专利名称：：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖呼吸综合征病毒引起的，是以怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪和育肥猪的呼吸道疾病为主要症状的传染病。该病1987年首次在美国报道，此后在加拿大、德国、西班牙、英国也相继报道了该病的发生。1995年，我国大陆发现了此病，且在多个省份开始流行。随后在19%年和1997年相继从疑似的病例中分离到了该病病源。2006年我国东南部省区相继爆发了严重高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染，数以万计的猪迅速死亡。通过病源分离与鉴定，确定是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染造成的。高致病性病毒感染的特点是猪只发病快、疾病传播迅速、对养猪业危害极大。经过序列比对发现，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与经典的猪繁殖与呼吸综合征病毒在基因组0RF1的Nsp2区出现了变异。猪繁殖呼吸综合征病毒的现有检测方法很多，但是能直接检测高致病性猪繁殖呼吸综合征病毒的方法却很少。现在报道的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)等和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。但是这些方法有耗时、操作复杂、所需仪器试剂较昂贵等缺点，不适合于进行田间快速诊断。
发明内容本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术的快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂本发明提供了检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla区域的内侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla区域的外侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla区域的环形引物对。4具体来说，所述专用引物中，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的内侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的外侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的环形引物对。更具体来说，所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒是含有所述专用引物的试剂盒。本发明中三对引物针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionN咖berEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)，为国内分离的高致病性猪繁殖呼吸综合征病毒的变异区域。该高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。所述内侧引物对包拮上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核昔酸序列是序列表中的序列5;所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。所述试剂盒还可包括环介导等温扩增试剂和检样管。所述检样管为含FTA卡片的离心管。所述试剂盒和可包括阳性对照和阴性对照。所述阳性对照可为FTA卡片上黏附了如下核酸序列或粘附了含有如下核酸序列的质粒的检样管高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2区部分序列)。所述环介导等温扩增试剂具体可为含有如下溶质的水溶液Tris-HCl、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜碱、钙黄绿素、MnCl2、脱氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反转录酶。在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23nL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下Tris-HCl0.5umo1、KC10.25nmol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2-20urao1、甜菜碱20umo1、药黄绿素0.00125"mol、MnCl20.015nmol、4种脱氧核苷酸各0.035ymol、BstDNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06umol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008ymol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23pL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量优选如下Tris-HC10.5ymol、KC10.25umol、(NH4)2S040.25nmol、Tween200.025iiL、MgS040.2umo1、甜菜碱20umol、f丐黄绿素0.00125pmol、MnCl20.015umol、4种脱氧核苷酸各0.035umo1、BstDNA聚合酶16U、細V反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04umo1，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004umol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02umol。本发明还提供了一种检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤用所述的专用引物或所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为60-65°C、20-90分钟。所述检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与力乎吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-9(TC反应2-10分钟的步骤。应用本发明提供的试剂盒检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，可以通过直接检视判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。直接检视方法为装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检测样品的检样管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检测样品的检样管有亮绿色可见荧光，则说明样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒具体可为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株。所述专用引物在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用与属于本发明的保护范围。本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的检测原理如下根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(N印2区部分序列)(序列表的序列1)设计了一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(2701-3150)部分序列变异区域的八个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的特异性。