专利名称：：一株枯草芽孢杆菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。
背景技术：
：咪唑乙烟酸(imazethapyr)具有杀草谱广、选择性强、活性高等优点，是大豆田优良的除草剂，自从1993年德国巴斯夫公司普施特申请专利被中国驳回后，咪唑乙烟酸国产化，成本下降，用量大幅增加，在我国大豆产区得到大面积的推广和应用，年总用量平均在4000吨左右，应用面积达到4000多万亩以上，占大豆田除草剂面积的75%以上，至今因品种竞争和政策限制等因素田间用量有所下降，但它仍然是导致作物频频产生药害主要长残留性除草剂品种之一。但随着这一产品的在大豆田化学除草中的广泛应用，也暴露出一些问题和不足，如对恶性杂草的防除效果、土壤处理药效受环境条件制约、长残效对后作的安全性等问题(JourdanSW，MajekBA，AyeniAO.Imazethapyrbioactivityandmovementinsoil.WeedScience,1998，46(5):608-613;黄春燕，陈铁宝，王宇等.咪唑啉酮除草剂对后茬作物安全性研究初报.农药学学报，2001，3(2):29-34)。咪唑乙烟酸活性极高，且在土壤及水中降解缓慢，故微量残留可能伤害后茬敏感作物，世界各地有很多关于咪唑乙烟酸不同程度地对后茬敏感作物如高粱、水稻、甜菜、马铃薯及蔬菜等伤害的报道(窦玉敏，高卫东.土壤中残存咪唑乙烟酸对水稻生长影响.稻田植保，2000，3:22-23)。施药后12个月可以种植玉米、小麦，施药后24个月正常用量可以种植油菜、马铃薯，对甜菜和白菜仍有药害，36个月可种甜菜、油菜、亚麻、白瓜(朴英，傅迎春，胡凡等.金豆和普施特施药后对后作安全性的实验研究.中国农学通报，2002，18(6):52-54)。咪唑乙烟酸，通常不易挥发和水解，光解作用轻微，土壤对其吸附性差(GentileJ"M，RonekerKR，CroweSE，PondWG，LeiXG.Effectivenessofanexperimentalconsensusphytaseinimprovingdietaryphytate-phosphorusutilizationbyweanlingpigs.JAnimScience,2008，81(11):2751-2757)。我国北方地区的寒冷气候条件使土壤中长残效除草剂咪唑乙烟酸很难在短时间内降解，南方多季种植结构仍会造成除草剂的残留药害，不但影响农作物的耕作、换茬，而且严重影响种植结构的调整。因此如何解决长残效除草剂残留危害的问题，已成为当前保护土地资源与农业生态环境的重要课题s目前解决长残留除草剂危害的途径主要有开发除草剂新品种以代替现有长残留性除草剂，但由于对靶标酶的了解程度不够，加之开发一个农药新品种要投入资金数亿美元，所以难度很大；抗除草剂转基因作物品种的选育，需要投入大量的研究经费和人力，要经历较长的研究过程，距离实际应用还很遥远；利用一些化学物质即除草剂的解毒剂(保护剂)解除除草剂对作物产生的药害，但涉及到另外一种化学物质的投放于环境中，会造成二次污染的问题；利用源于土壤的微生物降解，才是真正能消除长残留除草剂污染的有效途径。
发明内容本发明的目的是一株枯草芽孢杆菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。本发明所提供的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(5^///^犯^/&)LPZCGMCC12772。所述枯草芽孢杆菌(Sa"7/M^6"fo)LPZCGMCCWs.2772黑龙江省哈尔滨地区长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤中分离得到。其平板菌落特征为表面光滑、隆起，边缘有褶皱，透明，在培养基呈白色。所述枯草芽孢杆菌(5ac/〃附^M&)LPZCGMCCJV2.2772，己于2008年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCW2.2772。本发明的枯草芽孢杆菌(^flc/〃船wto'to)LPZCGMCC地.2772来源于土样采自黑龙江省哈尔滨市长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤，可以在高浓度咪唑乙烟酸环境下生长，并且可以高效降解咪唑乙烟酸，为微生物降解长残留除草剂咪唑乙烟酸的研究提供了重要的基础，可用于受咪唑乙烟酸污染的水体、土壤的生物净化。图1为枯草芽孢杆菌(B""7/船w&ifc)LPZ在不同温度下对土壤中咪唑乙烟酸的降解效果图2为在不同温度下枯草芽孢杆菌(Sflc!7/ws犯to'fe)LPZ降解土壤中咪唑乙烟酸的半衰期图3为枯草芽孢杆菌(5""7/^犯^7&)LPZ在不同土壤湿度下对咪唑乙烟酸的降解效果图4为在不同土壤湿度下枯草芽孢杆菌(5"c///^w^/to)LPZ降解咪唑乙烟酸的半衰期图5为枯草芽孢杆菌(5"7/^犯^版)LPZ在不同类型土壤中对咪唑乙烟酸的4降解效果图6为在不同类型土壤中枯草芽孢杆菌(5a"7/M^^/fc)LPZ降解咪唑乙烟酸的半衰期具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、枯草芽孢杆菌(Bac"Zw"w&础s)LPZCGMCCN2.2772的分离、纯化及其鉴定1、枯草芽孢杆菌(Sflc/〃M犯Mfo)LPZCGMCCW.2772的分离及纯化1)采集样品土样采自黑龙江省哈尔滨市东北农业大学实验实习基地内长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤。