专利名称：基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法
技术领域：
本发明涉及基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是一项基因沉默新技术，自20世纪 90年代被发现以来，已被广泛应用到动植物功能基因组研究及医学研究当中，现在 已逐渐成为分子生物学和细胞生物学研究的有用工具之一。
基因工程育种是分子育种的重要内容，也是未来育种的趋势。基因工程中利用 大都是显性抗病基因，至今尚未有通过基因工程手段利用隐性抗病基因仅改变植物 抗性但不影响植物其它农艺性状的报道。这是由于在植物转基因过程中很少发生同 源重组，因此通过基因工程手段将来源于植物的隐性抗病基因导入植物后，在转基 因植株中由于显性基因的存在而不能获得抗病效果，另外大多数隐性抗病基因不仅 参与了抗病，还在植物的生长发育过程起着重要的作用，Chu等通过RNAi (RNA Interference)的方法验证水稻白叶枯病隐性;ra^A 基因的功能时发现，转基因水 稻的产量随着M"表达量的降低而减少，水稻基因；ra5编码一个基本转录因子 7F/W y的隐性抗病基因，通过RNAi方法抑制与《a5等位的显性感病基因Xa5的 表达，可能影响水稻的生长发育和产量。因此， 一种能通过基因工程手段利用隐性 抗病基因只改良水稻抗性，不影响水稻其他农艺性状的方法不仅具有重要的理论意 义，也为改良水稻抗性提供更多可利用的抗源和途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。
本发明在基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法是通过构建培育 抗病植物的DNA分子来实现的。
所述培育抗病植物的DNA分子包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所 述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止 子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、 B和C三个片段依次连接组成，所述A片 段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子， 所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且没有与A或C片段的任一段连续
19bp的互补区。
其中，所述RNA干扰表达盒和所述人工改造基因表达盒的转录方向最好相反。 启动子和终止子没有特别的要求，能在真核生物中具有启动外源基因表达的启 动子均可，当然如果针对单子叶植物可优先选择玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子。
上述目的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。针对该目的蛋白，所述A片 段的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述人工改造的目的基因为序列表中 的序列2。
所述B片段没有特别的限制，可以选择多种植物基因的内含子，如Race intron， 其核苷酸序列为序列表中的序列3。
含有所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范 围。所述重组表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的DNA分子。
所述的DNA分子和所述的重组表达载体可用来培育抗病植物。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗病植物的方法。
本发明所提供的培育抗病植物的方法，是将所述的DNA分子导入植物中获得抗 病植物。
其中，所述植物可为水稻，所述抗病植物可为抗白叶枯菌的水稻。
本发明的培育抗病植物的DNA分子可构建到植物表达载体中导入植物中，获得 抗病的植物。将本发明的培育抗病植物的DNA分子转入水稻台北309中，获得的转 基因株系，在成株期对白叶枯菌株P1具有高度抗性，同时其结实率不会受到影响， 说明利用本发明的DNA分子培育能调控水稻隐性基因改良水稻白叶枯的抗性， 同时不影响水稻其他农艺性状的，获得抗白叶枯菌且高产的水稻新品种，对农业生 产具有重要意义。
图1为PXa5RNAi-xa5M载体图谱。
图2为转pXa5,-xa5M载体水稻的分子检测。
图3为转pXa5,-xa5M载体水稻抗白叶枯菌。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
一、转基因载体的构建
1) 显性RNAi片段序列的获得
以水稻品种IR24 (国际水稻所)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录 成cDNA。以此cDNA为模板，以Xa5RNAiF(5' GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG3') 和Xa5RNAiR(5， GGAGCTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG3')为引物，PCR扩增显性Ja5 的RNAi片段(Xa5RNAi)。
