者冷国庆, 刘贺煜, 姜媛媛, 孙磊, 朱红杰, 李会成, 李郑武, 王晴, 赵华南, 陈玉军 申请人:哈药集团生物工程有限公司