F3:SEQIDN02:CCTTTGAGTGGGTCAGCAC(序列表的序列2);B3:SEQIDNO3:GTGCAGGGTTGGTGTCATT(序列表的序列3);FIP:SEQIDNO4:GCAGACAAATCCAGAGGCTC竹TTAGTTCCTGGACCGCGTAGA(序列表的序列4);BIP:SEQIDNO5:CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC(序列表的序列5);LF:SEQIDN06:CTGGTGCGTCAGCGTTG(序列表的序列6);LB:SEQIDN07:ATGGGCATCCTG(M恥eG(序列表的序列7)。所述的引物组与所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2区部分序列)上8个特定区域结合，见表l表l引物组与N印2区部分序列的结合区域<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述引物组在AMV反转录酶和具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下(1)反转录阶段在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录为cDNA。(2)循环起始阶段一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。(3)反应循环阶段内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎坏DNA的盞长度成倍增长。进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贞。应用本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒进行检测，特异性高且灵敏度高，可检测出IO个拷贝的目的脂A。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果通过观察可见荧光即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明提供的试剂盒检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒可包括如下步骤(1)样本的处理①待测样本—取待测血液样本lOy1滴加于检样管内的FTA卡(Whatman,CatNo.WB120205)上，室温放置10min后，用移液管将血液吸出，留下纸片。加入200ixlddH20，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH20全部吸出，即得。②阴性对照用10u1双蒸水代替待测血液样本，滴加于检样管内FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将液体吸出，留下纸片。加入200ulddH20，在室温下放置5分钟。用移液管将管内用过的ddH20全部吸出，即得。(2)环介导的等温扩增①向检样管中加入23u1的LAMP反应液(2mm的FTA卡在反应体系中视为2ti1);②于水浴锅或金属恒温加热器上60-65'C放置20-90分钟，取出。在步骤②完成后，取出前，还可以再调水浴锅温度到80-9(TC反应g-IO分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。(3)结果判定可以通过直接检视判断样本是杏含有高致病性猪繁殖与呼咴综合征病毒。装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检测样品的检样管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性；如果装有待检测样品的检样管有亮绿色可见荧光，则说明样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。实施例l、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备一、引物的合成人工合成以下3对引物F3:CCTTTGAGTGGGTCAGCAC;B3:GTGCAGGGTTGGTGTCATT;FIP:GCAGACAAATCCAGAGGCTCTTTTAGTTCCTGCACCGCGTAGA;BIP:CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC;LF:CTGGTGCGTCAGCGTTG;LB:ATGGGCATCCTGGAGGCG。二、检样管的制备用2.0mm打孔取样器从空白的FTA卡(Whatman,CatNo.WB120205)上取下直径2.0mm的小圆片，置一0.25ml离心管底部。三、阳性对照的制备生长良好的Marc-145细胞(中国兽医药品监察所)长成单层后，用Hank's液(pH7.4)洗涤2次，接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒即B1株(农业部兽医诊断中心)，37。C吸附1h，加含1%犊牛血清的MEM营养液继续培养，待CPE达70%左右时收获病毒液，取10微升病毒液，参照Invitrogen公司TRIZOL试剂盒提取RNA，加至检样管内的FTA卡上。室温放置10min后，用移液管将血液吸出；留下纸片。加入200ylddH20，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH20全部吸出。病毒RNA即黏附在处理过的FTA圆片上。得到阳性对照，-20~-4"保存备用。四、配制LAMP反应液每23yLLAMP反应液，含有以下组分0.5umo1Tris-HC1、0.25umo1KC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025uLTween20、0.2umolMgS04、20umol甜菜碱(Betaine)、0.00125umol钙黄绿素、0.015nraolMnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04umol上游内侧引物(FIP)、0.04umol下游内侧引物(BIP)、0.004umol上游外侧引物(F3)、0.004umol下游外侧引物(B3)、0.02nmol上游环形引物(LF)、0.02umol下游环形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。五、试剂盒的组装该试剂盒由以下物质组成步骤四配制的LAMP反应液、步骤三制备的阳性对照和步骤二制备的检样管若干支。实施例2、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备一、引物的合成同实施例1的步骤一。二、检样管的制备同实施例1的步骤二。三、阳性对照的制备同实施例1的步骤三。四、配制LAMP反应液每23uLLAMP反应液，含有以下组分0.5urao1Tris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025uLTween20、20umolMgS04、20umol甜菜石咸(Betaine)、0.00125uraol,丐黄绿素、0.015umolMnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035圃1、0.06wmo1上游内侧引物(FIP)、0.06wmo1下游内侧引物(BIP)、0.008umo1上游外侧引物(F3)、0.008ytnol下游外侧引物(B3)、0.04nmol上游环形引物(LF)、0.04umo1下游环形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。五、试剂盒的组装同实施例1的步骤五。实施例3、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备一、引物的合成同实施例1的步骤一。二、检样管的制备同实施例1的步骤二。三、阳性对照的制备同实施例1的步骤三。四、配制LAMP反应液每23uLLAMP反应液，含有以下组分0.5umo1Tris-HC1、0.25nmolKC1、0.25umol(NH4)2S04、0.025yLTween20、10umolMgS04、20umol甜菜碱(Betaine)、0.00125umol钙黄绿素、0.015ymolMnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05umol上游内侧引物(FIP)、0.05nmol下游内侧引物(BIP)、0.006umol上游外侧引物(F3)、0.006umol下游外侧引物(B3)、0.03ymol上游环形引物(LF)、0.03umol下游环形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。