专利名称：可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞培养器皿，特别涉及一种可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细 胞培养皿。
背景技术：
细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。而显微镜是观察细胞的主要工具， 也是进行生命科学研究的主要方法。近年来激光共聚焦显微镜作为一种现代检测技术已经 被广泛应用于生命科学研究中。现在常用的激光共聚焦显微镜的物镜的工作距离都比较 小，特别是放大倍数在60倍以上的物镜，工作距离都在0. 18mm以下，而普通的一次性细胞 培养皿多是采用透明高分子材料聚苯乙烯材料，且透光性差，培养皿壁较厚(约1mm左右)， 不适合用激光共聚焦显微镜来观察和成像。目前市场上销售的共聚焦专用培养皿都是采用 厚度为0. 13 0. 17mm厚的玻璃底培养皿，这种培养皿结构是在普通一次性细胞培养皿底 部打一直径为10mm的洞，然后在培养皿底用生物胶粘上一片厚度为0. 13 0. 17mm的方形 盖玻片，这种培养皿只能一次性使用。由于生物胶的技术国内还没有大的突破，目前国内使 用的这种培养皿主要依赖于进口，且售价很高，约36元/个。这对于从事生命科学及其相 关研究的单位和个人来说都是笔不小的费用。至今为止国内外还没有出现商品化可以重复 使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿。因而研制可重复使用激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿必将会为众生命科学的 研究提供一种经济实用的细胞培养工具。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，采用不锈钢材料为主体，将细胞培养皿的 主体分成三部分，利用精密机械加工技术实现三部分与盖玻片的有机结合，从而提供一种 多功能可重复使用的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿。本发明的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，包括细胞培养皿盖、 凹型细胞培养皿底、细胞培养皿芯、上下垫片、盖玻片。在底部开有通光孔的所述的凹型细胞培养皿底中放置有所述的下垫片，在下垫片 上放置有所述的盖玻片，在盖玻片上放置有所述的上垫片，在上垫片上放置有所述的细胞 培养皿芯，且细胞培养皿芯与凹型细胞培养皿底密封结合；所述的上垫片、下垫片和细胞培 养皿芯上开有与凹型细胞培养皿底上的通光孔大小相同且位置相对应的通光孔；在细胞培 养皿芯上盖有所述的细胞培养皿盖。所述的细胞培养皿芯的外边缘带有外螺纹，凹型细胞培养皿底的凹型壁的内侧带 有内螺纹，细胞培养皿芯的外螺纹与凹型细胞培养皿底的凹型壁的内螺纹啮合密封。所述的细胞培养皿盖、细胞培养皿芯和凹型细胞培养皿底均是用不锈钢材料经精 加工而成。所述的上垫片和下垫片均是由聚四氟乙烯材料加工而成。
所述的盖玻片是激光共聚焦显微镜专用盖玻片，厚度可为0. 13 0. 17mm。被检测
的培养细胞负载于盖玻片上(与上垫片接触的一面)。 所述的盖玻片的大小与上垫片或下垫片的大小一样或略小。上述的通光孔可以是圆形孔也可以是方形孔，孔的大小和数量可以根据实际需要 设计。如所述的凹型细胞培养皿底可以根据需要设计成直径为25mm、30mm、35mm、40mm、 45mm、50mm等；通光孔的直径可为 10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm等；通光孔
的数量可为1 8个等。所述的细胞培养皿芯可以根据需要设计成直径为24. 8mm, 29. 8mm, 34. 8mm、 39. 8mm、44. 8mm、49. 8mm 等；通光孔的直径可为 10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、 45mm等；通光孔的数量可为1 8个等。所述的上下垫片可以根据需要设计成直径为24. 8mm、29. 8mm、34. 8mm、39. 8mm、 44. 8mm、49. 8mm 等，通光孔的直径可为 10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm 等，通