2)菌体的富集和分离将长期施用长残留性除草剂咪唑乙烟酸的土壤样品混合均匀，称取10g加入到含有100mg'L—'咪唑乙烟酸的100mL富集培养液中，置于30。C，150rrain—1的摇床培养。7d后按10X的接种量取培养液将其移入含咪唑乙烟酸浓度为200mg丄"新鲜富集培养液中，继续培养7d;以后每隔一周均从上次的培养液中取出10mL加入到lOOmL新鲜富集培养液中，咪唑乙烟酸的浓度每次增加100mg丄"，直至增加到600mg丄—1，共富集培养6次；然后转入到无机盐培养基中进行筛选，共进行3次，培养基中咪唑乙烟酸的浓度分别为800、1000、1200mg'I/1。最后取样，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上按孢子形态、颜色进行单孢分离，挑出单菌株分别进行纯化培养并保存。上述的富集培养液组分及配比为牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;NaCl，5g/L;K2HP04，5g/L;PH7.0-7.2。上述的无机盐培养基组分及配比为KH2P04，1.70g/L;K2HPO"5.17g/L;(NH4)2S04，2.6g/L;盐溶液，10mL/L;PH7.0-7.2。其中盐溶液为含MgS04，19.5g/L;MnS04，5g/L;FeS04，5g/L;CaCl2，0.3g/L的溶液。上述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基组分及配比为牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;琼脂，18g/L，PH7.0-7.2。结果得到一株可在高浓度咪唑乙烟酸环境下生长的菌株，其在上述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，3(TC条件下生长的菌落表面光滑、隆起，边缘有褶铍，透明，在培养基上呈白色。2、将上述得到的菌株进行生理生化鉴定，结果其生理生化特征如表l所示。表lLPZ菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"+"表示生长或反应阳性；"-"表示不生长或反应阴性。LPZ菌株16SrDNA序列如序列表中序列1所示，经序列比对和上述生理生化特征鉴定，表明该菌株为枯草芽孢杆菌(^cz7/^wto7/s)，将其命名为LPZ。该枯草芽孢杆菌(Sa"7/^犯Mfc)LPZ，已于2008年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNq.2772。实施例2、枯草芽孢杆菌(^"7/附^^7^)LPZ对土壤中咪唑乙烟酸的降解1、枯草芽孢杆菌(Sac/Z/附^&//&)LPZ在不同温度下对咪唑乙烟酸的降解效果将枯草芽孢杆菌(5ac/〃wswto7^)LPZCGMCCNa.2772用牛肉膏蛋白胨培养液(含牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;PH7.0-7.2的培养液)在3(TC的条件下进行增殖培养，用于下述效果检测实验。在黑土(有机质含量3.557%，田间最大持水量37.5%，全氮0.195%，pH值7.12)中加入终浓度为100Wkg—i的咪唑乙烟酸，分成6份每份24kg，其中三份分别按照5Xl()8cfu/kg黑土的量接种枯草芽孢杆菌(J5ac/〃WHwto'fo)LPZCGMCCNs.2772，将该菌株与土壤混匀，调节土壤含水量为田间最大持水量的50%，然后分别置于20°C、25°C、3(TC恒温培养箱中放置作为三个实验组；另外三份土壤不接种任何菌，调节土壤含水量为田间最大持水量的50%，分别置于2(TC、25°C、3CTC恒温培养箱中放置作为三个空白对照组。各组分别在培养后的第l，7，15，30，45，60天后，测定土壤中各处理咪唑乙烟酸的残留量，计算各组处理咪唑乙烟酸的半衰期。各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图1所示，当温度为20°C、25°C、3(TC时，三个空白对照组于第60天测定各对照土壤中咪唑乙烟酸的残留量(图1中20°CCK、25°CCK、30°CCK)，分别为85.79pg.kg-1，81.35pg.kg-1和78.76吗'kg一1，而添加枯草芽孢杆菌(Bac/〃MSMZ^fc)lpzcgmccNq.2772后的三个处理组(图l中20。C处理、25°C处理、30°C处理)残留量分别为11.98，6.98和5.94吗'kg"，说明LPZ菌对黑土中咪唑乙烟酸具有很强的降解能力，并且温度为20。C3(TC的范围内降解效果好。