五、试剂盒的组装同实施例1的步骤五。实施例4、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用取两头猪，l只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，l只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例l制备的试剂盒对样本进行检测。一、样本的处理'1、待测样本取待测血液样本10ul滴加于检样管内的FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将血液吸出，留下纸片。加入200ulddH20，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH20全部吸出，即得。采用病猪血样进行上述处理，得到三支含有病猪血样的检样管。采用健康猪血样进行上述处理，得到三支含有健康猪血样的检样管。2、阴性对照用10ia双蒸水代替待测血液样本，滴加于检样管内FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将液体吸出，留下纸片。加入200ulddH20，在室温下放置5分钟。用移液管将管内用过的ddH20全部吸出，即得。二、环介导等温扩增在每支含有病猪血样的检样管中加入23u丄的LAMP反应液，作为检测组l;在每支含有健康猪血样的检样管中加入23nL的LAMP反应液，作为检测组2;取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23yL的LAMP反应液。上述检样管同时在水浴锅上6(TC放置90分钟，取出。三、检视装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。实施例5、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用取两头猪，l只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，l只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例3制备的试剂盒对样本进行检测。一、样本的处理同实施例4的步骤一。二、环介导等温扩增在每支含有病猪血样的检样管中加入23uL的LAMP反应液，作为检测组l;在每支含有健康猪血样的检样管中加入23uL的LAMP反应液，作为检测组2;取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23yL的LAMP反应液。上述检样管同时在金属浴锅上65r放置70分钟，取出。三、检视装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。实施例6、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用取两头猪，l只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，l只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。一、样本的处理同实施例4的步骤一。二、环介导等温扩增在每支含有病猪血样的检样管中加入23yL的LAMP反应液，作为检测组l;在每支含有健康猪血样的检样管中加入23uL的LAMP反应液，作为检测组2;取阳性对上述检样管同时在水浴锅上6(TC放置50分钟，取出。三、检视装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。实施例7、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用取两头猪，l只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，l只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例l制备的试剂盒对样本进行检测。一、样本的处理同实施例4的步骤一。二、环介导等温扩增在每支含有病猪血样的检样管中加入23yL的LAMP反应液，作为检测组1;在每支含有健康猪血样的检样管中加入23uL的LAMP反应液，作为检测组2;取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23uL的LAMP反应液。上述检样管同时在水浴锅上65"放置30分钟，调水浴锅温度到80。C反应10min,取出。三、检视装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光,液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，死猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。实施例8、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用取两头猪，l只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，l只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。一、样本的处理同实施例4的步骤一。二、环介导等温扩增在每支含有病猪血样的检样管中加入23uL的LAMP反应液，作为检测组1;在每支含有健康猪血样的检样管中加入23nL的LAMP反应液，作为检测组2;取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23pL的LAMP反应液。上述检样管同时在水浴锅上6(TC放置20分钟，调水浴锅温度到9(TC反应2min，取出。三、检视装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，死猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。实施例9、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒灵敏度的检测制备O.5Xl(T拷贝/uL、0.5X103拷贝/uL、0.5X102拷贝/uL、5拷贝/uL和0.5拷贝/uL携带GenBankAccessionNumberEF075945中ORFla区域的Nsp2区部分序列的质粒样本。采用实施例3制备的试剂盒对质粒样本进行检测。■庄企AiVi止ilA7、w线口、j巾!j货提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株(农业部兽医诊断中心)的RNA,反转录得到DNA，根据PCR方法扩增得到病毒基因组GenBankAccessionNumberEF075945中0RFla区域0RF1的Nsp2区部分序列(见序列表的序列1)。再与T载体连接后即形成所需要的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的Nsp2区部分序列。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯化质粒。得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即0.5乂104拷贝/yL、0.5Xl(f拷贝/iiL、0.5Xl()2拷贝/iiL、5拷贝/uL禾卩0.5拷贝/uL。检测时加入各浓度质粒2uL，每个反应中对应含有104拷贝/iiL、103拷贝/uL、102拷贝/pL、10拷贝/uL、l拷贝/yL的质粒样本。(可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为巿面可购买的。)二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下(1)环介导等温扩增取步骤一得到O.5X104、0.5X103、0.5Xl()2拷贝/iiL、5拷贝/uL禾口0.5拷贝/pL拷贝/iiL的质粒样本各2uL，分别加至3支检样管中，每管再加入23nL的L細P反应液，分别作为检测组l、2、3、4和5;用相同体积的灭菌双蒸水代替15质粒样本同法制备阴性对照；另取3支阳性对照，加入23uL的LAMP反应液。上述检样管同时在水浴锅上65'C放置50分钟，调水浴锅温度到8(TC反应10min，取出。(2)直接检视结果表明，阳性对照组的三个检样管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个检样管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个检样管均为棕黄色无荧光液体。