专利名称：禽源启动子表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
真核表达载体是分子生物学研究中最常用的表达载体之一。目前最常用的是哺 乳动物源启动子的蛋白表达载体，可以在哺乳动物细胞高效表达蛋白。我国是养禽 业大国，养禽业的发展也促进了对禽类生产、疾病预防与控制等领域的研究，尤其 是抗病育种逐渐被提到日程上来。由于目前尚缺少禽源启动子的蛋白表达载体，难 以在禽类体内或细胞中进行高效表达外源基因。并且，目前使用的真核表达蛋白载
体构建表达外源基因的载体的过程是通过传统的连接方法连接的，通过T4DNA连接 酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤 比较烦琐，成本高，连接效率较低等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。
本发明所提供的禽源启动子表达载体，命名为pAPP-Vector,是一种环状载体， 包含原核复制起点、 一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外 源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号； 所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1-607位；所述连接 片段含有EcoRV识别序列。
其中，所述真核复制起点可为任何现已知的真核生物进行DNA复制的起始点， 具体可为SV40病毒复制起点。所述多聚腺苷酸加尾信号可为具有终止转录作用的 所有DNA片段，具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核复制起始 位点可为任何现已知的原核生物进行DNA复制的起始点，具体可为大肠杆菌质粒 CoIEl复制起始位点。
pAPP-Vector的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。
用EcoRV酶切所述禽源启动子表达载体得到的线性载体也属于本发明的保护 范围。
本发明的另一个目的是提供所述禽源启动子表达载体的构建方法。
4本发明所提供的所述禽源启动子表达载体的构建方法，包括如下步骤
1) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5' v4<^r67TCT7T<XT(%^Ca^r^^^^ 3'和5' fA47TO^(^6^Z4ra:7r6^6CATGCATCTAG 3'进行PCR扩增，得到片段A;
2) 以pCDNA3. 0质粒为模板，用如下引物5， Cmfi4M7TfgC7TCAGCACAC 3'和5' 6r0^7^"76^0;C46K4A^A4C4 7^7 3'进行PCR扩增，得到片段B;
3) 将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和 片段B连接，获得重组载体pA;
4) 以重组载体pA为模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC J，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG ，进行PCR扩增，得到片段D;
5) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC < ，或5，
CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC J， 进行PCR扩增，得到片段C;
6) 将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和 片段D连接，获得重组载体pAP-SV40;
7) 以REV病毒DNA为模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC
3，和5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3， 进行PCR扩增，得到片
段F;
8) 以重组载体pAP-SV40为模板，用如下引物5' TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，和5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，进行PCR扩增，得到片段E;
9) 将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和 片段F连接，得到所述的载体。
本发明所述禽源启动子表达载体可作为出发载体，构建在禽类细胞或哺乳动物 细胞中表达蛋白的重组表达载体。
以本发明的pAPP-Vector为出发载体构建的表达绿色荧光蛋白的重组表达载 体，可以在禽类细胞或哺乳动物细胞中高效表达绿色荧光蛋白。以pAPP-Vector为 出发载体利用同源重组构建重组表达载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个 构建过程中不使用内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接 的效率也较理想。使用本发明的pAPP-Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。将在转
基因动物研究中发挥重要作用。
图1为pAPP-Vector的结构示意图。 图2为荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达结果。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
实施例1、 pAPP-Vector的构建 1) pA的构建
设i十弓l物pA Vectorl上游禾口 pA Vectorl下f游、pA Vector2上訪,禾口 pA Vector2 下游，弓l物pA Vectorl上i游禾口 pA Vectorl下幼字、pA Vector2上幼,禾口 pA Vector2 下游的序列如下
pA Vectorl上游5' JC4r677nT7Ta^(^<X6t7^C^(^ 3，；
pA Vectorl下游5' fi^nC7^C4(24Z47r67r^6CATGCATCTAG 3'。
pA Vector2上游5' OT(S4■ m:AGCACAC 3'(划线部分为
EcoR V酶识别位点)；
pA Vector2下游5， 070^7^fO^(T(^6K4^6^4C47Z r 3'。
以pEGFP-Nl (Invitrogen)质粒为模板，用引物pA Vectorl上游和pA Vectorl
下游PCR扩增片段A;以pCDNA3. 0质粒为模板，用引物pA Vector2上游和pA Vector2
下游PCR扩增片段B。
PCR反应体系10XPCR Buffer 5HL，上游、下游引物各l叱，DNA模板1叱，
MgC12 (25mM) 3叱，dNTPs (各2. 5raM) 3叱，Pfu-Taq (5U/I40 0. 5A，最后补水至
50PL。
反应条件94。C热变性5min; 94。C变性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸6min， 共30个循环；72。C最后延伸10min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50pl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100 ng: 500 ng。混匀后体系冰浴30 min。 42"水浴热激90秒，然后冰上放置3 min，加入预 热的LB培养基900 nl，置于37。C下，180rpm振摇90 min，收集菌体，用LB液体
6培养基重悬菌体，取200 pl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37 。C培养 12 h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pA。
2) pAP-Vector的构建
设计引物SV (40)上游和SV (40)下游、pAP Vector (l)上游和pAP Vector (1)
下游，序列如下
SV (40)上游5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCCJ，；
SV (40)下游5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTCJ，。
pAP Vector (l)上游5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3，；
pAP Vector (l)下游5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3，。
以pEGFP-Nl质粒为模板，用引物SV (40)上游和SV (40)下游PCR扩增片段
C;以pA质粒为模板，用引物pAP Vector (1)上游和pAP Vector (l)下游PCR扩
增片段D。
PCR反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2 (25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3吣，Pfu-Taq(5 U/叱)0.5叱，最后补 水至50 PL。
反应条件94。C热变性5 min; 94。C变性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸6 min， 共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