光孔的数量可为1 8个等。所述的细胞培养皿盖可以根据需要设计成直径为26mm、31mm、36mm、41mm、46mm、 51mm 等。本发明适合于采用激光共聚焦显微镜检测细胞培养，可以实现多孔板的功能。本发明具有(1)本发明采用不锈钢材料作为培养皿的主体材料，该材料与常规细胞培养液不 发生任何反应，且容易清洗，实现了培养皿主体的重复使用；(2)采用聚四氟乙烯材料做上下垫片，且细胞培养皿芯与细胞培养皿底通过螺纹 啮合保证了培养皿的主体密封性；(3)本发明的多孔结构可以实现多孔培养板的功能；(4)本发明的装置结构简单，易于操作，经济实用，能应用于化学、生物、医学、材 料、环境、安全等多个领域。为纳米科学、材料科学、生物化学及交叉领域的科学问题的深入 研究提供了高效率研究手段。
图1.本发明的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿结构示意图。图2 (a).本发明实施例1的用细胞培养皿培养的贴壁细胞在激光共聚焦显微镜下 观察其明场的图像。图2(b).本发明实施例1的用细胞培养皿培养的贴壁细胞在加入荧光探针HgL 后，在激光共聚焦显微镜下观察的荧光图。附图标记1.细胞培养皿盖 2.通光孔 3.细胞培养皿底 4.盖玻片5.细胞培养皿芯 6.上垫片 7.下垫片
具体实施例方式下面结合具体实施例来对本发明做进一步的解释和说明。
实施例1请参见图1。可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，包括细胞培养皿盖 1、凹型细胞培养皿底3、细胞培养皿芯5、上垫片6、下垫片7、盖玻片4。在底部开有通光孔2的由不锈钢材料制备成的凹型细胞培养皿底3中放置有由 聚四氟乙烯材料加工而成的下垫片7，在下垫片上放置有激光共聚焦显微镜专用盖玻片4， 盖玻片的厚度为0. 13 0. 17mm，在盖玻片上放置有由聚四氟乙烯材料加工而成的上垫片 6，在上垫片上放置有由不锈钢材料制备成的细胞培养皿芯5 (其作用是将上垫片6、下垫片 7及盖玻片4压紧)，且细胞培养皿芯的外边缘带有外螺纹，凹型细胞培养皿底的凹型壁的 内侧带有内螺纹，细胞培养皿芯的外螺纹与凹型细胞培养皿底的凹型壁内侧的内螺纹啮合 密封；所述的上垫片、下垫片和细胞培养皿芯上开有与细胞培养皿底上的通光孔大小相同 且位置相对应的圆形通光孔；在细胞培养皿芯上盖有由不锈钢材料制备成的细胞培养皿盖 1。采用该细胞培养皿，能够在二氧化碳培养箱中培养贴壁细胞和不贴壁细胞。图2(a)和图2(b)为采用可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿培养 的HEK293细胞的激光共聚焦图片。将购买得到的HEK293细胞以MEM培养液(质量浓度为 10% PBS,2mM L-glu)作为培养基，在斜颈细胞培养瓶中培养，温度37°C，C02的质量浓度为 5%，每隔3日换液一次。传代，冻存备用。测试前一日，复苏冻存的HEK293细胞，选取生长 状态良好的HEK293细胞，用胰蛋白酶消化后吹打分散，然后装在具有上述结构的经紫外线 消毒后的细胞培养皿中的盖玻片上(与上垫片接触的一面)后密封细胞培养皿，其中，凹型 细胞培养皿底的直径为40mm，盖玻片的厚度为0. 13mm，通光孔的数量为1个，通光孔的直径 为30mm，细胞培养皿盖的直径为41mm ；将上述装有HEK293细胞的细胞培养皿在二氧化碳培 养箱中培养24小时，在普通光学显微镜下观察，大部分细胞呈贴壁状态；实验前用PBS缓冲 液(磷酸盐缓冲液)将培养基冲洗掉，然后放在共聚焦显微镜下观察其明场图像如图2(a) 所示，加入识别生物巯基化合物荧光探针HgL (参看CN200810112996. X，“检测谷胱甘肽还 原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途”)孵育5分钟，得到激光共聚 焦荧光图2 (b)，从图2 (a)和图2 (b)两张图中能看出细胞生长状态良好，能够在激光共聚焦 显微镜下清洗成像。实施例2采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用原位杂交盖玻片，能够实现原位杂交实验观察。实施例3采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用载玻片，能够培养多种细胞用于普通生物显微镜观察与成像。实施例4采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用石英盖玻片，能够培养多种细胞用于紫外共聚焦显微镜及普通紫外荧光显微镜 观察与成像。实施例5采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中盖玻片采用硅化防脱盖玻片，能够用于抗原修复过程过程的荧光标记共聚焦成像观察。