PCR反应条件先94。C预变性4min;然后94。C变性45S; 55。C退火45S; 72°C 延30min，共29个循环；最后72。C延伸10min。
对PCR产物进行iy。琼脂糖凝胶电泳检测，获得约300bp左右的片段。回收该 300bp左右的片段，连接到T-easy载体上，获得重组载体命名为T-Xa5,。对T-Xa5, 进行测序300bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2) 人工改造的隐性抗病基因xa5编码序列的获得
根据氨基酸密码子的简并性，依据xa5基因的蛋白序列，在xs5 0RF (m，f) DNA序列基础上，将编码同一种氨基酸的不同密码子位置两两对换，最后成单的氨 基酸密码子用该氨基酸在义s5中出现频率较高的密码子代替，并兼顾GC含量与原 来xs^F相当，使之没有任一段连续19bp完全匹配的区域。人工改造的隐性抗病基 因xa5编码序列如序列表中序列2所示。为了便于基因操作，在ORF 5，端添加了 Ncol酶切点，3，端添加BstEII酶切位点，命名为X3A
由上海生物公司合成，将xa5M连接到T-easy载体上，获得重组载体命名 为T-xa5Mc
3) 转化载体的构建
分别将T-Xa5,和pTCK303 (ZHEN WANG、 CHANGBIN CHEN、 YUNYUAN XU、 RONGXI JIANG、 YE HAN、 ZHIHONG XU and KANG CH0NG， A Practical Vector for Efficient Knockdown ofGene Expression in Rice (Qryzs sa"'ra L ); 尸2朋f #o_/ec〃_/ar A'o7c^y/teparter 22: 409 -417， December 2004)(中国科学院遗传与发育生物 学研究所)用Kpn I和BamH I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收300bp左右的Xa5,片 段和13K左右的pTCK303大片段，获得重组质粒命名为pXa5,-1。再用Sac I和Spe I 双酶切pXa5隨-1和T-Xa5隨，回收300bp左右的Xa5隨i片段和13K左右的pXa5眺i-l载体
5片段，连接获得重组质粒命名为pXa5,。用Nco I和BstE 1I双酶切载体T-xa5M，回 收300bp左右片段，再将pXa5,先用BstE II完全酶切，然后用Nco I进行不完全酶 切，回收13000bp左右大片段，将300bp左右片段和13000bp左右大片段连接获得重 组载体命名为pXa5,-xa5M(图l)。
二、转pXa5,-xa5M载体水稻的获得
利用农杆菌介导的方法，将重组表达载体pXa5,-xa5M导入到水稻台北309中， 获得了 18个转基因株系。
以Xa5隨F: 5' -GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG-3'和Xa5隨R: 5' -GGAG CTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG-3'为引物，检测Xa5 RNAi片段是否整合到水稻基因 组以及Xa5基因的表达水平。
以xa5卞5' —GAACTTTACAGGCGGTCTACG-3'和xa5MR: 5' -TGGCTAAGAAGCTTAGA ATCG-3'为引物，检测人工合成基因xa5M是否整合到水稻基因组以及xa5M基因的表 达水平。
以hptF5' -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'和hptR 5' -TACACAGCCATCGGTCCAGA-
3'为引物，检测潮霉素基因是否整合到水稻基因组和潮霉素基因的表达水平。
以引物Xa55(5， GGTCTCCTCCGCTCCTCCTC 3，)和(R: 5， GGGCGATGCGTGCGCCTAAA
C 3')检测Js5基因的5'非翻译区(縮写Xa55)。
以引物Xa53(5， ATTGATAACTGCGAGGTCAG 3，)和(R: 5， GGTACCATTAACATAGGATC C 3')检测i^5基因的3' UTR区(縮写Xa53)。
以引物77T7>Iy1F (5， TGACAAGTCCAT GACTAGC 3，)禾卩7F/Z4y1R (5， CTCT TCTTTAGTCTCCAGC 3，)检测与L5同源的位于第一染色体的成员7FiT力Yl的表达。
PCR检测结果如图2A所示，表明18个转基因株系有10个株系能同时检测到 、 xa5M和Xa5瞧i的目的条带。
图2A中，positive CK为以pXa5隨-xa5M载体为模板，Negative CK为以水为 模板，1-18分别表示18个T。代转pXa5RNAl-xa5M载体水稻。
