专利名称：一种混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种丁酸生物发酵法制备的方法，具体地说涉及一种混菌 发酵木质纤维素制备丁酸的方法。
背景技术：
丁酸广泛应用于食品、化工和制药工业。丁酸酯可作为食品添加剂增 加食品香味，高纯度丁酸用于乳制品工业中增加乳制品风味。p-羟基丁酸 可用于生产可降解的聚P-羟基丁酸。丁酸在治疗血液病、癌症、以及胃肠 道疾病的功效已经得到广泛认可。
丁酸主要以石油为原料通过化工法进行生产。但是随着人们对食品、 药品安全性和绿色化学品的要求逐年提高，化工法合成的丁酸已经很难进 入食品和药品行业，这使得生物发酵法合成丁酸开始受到重视。
在发酵法生产丁酸的流程中，原料费用占据了成本的一大部分。因此， 使用来源广泛、价格低廉的木质纤维素作为原料进行丁酸的发酵生产可大 幅度降低生产成本，并且有更好的商业前景。
.以木质纤维素为原料进行丁酸的制备工艺中，有几个瓶颈制约着该项 技术的应用
其一，商业化纤维素酶价格昂贵，降低了产品的价格竞争性。
其二，对于己糖和戊糖，菌种仅能利用其中一种；或者只能先后利用
而无法实现的同步利用。造成原料浪费，并且延长了发酵时长，增加了产
品成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种高温条件下混菌发酵木质纤维素制备丁酸 的方法，消除或大幅度降低纤维素酶的成本，并实现戊糖和己糖的同步发 酵，完成丁酸的高温混菌发酵制备过程。
3本发明所采用菌种分别为热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌，并以梭菌培养基 为基础，配制种子培养基；以预处理植物秸秆为原料，添加氮源和无机盐， 配制发酵培养基，其主要步骤如下
A、 将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌接种于固体培养基，进行厌氧培养；
B、 将步骤A培养的热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌分别接种于液体种子培 养基，进行厌氧培养；
C、 将步骤B中的热纤梭菌种子培养基加入发酵培养基，进行厌氧液 态发酵；
D、 将步骤B中的嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，混合均匀， 进行高温混菌厌氧发酵，制备丁酸。
本发明采用木质纤维素为原料，大幅降低原料成本；利用热纤梭菌生 产纤维素酶，避免商业酶制剂带来的高昂成本；利用嗜热丁酸梭菌与热纤
梭菌协作，降低中间产物对纤维素酶活性的抑制，并实现戊糖和己糖的同 步发酵。本发明使用农业废弃秸秆为原料进行丁酸的生物发酵法制备，对 资源的再生利用及无污染新能源的研究都具有重要意义。
具体实施例方式
具体地说，本发明提供的一种高温条件下混菌发酵木质纤维素制备丁 酸的方法如下
1) 采用的菌种
热纤梭菌(Clostridium thermocellum) 嗜热丁酸梭菌(Clostridiumthermobutyricum)
2) 采用液体梭菌培养基，在此基础上配制种子培养基。其培养基配 制为
在1L培养基中加入1.3g(NH4)2SO4，2.60gMgCl2.6H2O， 1.43gKH2P04， 7.2gK2HP04.3H20， 0.13g CaCl2.2H20， 6g甘油磷酸钠，llmgFeCl2.7H20，
5g酵母提取物，10g糖类(热纤梭菌-结晶纤维素，嗜热丁酸梭菌-葡萄糖)， lmg刃天青，O.lg半胱氨酸。pH调整至6.5-7.2，通入N2:H2:CO2=80:5:15
以保持培养基厌氧状态，12rC灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均 在厌氧工作站进行操作。培养基
秸秆预处理产物60g/l，添加微量氮源和无机盐等物质。pH调整至
6.8-7.2。
4) 将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌接种于固体培养基，进行厌氧培养； 热纤梭菌培养温度55-60°C，培养时间120-168小时，嗜热丁酸梭菌培养 温度55。C，培养时间24小时。
5) 将步骤4培养的两株菌分别接种于20-50ml液体种子培养基，进 行厌氧培养；热纤梭菌培养温度55-60°C，培养时间120-168小时，嗜热 丁酸梭菌培养温度55°C ，培养时间24小时。
6) 将发酵培养基装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将步骤2中热 纤梭菌种子培养基加入发酵罐中，进行厌氧液态发酵，间隔一段时间后， 将步骤2中嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，两株菌的种子液的加 入量为总加入量的5-10%，两菌种加入比例为1-3:1-3，发酵温度55°C， 时间3-7天。
7) 采用HPLC法测定丁酸含量。 下面结合实施例对本方明的方法作更进一步的说明。 实施例1
1、 配制种子培养基
在梭菌培养基基础上配制液体种子培养基，具体组成如下 在1L培养基中加入1.3g(NH4)2SO4，2.60gMgCl2.6H2O， 1.43gKH2P04， 7.2gK2HP04.3H20， 0.13g CaCl2.2 H20， 6g甘油磷酸钠，llmg FeCl2.7H20， 5g酵母提取物，lOg糖类(热纤梭菌-结晶纤维素，嗜热丁酸梭菌-葡萄糖)， lmg刃天青，O.lg半胱氨酸。pH调整至7.0，通入N2:H2:CO尸80:5:15以 保持培养基厌氧状态，12rC灭菌20分钟。培养基配制，接种，取样均在 厌氧工作站进行操作。