实施例6将具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿中的已 经有贴壁细胞的盖玻片取出，可以直接将贴壁细胞固定封片；而可重复使用的激光共聚焦 显微镜专用细胞培养皿中的多个通光孔可以为不同测试环境，可得到不同测试环境下的多 封片样品。实施例7采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，并且 在细胞培养皿底的外壁贴上帕尔贴，通过电路设计可将可重复使用的激光共聚焦显微镜专 用细胞培养皿实现为恒温培养皿。实施例8将具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿设计成 长方形，并按实验要求开有更多的通光孔(6孔、12孔、24孔、48孔、72孔、96孔)，可以实现 6孔、12孔、24孔、48孔、72孔、96孔的多培养板的功能。实施例9采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用多聚赖氨酸片基，适用活寡核苷酸探针荧光共聚焦成像。实施例10采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用醛基化玻璃片基，适用氨基修饰的DNA探针共聚焦成像。实施例11采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用异硫氰酸片或琼脂糖片基，适用内多肽、小分子抗原共聚焦成像。实施例12采用具有实施例1结构的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其中 盖玻片采用氨基化玻璃片基，适用DNA探针荧光共聚焦成像。
权利要求
一种可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其包括细胞培养皿盖、凹型细胞培养皿底、细胞培养皿芯、上下垫片、盖玻片；其特征是在底部开有通光孔的所述的凹型细胞培养皿底中放置有所述的下垫片，在下垫片上放置有所述的盖玻片，在盖玻片上放置有所述的上垫片，在上垫片上放置有所述的细胞培养皿芯，且细胞培养皿芯与凹型细胞培养皿底密封结合；所述的上垫片、下垫片和细胞培养皿芯上开有与凹型细胞培养皿底上的通光孔大小相同且位置相对应的通光孔；在细胞培养皿芯上盖有所述的细胞培养皿盖。
2.根据权利要求1所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特征 是所述的细胞培养皿芯的外边缘带有外螺纹，凹型细胞培养皿底的凹型壁的内侧带有内 螺纹，细胞培养皿芯的外螺纹与凹型细胞培养皿底的凹型壁的内螺纹啮合密封。
3.根据权利要求1和2所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特 征是所述的细胞培养皿芯和凹型细胞培养皿底均是用不锈钢材料加工而成。
4.根据权利要求1所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特征 是所述的细胞培养皿盖是用不锈钢材料加工而成。
5.根据权利要求1所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特征 是所述的上垫片和下垫片均是由聚四氟乙烯材料加工而成。
6.根据权利要求1所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特征 是所述的盖玻片是激光共聚焦显微镜专用盖玻片。
7.根据权利要求1或6所述的可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，其特 征是所述的盖玻片的厚度为0. 13 0. 17mm。
全文摘要
本发明属于细胞培养器皿，特别涉及一种可重复使用的激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿。本发明的细胞培养皿是在底部开有通光孔的凹型细胞培养皿底中放置有下垫片，在下垫片上放置有盖玻片，在盖玻片上放置有上垫片，在上垫片上放置有细胞培养皿芯，且细胞培养皿芯与凹型细胞培养皿底密封结合；所述的上垫片、下垫片和细胞培养皿芯上开有与细胞培养皿底上的通光孔大小相同且位置相对应的通光孔；在细胞培养皿芯上盖有细胞培养皿盖。本发明采用不锈钢材料作为培养皿的主体材料，该材料与常规细胞培养液不发生任何反应，且容易清洗，实现了培养皿主体的重复使用，并且多孔结构可以实现多孔培养板的功能。
文档编号C12M3/04GK101876748SQ200910082988
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者刘卫敏, 张洪艳, 汪鹏飞 申请人:中国科学院理化技术研究所