5(^1感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng: 500ng。 混匀后体系冰浴30 min。 42。C水浴热激90秒，然后冰上放置3 min，加入预热的 LB培养基900 pl，置于37。C下，200 rpm振摇90 min，收集菌体，用LB液体培 养基重悬菌体，取200 pl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37i:培养16h。 挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pAP-SV40。
3) pAPP-Vector的构建
设计引物PAPP上游和PAPP下游、LTR上游和LTR下游，引物序列如下 pAPP上游5， TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，； pAPP下游5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，。 LTR上游5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3'; LTR下游5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3，。 以pAP-SV40质粒为模板，用引物pAPP上游和pAPP下游PCR扩增片段E;以REV病毒(Reticuloendotheliosis. In: Saif, Y. M. ， Barnes, J. ， Glisson， J.， Macdougal， L. ， Swayne， D. (Eds.) ， Diseases of Poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, pp. 517 - 535.)(中国农业大学)的DNA为模板，用引物LTR上游 和LTR下游PCR扩增片段F。
PCR反应体系10XPCR Buffer 5叱，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 raM) 3叱，dNTPs(各2.5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/WJ 0.5叱，最后补水 至50 HL。
反应条件94 。C热变性5 rain; 94 。C变性45 s， 53 。C退火45 s， 72 。C延伸 6 rain，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50pl感受态细胞中加入片段E和F后混匀，片段E和F质量比为100ng: 500ng。 混匀后体系冰浴30min。 42。C水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB 培养基90(^1，置于37。C下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重 悬菌体，取200pl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37。C培养12h。挑取单 克隆提取质粒，该载体命名为pAPP-vector, pAPP-vector图谱如图1所示。
挑取单克隆提取质粒，将pAPP-vector测序，测序结果表明，pAPP-vector的核 苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5'末端第1-607位为LTR启动子，自5 '末端第692-698位为EcoRV酶的识别序列，自5'末端第670-1023位为BGH Ploy A，，自5'末端第1024-1205位为SV40 Origin,自5'末端第1224-1843位为大 肠杆菌质粒CoIEl复制起始位点，自5'末端第1844-3001位为氨苄青霉素抗性基 因。序列1的自5'端第695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位 的核苷酸序列为能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。
实施例2、 pAPP-vector表达蛋白的能力
1)表达绿色荧光蛋白的pAPP-EGFP-Vector的构建
设计引物EGFP上游和EGFP下游，引物序列如下
EGFP上游GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG;
EGFP下游ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。
引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列为能与序列1的自5'端第 695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位的核苷酸序列发生同源重 组的序列。
8以pEGFP-Nl为模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR扩增EGFP基因片段。 反应体系10XPCR Buffer 5吣，上游、下游引物各1叱，DNA模板1叱，
MgCl2(25 raM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (511/叱)0.5叱，最后补水
至50 PL。
反应条件94 r热变性5 min; 94 。C变性45 s， 50 °(3退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30个循环；72 。C最后延伸10 min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
pAPP-Vector用EcorV内切酶酶切线性化，回收线性化的pAPP-Vector。
酶切体系如下
10XD bufferlO(il， BSA l|il， EcoR V 2 u 1 (20U PR0MEGA公司)，pAPP-Vector 50ul，补水至100nl， 37° C酶切过夜。
酶切产物在1XTAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收
试剂盒回收目的片段。
感受态细胞中加入线性化的pAPP-Vector和上述PCR扩增的EGFP基因片 段后混匀，线性化的pAPP-Vector和EGFP基因片段质量比为lOOng: 500ng。混匀 后体系冰浴30min。 42"C水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养 基900)al，置于37"下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌 体，取200(il重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37'C培养12h。挑取单克隆 提取质粒，该质粒命名为pAPP-EGFP-Vector。 2)绿色荧光蛋白的的检测
取10 ul lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)加入到250 ul的0PTI-MEMI 培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1;将5ug pAPP-EGFP-Vector质粒加入到250 ul的0PTI-MEMI培养基中，获得溶液2;将溶 液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500 ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液 3。
将鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)(北京实验动物研究中心)和293T细胞分别置 于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60。/。时将细胞用PBS洗涤两次，然后分别加入 溶液3， 37"C孵育5个小时，分别吸出溶液3，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继 续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。
以转染pAPP-Vector质粒的CEF细胞作为对照。荧光显微镜结果如图2所示，表明pAPP-EGFP-Vector转染后24小时的CEF细 胞和293T细胞有较强的荧光信号，而对照没有荧光，说明pAPP-EGFP-Vector质粒 可以在CEF细胞与293T表达绿色荧光蛋白。
图2中，A为pAPP-EGFP-Vector转染的293T细胞，B为pAPP-EGFP-Vector转 染的CEF细胞，C为对照。
上述实验结果说明，pAPP-Vector载体可作为出发载体，构建在禽类细胞或哺 乳动物细胞中表达蛋白的重组表达载体。<formula>formula see original document page 11</formula>attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 960
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 1020
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgatcc cgcccctaac tccgcccagt 1080