2、 配制发酵培养基，酸处理后秸秆60g，尿素5g， KH2P04 lg， K2HP04 lg，水1000ml， pH7.2。
3、 发酵工艺
(1)将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌分别接种于固体斜面培养基，进行 厌氧培养；热纤梭菌培养温度6(TC，培养时间168小时；嗜热丁酸梭菌培
5养温度55。C，培养时间24小时。
(2) 将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌分别接种于50ml和20ml的液体种 子培养基，进行厌氧培养；热纤梭菌培养温度6(TC，培养时间120小时； 嗜热丁酸梭菌培养温度55°C ，培养时间24小时。
(3) 将发酵培养基1000ml装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将热 纤梭菌种子培养基加入发酵罐中，接种量5%，进行厌氧液态发酵，24小 时后，将嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，接种量为5%，发酵温 度55。C，时间3天。每个6小时取样一次，测定丁酸浓度。
(4) 釆用HPLC法测定丁酸含量，以0.05M H2S04为流动相，进样 速度0.6ml/分钟，进样量15^1，测定丁酸浓度。连续发酵72小时，丁酸 终浓度为16.4g/l。
种子培养基配制同实施例1。
发酵培养基配制，氨气爆秸秆60g，尿素5g， KH2P04 lg， K2HP04 lg， 水1000ml， pH7.2。
将发酵培养基1000ml装入发酵罐中，12rC灭菌20分钟。将热纤梭 菌种子培养基加入发酵罐中，接种量10%，进行厌氧液态发酵，24小时后， 将嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，接种量为10%，发酵温度55'C， 发酵时间3天。每个6小时取样一次，测定丁酸浓度。
检测丁酸浓度的方法如实施例1。连续发酵72小时，丁酸终浓度为 15.8g/l。
权利要求
1、一种混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，采用热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌，并以梭菌培养基为基础，配制种子培养基；以预处理植物秸秆为原料，添加氮源和无机盐，配制发酵培养基；其主要步骤如下A、将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌接种于固体培养基，进行厌氧培养；B、将步骤A培养的热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌分别接种于液体种子培养基，进行厌氧培养；C、将步骤B中的热纤梭菌种子培养基加入发酵培养基，进行厌氧液态发酵；D、将步骤B中的嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，混合均匀，进行高温混菌厌氧发酵，制备丁酸。
2、 根据权利要求1所述的混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其 中，步骤A中厌氧培养条件为热纤梭菌培养温度50-65°C，培养时间 120-168小时；嗜热丁酸梭菌培养温度50-6(TC，培养时间12-24小时。
3、 根据权利要求1所述的混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其 中，步骤B中接种的液体种子培养基的体积为20-50ml;厌氧培养条件为 培养温度50-6(TC，热纤梭菌培养时间120-168小时，嗜热丁酸梭菌培养 时间12-24小时。
4、 根据权利要求1所述的混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其 中，步骤C中热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌的种子液的加入量为总加入量的 5-10%，两菌种加入比例为1-3:1-3,发酵温度50-60。C，时间3-7天。
5、 根据权利要求1所述的混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，其 中，步骤D进行发酵后，采用HPLC方法测定丁酸含量。
全文摘要
一种混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法，采用热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌，并以梭菌培养基为基础，配制种子培养基；以预处理植物秸秆为原料，添加氮源和无机盐，配制发酵培养基；其主要步骤如下A.将热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌接种于固体培养基，进行厌氧培养；B.将步骤A培养的热纤梭菌和嗜热丁酸梭菌分别接种于液体种子培养基，进行厌氧培养；C.将步骤B中的热纤梭菌种子培养基加入发酵培养基，进行厌氧液态发酵；D.将步骤B中的嗜热丁酸梭菌种子培养基加入发酵罐中，混合均匀，进行高温混菌厌氧发酵，制备丁酸。
文档编号C12P7/40GK101475967SQ20091007695
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者张春辉, 张跃冬, 华 杨, 杨芳晓, 马玉久 申请人:青岛生物能源与过程研究所