各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图2所示，结果表明在2(TC、25°C、30°C条件下，咪唑乙烟酸在黑土中自然降解的半衰期(图2中CK)分别为301.37天，223.60天和198.04天，而在LPZ菌的作用下，20°C、25°C、30。C条件下(图2中处理)，其降解半衰期分别为19.64天、15.58天和15.30天。结果表明枯草芽孢杆菌(S""7/^sw&z7&)LPZCGMCCNa.2772能大幅度降低土壤中咪唑乙烟酸的半衰期，使土壤中咪唑乙烟酸快速降解，大大提高了咪唑乙烟酸的降解效率。2、枯草芽孢杆菌(5^///^^6"7&)LPZ在不同土壤湿度下对咪唑乙烟酸的降解效果在黑土(有机质含量3.557%，田间最大持水量37.5%，全氮0.195%,pH值7.12)中加入终浓度为10(￥g*kg—^勺咪唑乙烟酸，分成6份每份24kg，其中三份分别按照5Xl()Scfu/kg黑土的量接种枯草芽孢杆菌(5flc/〃wrato&)LPZCGMCCNs.2772，将该菌株与土壤混匀，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的37.5%、50%,62.5%，然后分别置于25°C恒温培养箱中放置作为3个菌处理组；另外3份土壤不接种任何菌，分别调节土壤含水量为田间最大持水量的37.5%、50%、62.5%，分别置于25°C恒温培养箱中放置作为3个空白对照组，分别在培养后的第l，7，15，30，45，60天7后，测定各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量，并计算各组处理咪唑乙烟酸的半衰期。各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图3所示，结果表明于第60天测定含水量为田间最大持水量的37.5%、50%、62.5%时的空白对照组土壤(图3中37.5%CK、50%CK、62.5%CK)中咪唑乙烟酸的残留量，分别为87.16pg'kg-，86.35吗'kg"禾口81.18pg.kg-1，而添加枯草芽孢杆菌(B"c/〃mhm^'fo)LPZCGMCC他.2772后含水量为田间最大持水量的37.5%、50%、62.5%时的菌处理组土壤(图3中37.5%处理、50%处理、62.5%处理)中咪唑乙烟酸的残留量，分别为残留量分别为18.82，8.16和7.25Hgkg—、说明枯草芽孢杆菌(5a函雄磁s)LPZCGMCCNq.2772在土壤湿度为50%62.5%的范围内，对黑土中咪唑乙烟酸具有很强的降解能力。各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图4所示，结果表明添加枯草芽孢杆菌(5ac/〃wm^"fc)LPZCGMCCNs.2772的含水量为田间最大持水量的37.5%、50%、62.5%的菌处理组土壤(图4中处理)中咪唑乙烟酸的降解半衰期分别为23.90天，17.20天和16.27天，而未加菌处理(空白对照组)(图4中CK)相应含水量的土壤中咪唑乙烟酸的降解半衰期分别为346.57天，330.07天和239.02天，说明LPZ菌株的降解效率很高，随着湿度增加，特别当含水量为田间最大持水量的50%—62.5%时其效果更加显著。3、枯草芽孢杆菌(5acz7/MwMfo)LPZ在不同类型土壤中对咪唑乙烟酸的降解效果在黑土(有机质含量3.557%,田间最大持水量37.5%，全氮0.195%,pH值7.12)、白浆土(有机质含量3.145%，田伺最大持水量35.6%，全氮0.176%，pH值5.43)、盐碱土(有机质含量2.984%，田间最大持水量39.8%，全氮0.149%,pH值8.24)3种土壤中分别添加咪唑乙烟酸使其终浓度为10(Hig.kg"，向土壤中按照5Xl()8cfu/kg土壤的量接种枯草芽孢杆菌(^ac/Z/m^Z^/^)LPZCGMCCNq.2772，将该菌株与土壤混匀，调节土壤含水量为田间最大持水量的50%，置于25t:恒温培养箱中培养，另设置不添加降解菌，其他条件均相同的三种土壤处理作为空白对照，记为CK。分别在培养后的第l，7，15，30，45，60天后，测定各处理咪唑乙烟酸的残留量和半衰期。各处理土壤中咪唑乙烟酸的残留量测量结果如图5所示，结果表明第60天黑土、白浆土、盐碱土空白对照(图5中黑土CK、白浆土CK、盐碱土CK)中咪唑乙烟酸的残留量，分别为81.06，83.55和80.64吗'kg—1，而添加LPZ菌后的黑土、白浆土、盐碱土处理组(图5中黑土处理、白浆土处理、盐碱土处理)咪唑乙烟酸残留量分别为5.98、10.49、6.12吗'kg'1，说明LPZ菌对三种土壤中的咪唑乙烟酸都具有很强的降解能力，其中对黑土和盐碱土中咪唑乙烟酸的降解效果略好于白浆土。各组处理咪唑乙烟酸的半衰期结果如图6所示，咪唑乙烟酸在黑土、白浆土、盐碱土中自然降解(图6中CK)的半衰期分别为203.87天，247.55天和210.04天，而枯草芽孢杆菌(Sflc/^m^/fc)LPZCGMCCN2.2772对黑土、白浆土、盐碱土三种土壤处理组(图6中处理)中咪唑乙烟酸降解的半衰期分别为14.62天，19.20天和15.61天，表明LPZ菌能够显著提高土壤咪唑乙烟酸的降解速度，且枯草芽孢杆菌(5fld〃Mwto'fo)LPZCGMCCNQ.2772在不同类型土壤中均表现出较强的降解能力。