<110>中国农业大学〈120〉高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用<130〉CGGNARY92072〈160>7<210〉1<211〉450<212〉薩<213>高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株(PorcinerespiratoryandreproductivesyndromevirusstrainHUBl)<210〉2<211〉19<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2cctttgagtgggtcagcac19〈210〉3〈211〉19〈212〉DNA〈400〉gctccgcgcacctaacggttatgacacctaacacctttgaacgcaccaggcccctagcacgtcctgagtgagctccctgtggaaggtcagatccgattgccgga卿aactgtcggtggttgagtgagcccgtacttgtggtgggtcagcaccagttcctatgagcctctggatttgtctcgtcgcagaacatgggcatcaaatctcggatatactaaatcaagtgttaagatcacacgcggcagcccggttttgatgggcgacaatgtccccctcaattttccgacaccatccgagccgcccgcgtcgcgacgtgtccccaagctgatggcaccgcgtagaactgtgaicaacaacgctggcgtcctcacagacggaatatgaggctttcctgg邓gcgggggggca卿agctgagg肌gacaccaaccctgcacctgtgtcatcaagc60120180240300360420450〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉3gtgcagggttggtgtcatt<210>4<211〉43<212>醒〈213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉4gcagacaaatccagaggctcttttagttcctgcaccgcgtaga43<210〉5<211>44〈212〉廳<213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉5cctagcaccgtcgcagaacatttttcactcaggacttcctcage<210〉<211><212><213〉617DNA人工序列<220〉〈223〉〈400>6ctggtgcgtcagcgttg〈210>7<211>18<212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉7atgggcatcctggaggcg说明书第16/16页171819权利要求1、检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a区域的内侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a区域的外侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a区域的环形引物对。2、如权利要求l所述的专用引物，其特征在于所述专用引物中，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域的内侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域的外侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中自5'末端第2701至3150位核苷酸区域的环形引物对。3、如权利要求2所述的专用引物，其特征在于所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。4、含有权利要求1至3中任一所述专用引物的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒。5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂和检样管；所述检样管为含FTA卡片的离心管。6、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述环介导等温扩增试剂为含有如下溶质的水溶液Tris-HC1、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜碱、钙黄绿素、MnCl2、脱氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反转录酶。7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液;每23uL所述环介导等温扩增反应液中，含有如下溶质Tris-HCl0.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2-20umo1、甜菜碱20umo1、,丐黄绿素0.00125umol、MnCl20.015timo1、4种脱氧核苷酸各0.035umo1、BstDNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06umo1，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008ymol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23!iL所述环介导等温扩增反应液中，优选含有如下溶质Tris-HCl0.5nmol、KC10.25mol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2umol、甜菜碱20wraol、钙黄绿素0.00125umol、MnCl20.015umol、4种脱氧核苷酸各0.035umol、BstDM聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04师l，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004ymol,所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02umol。8、一种检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤用权利要求1至3中任一所述的专用引物或权利要求4至7中任一所述的试剂盒对来fi死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为60-65°C、20-90分钟。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于所述检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-9(TC反应2-10分钟的步骤。10、权利要求1至3中任一所述专用引物在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用。全文摘要本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供了检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中0RF1a区域的内侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a区域的外侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccessionNumberEF075945中ORF1a区域的环形引物对。本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒是包括所述专用引物的试剂盒。本发明的试剂盒，检测灵敏度高，10个拷贝即可检测出目的RNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。文档编号C12Q1/68GK101525671SQ20091007805公开日2009年9月9日申请日期2009年2月11日优先权日2009年2月11日发明者萍付,吴文学,张跃伟申请人:中国农业大学