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 1140
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 1200
tgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gc犯aaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1260
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 1320
aagtcagagg tggcgaa^cc cgacaggact ataaagatac caggcgtttx cccctggaag 1380
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 1440
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 1500
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 1560
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 1620
agcagccact ggt犯cagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagt1:ctt 1680
gaagtggtgg cct犯ctacg gctacactag aagggLcagta tttggtatct gcgctctgct 1740
gaagccag"tt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 1800
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 1860
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 1920
agggatt"ttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 1980
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 2040
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 2100
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 2160
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 2220
cggaagggcc gagcgcag33 gtggtcctgc犯ctttatcc gcctccatcc agtctatt犯 2280
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 2340
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 2400
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 2460
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 2520
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 2580
tgagtactca acc犯gtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 2640
ggcgtcaata cgggatetata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 2700
aaaacgttct tcggggcgaa肌ctctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccag"ttcgat 2760
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttxacca gcgtttctgg 2820
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 2880
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttat"tgaagc atttatcagg gttattgtct 2940
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaagLaataaa caaatagggg ttccgcgcac 3000
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcca aaagcctagg cctcca犯犯agcctcctca 3060
1权利要求
1、一种环状载体，包含原核复制起点、一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号；所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述连接片段含有EcoRV识别序列。
2、 根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述真核复制起点为SV40病毒复 制起点。
3、 根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述多聚腺苷酸加尾信号为 牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
4、 根据权利要求3所述的载体，其特征在于所述原核复制起始位点为大肠杆菌质粒CoIEl复制起始位点。
5、 根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述载体的核苷酸序列为序列表 中的序列1。
6、 一种线性的载体，是用EcoRV酶切权利要求l至5中任一所述的载体得到的 线性载体。
7、 权利要求5所述载体的构建方法，包括如下步骤1) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5' ^^7^770T7ra^ar(^CZ4^6^ 3' 和5' 6^776T60fi4Z47trr0^6CATGCATCTAG 3'进行PCR扩增，得到片段A;2) 以pCDNA3. 0质粒为模板，用如下引物5' Cr6mW7TTgCUMTiXAGCACAC 3'和5' arr67^^7(%^< 6M6K4A4(X^<^7^r 3'进行PCR扩增，得到片段B;3) 将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片 段B连接，获得重组载体pA;4) 以重组载体pA为模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC < ，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG < ，进行PCR扩增，得到片段D;5) 以pEGFP-Nl质粒为模板，用如下引物5' GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC T或5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC ， 进行PCR扩增，得到片段C;6) 将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片 段D连接，获得重组载体pAP-SV40;7) 以REV病毒DNA为模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3，和5，CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3 ， 进行PCR扩增，得到片段F;8) 以重组载体pAP-SV40为模板，用如下引物5'TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3,和5，GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC 3，进行PCR扩增，得到片段E;9) 将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，得到权利要求5中所述的载体。
8、权利要求1至5中任一所述的载体在禽类细胞或哺乳动物细胞中表达蛋白的应用。
全文摘要
本发明公开了一种禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。该禽源启动子表达载体是一种环状载体，包含原核复制起点、一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号；所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述连接片段含有EcoRV识别序列。使用本发明的pAPP-Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。将在转基因动物研究中发挥重要作用。
文档编号C12N15/63GK101481703SQ20091007638
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者傅光华, 刘芹防, 刘金华, 毕玉海, 娟 蒲, 马婧姣 申请人:中国农业大学