〈160〉1〈210〉1<211〉1434<212〉薩<213〉枯草芽孢杆菌(Sac/〃wHwZ^7&)<400〉1cttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctegtg60gtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccggg^egta^teaccgcggcatgctgatccgcg120attactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgegatcegaactgagaacei180gsUtgtgggattggctt^cctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagca240cgtgtgtagcccaggtcata鄉ggcatga"tgatttgacgtcatccccaccttcctccgg300"tttgtcaccggcagtcaccttagagtgccc犯ctgaatgctggcaactaagatcaagggt360tgcgctcgttgCgggaCtt￡Laccca^catetcacgacacgagctgacgac肌ccatgC3c420cacctgtcactctgcccccg卿gggacgtcctatctctaggattgtcaga_gg8tgtcas480gacctggtaaggttcttcgcgttgettegaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgg540gcccccgtxaattcctttgagtttcagtcttgcgaccg"tactccccaggcggagtgctta600atgcgttagctgcagcacta郷ggcgg^3CCCCCt犯Cacttsgc3ctcategtttae660ggcgtggactaccagggtatetaatxetgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtc720agttac3gaccag卿gtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctaegcatttea780ccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactxaagttccccagtttccaatgac840cctccccggttgagccgggggctttcacatcagactta^gaaaccgcctgcgagcccttt■acgcccaataattccggacaacgcttgccaectaegtattaccgcggctgctggcacgta960gttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaaeggtacttg1020ttcttccctaacaacagagctttacgatccga^accttcatcactcacgeggegttget1080ccgtxagactttcgtccattgcgga卿ttccctactgctgcctcccgtaggagtctggg1140ccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgcctt1200ggtgagccgttacctcacca;a<ctagct^tgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagcc1260gaagccaccttttatgtttgaaccatgeggttcaaacaaccatceggtattagccccggt1320ttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccg1380ct^acatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgceitgtsttagC3C143410权利要求1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LPZCGMCC№.2772。2、枯草芽孢杆菌(Bfl"7/wHwMfc)LPZCGMCCWe.2772在降解咪唑乙烟酸中的应用。3、枯草芽孢杆菌(5ad〃MHwWfc)LPZCGMCCWe.2772在生物净化受咪唑乙烟酸污染水体或土壤中的应用。全文摘要本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解咪唑乙烟酸中的应用。该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC№.2772。该菌株可以在高浓度咪唑乙烟酸环境下生长，并且可以高校降解咪唑乙烟酸，为微生物降解长残留除草剂咪唑乙烟酸的研究提供了重要的基础，可用于受咪唑乙烟酸污染的水体、土壤的生物净化。文档编号C12N1/20GK101463338SQ20091007622公开日2009年6月24日申请日期2009年1月6日优先权日2009年1月6日发明者刘亚光,庞福德,超马申请人:东北农业大学