对同时检测到力pf、 xa5"^和Xa5RNAi的目的条带的转pXa5,-xa5M载体水稻和未转 基因的水稻台北309进行RT-PCR分析结果如图2B所示，2对分别位于5' UTR区、 3' UTR区的引物的PCR扩增均未出现扩增产物，说明7s5基因在转pXa5,-xa5M载 体水稻中几乎没有表达，转PXa5RNAl-xa5M载体水稻的中Xa5被沉默，以xa5MF和xa5MR 为引物的PCR扩增出现扩增产物，说明转pXa5,-xa5M载体水稻的中xa5M表达。此 外与/s5同源的位于第一染色体的成员77^7Z4 y 1的表达在转基因株系不受影响。图2B中，1为分子量标准，2-6为同时检测到知L xa5M和Xa5,的目的条带的 转pXa5,-xa5M载体水稻的不同株系，7为未转基因的水稻台北309。
挑选上述能同时检测到如f、 xa5M和Xa5,的目的条带的8个株系、携抗性基 因xa5的抗病对照IRBB5 (国际水稻所提供)和未转基因的水稻台北309，移栽到 海南陵水中科院遗传与发育生物学研究所南繁基地，每个株系100株，随机分成2 组，实验组和对照组，每组设3个小区。
实验组于成株期通过剪叶法对充分伸展的叶片接种白叶枯菌株P1 (国际水稻 所)。接种病原菌在PSA培养基(马铃薯300g/L， Ca(N03)2*4H20 0. 5g / L， Na2HPO 12H20 2. Og / L，蔗糖15g/L，琼脂粉15g / L)上于28。C培养72h，调节浓 度至10tFU / mL，接种14d当病斑长度明显而稳定时进行调查，每一植株测量三片叶。 接种14d后观察各个株系的表型。
表型观察结果如图3所示，未转基因的水稻台北309的病斑长度约7cm (平均 值)，同时检测到力pL xa5M和Xa5,的目的条带的8个株系的病斑长度都不超过 lcm (平均值)，均表现出对白叶枯病的高度抗性。
图3中，TP309为未转基因的水稻台北309， IRBB5是携抗性基因；ra5的抗病 对照数字编号为同时检测到知L xa5"和Xa5RNAl的目的条带的转PXa5RNAi-xa5M载体水 稻。
对转基因植株的农艺性状调査结果如表1，同时检测到知t、 xa5M和Xa5RNAl的目
的条带的株系3、 6、 17的结实率与对照相当，产量没有受到影响。说明利用
pXa5,-xa5M载体系统是可以获得高抗白叶枯病，但不影响产量的转基因植株的。
表1.转基因植株农艺性状调査
株咼分蘗稳长每穗总粒数每穗实粒数结实率(％)
台北30996. 78. 320.6887989.8
同时检测27882088. 55056. 5
到力pt、3842618. 584. 57689. 9
xa5'和5781117.68438. 545. 8
Xa5'""'的6922720.3124. 5118. 595.2
目的条带7674014.682. 000.0
的8个株882520.093. 339. 742. 6
系988.52618.8902831. 1
1786620. 110699. 393. 7
7序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
〈120〉基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法
<160> 4
〈210〉 1
<211> 277
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉 <230〉
<400〉 1
attcaagttc ttgtccagtt tgataagtct atgacggaag ccttggagaa ccaagtcaag 60
agcaaggttt ctatcaaggg ccacctgcac acttacaggt tctgtgacaa tgtatggaca 120
ttcatcttga ctgaeigcatc attcaagaac gaggagacta cag肪caagt tggcaaggtg 180
aagattgtgg cctgtgattc caaactactc agccaataaa ttgataactg cgaggtcagg 240
gtttgcctgg tatttgttag tctcttctgc tagacct 277
<210> 2
<211> 321
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220> 〈230〉<400> 2
atggccacgt tcgaacttta caggcggtct gacgaaa/tgg ttagcagcgg cacgctgtcc ttcgatsiaat cteitgaccga ggcattggaa ggccacctcc acacctaccg gttctgcgac agcttcaaaa acgaagagac aactgagcaa tctaagcttc ttagccaatg a
acgatcggca tgtgtctaac tgaaaccctt 60 ccggaacttg ccatccaagt cctcgaacag 120 ataccaagtgei aaagcaaggt ctcca_ttaaei 180 aatgtttgga ctttcatttt gaccgaggcc 240 gtcggcaaag tgaagatcgt cgcctgcgat 300
321
<210〉 3
〈211〉 477
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉 <230>
gtcgacggtaagttactacaaacctttttg
tctcatgttccacgtatcactttaatgttc
ttagaggatcaagagtatatgcctgtctta
ctgeLt￡Ltt￡iaigatgaatttt
catagttcataattttaccctgttctcaat
cttgacattgatgatca^atattttctaga
ccacggcagttacccactgt
aaacctttgattgttcctataacacctaat
tacttatgtt ccagtgacaa ttatttgtgt 60
atggttgatc attgtaccgc ctcatctctt 120
actttttctt tctctggtcc agtctttccg 180
atgtgctgcc tgtgtatgaa ggttcagagg 240
taggaaatgt attttgcaag gtcataaagt 300
gctaaaattt cataatcaaa tatgacagtt 360
atatattagt atgaagatta acacttgaaa 420
gattgactat gacacggctg tttcgag 477
〈210〉 4 <211> 106 〈212〉 PRT
9<213>人工序列
<220〉 <230>
〈400〉 4
Met Ala Thr Phe Glu Leu Tyr Arg Arg Ser Thr lie Gly Met Cys Leu
15 10 15
Thr Glu Thr Leu Asp Glu Met Val Ser Ser Gly Thr Leu Ser Pro Glu
20 25 30
Leu Ala lie Gin Val Leu Glu Gin Phe Asp Lys Ser Met Thr Glu Ala
35 40 45
Leu Glu Asn Gin Val Lys Ser Lys Val Ser lie Lys Gly His Leu His
50 55 60
Thr Tyr Arg Phe Cys Asp Asn Val Trp Thr Phe lie Leu Thr Glu Ala 65 70 75 80
Ser Phe Lys Asn Glu Glu Thr Thr Glu Gin Val Gly Lys Val Lys lie
85 90 95
Val Ala Cys Asp Ser Lys Leu Leu Ser Gin 100 105
10
权利要求
1、一种DNA分子，包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子，所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且与A或C片段的没有任一段连续19bp的互补区。
2、 根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述RNA干扰表达盒和所述 人工改造基因表达盒的转录方向相反。
3、 根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述目的蛋白的氨基酸 序列为序列表中的序列4。
4、 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于所述A片段的核苷酸序列为 序列表中的序列1。
5、 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于所述人工改造的目的基因为 序列表中的序列2。
6、 根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述B片段的核苷酸序列为 序列表中的序列3。
7、 含有权利要求1至6中任一所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或 重组菌。
8、 权利要求1至6中任一所述的DNA分子、权利要求7所述的重组表达载体、 转基因细胞系或重组菌在培育抗病植物中的应用。
9、 一种培育抗病植物的方法，是将权利要求1至6中任一所述的DNA分子导入 植物中获得抗病植物。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述植物为水稻，所述抗病植物 为抗白叶枯菌的水稻。
全文摘要
本发明公开了一种基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。该方法通过构建培育抗病植物的DNA分子来实现，该DNA分子包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子，所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且与A或C片段不互补。利用本发明的DNA分子能改良水稻白叶枯的抗性，同时不影响水稻其他的农艺性状。
文档编号C12R1/91GK101508991SQ20091008112
公开日2009年8月19日 申请日期2009年4月2日 优先权日2009年4月2日
发明者夏志辉, 江光怀, 翟文学, 高利芬 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所