专利名称：：用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法。
背景技术：
：肺癌是最致命的癌症之一，在组织学上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中后者占肺癌病例的80%。非小细胞肺癌又分为腺癌，鳞癌和大细胞癌三类亚型。腺癌作为一种最主要的亚型，占非小细胞肺癌的40%。非小细胞肺癌的预后严重依赖于确诊时疾病所处的分期，按照现有的治疗水平，病人的5年生存率从1期的60%降到IV期的1。/。。尽管在肺癌的检测方法上取得了较大进展，但目前仍有约70%的病人在确诊时已处于肺癌晚期。对非小细胞肺癌不同亚型的治疗施加相似的治疗方法而没有考虑亚型之间的异质性是影响非小细胞肺癌治疗效果的重要原因。尽管目前神经元特异性烯醇化酶、细胞角蛋白片段21-1、癌胚抗原、糖类抗原等肿瘤标志物用于肺癌的检测和术后评估，但是这些肿瘤标志物对肺癌，尤其是不同肺癌亚型的特异性和敏感性不够。非小细胞肺癌的分型和诊断仍主要依靠细胞物理形态进行判断，发展能从分子水平上反映非小细胞肺癌特征的新试剂，并用以进行亚型分类和早期诊断是降低非小细胞肺癌死亡率重要手段。核酸适体(Aptamer，又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，但与抗体相比具有很多优良的特性，如无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
发明内容本发明的目的是提供一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法。本发明提供的核酸适体，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。所述核酸适体具体可为序列表的序列1至序列16中任一所示的DNA片段。核酸适体1:5，-CGCGTGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAGCGCG-3';见序列表的序列10;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列l;核酸适体2:5'-CMTTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3，;见序列表的序列2;核酸适体3a:5，-ATGCCACAGTGGGGGGGTGGGTGGGTGGCAT_3，；见序列表的序列ll;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列3;核酸适体3b:5，-TCGGATGCTGGGTGGGGGGGAAGAGCATCCGA-3，；见序列表的序列12;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列4;核酸适体3c:5，-CCACTACGAGGGTGGGCGGGTGGAGTAGTGG-3';见序列表的序列13;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列5;核酸适体3d:5'-GATCGGTGGGTGGGGGGGTTGGAGATC-3，；见序列表的序列14;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列6;核酸适体3e:5，-CGAACAGGTGGGTGGGTTGGGTGGATTGTTCG-3，；见序列表的序列15;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列7;核酸适体3f:5，-GATTAAGTGGGTGGGGGGGTGGAAGTTAATC-3，;见序列表的序列16;其中加粗下划线标记的为目标序列，见序列表的序列8;核酸适体4:5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，;见序列表的序列9。其中，每条DNA序列中目标序列以外的核苷酸可用其它互补的核苷酸代替。其中，核酸适体3a、核酸适体3b、核酸适体3c、核酸适体3d、核酸适体3e和核酸适体3f，包含一保守序列G^GGGTGGGG&GGTAGAe其中Gi可以删除，T,可被核苷酸A取代，G2可以被核苷酸C或TT取代，T2可以被核苷酸A取代，G3可以被核苷酸A取代或删除。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物，所述核酸适体的衍生物可为a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。本发明还保护所述核酸适体在不同亚型非小细胞肺癌细胞分型中的应用。所述核酸适体与不同亚型的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同。将两者孵育后可得到不同的结合信号，从而可以通过单个核酸适体信号或多个核酸适体分子图谱的形式区分非小细胞肺癌不同亚型。还可将所述核酸适体进行荧光标记，然后对肺癌病人的组织切片进行染色，从而实现临床样本非小细胞肺癌不同亚型的区分。当然，在核酸适体与不同亚型的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同的基础上，可以再现有技术的技术上选择任意方法，对不同亚型非小细胞肺癌细胞进行分型。所述不同亚型的非小细胞肺癌细胞可为腺癌亚型细胞、大细胞癌亚型细胞或鳞癌亚型细胞。所述腺癌亚型细胞具体可为A549细胞；所述大细胞癌亚型细胞具体可为HLAMP细胞或NCI-H460细胞；所述鳞癌亚型细胞具体可为NCI-H520细胞或NCI-H157细胞。本发明还保护筛选述核酸适体的方法，包括如下步骤用靶细胞对核酸文库进行筛选，得到与靶细胞特异结合的核酸适体；所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库；所述靶细胞为非小细胞肺癌细胞中的亚型细胞。所述筛选的方法具体包括如下步骤(1)以所述核酸文库为起始核酸文库；(2)将所述起始核酸文库的溶液与靶细胞孵育，靶细胞与起始核酸文库中部分核酸序列结合，分离，得到与靶细胞结合的核酸序列文库；(3)将所述与靶细胞结合的核酸序列文库的溶液与非耙细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸序列，得到与靶细胞特异结合的核酸序列；(4)得到核酸适体。所述步骤(2)中，还可包括如下步骤在得到与靶细胞结合的核酸序列文库后，PCR扩增所述与靶细胞结合的核酸序列文库，并制备成单链。所述步骤(3)中，还可包括如下步骤在得到与耙细胞特异结合的核酸序列后，PCR扩增与靶细胞特异结合的核酸序列，并制备成单链。所述筛选的方法中，在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前，包括至少1次以下操作以所述与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库，重复步骤(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库。所述筛选方法中，可每一轮筛选逐步增加筛选压力，以增进核酸适体的富集程度。所述增加筛选压力可为线性减少核酸序列文库和靶细胞的孵育时间和相应的线性增加核酸序列文库与非耙细胞的孵育时间。所述靶细胞具体可为腺癌亚型细胞；所述非靶细胞具体可为大细胞癌亚型细胞。肺癌的形成是一个多步的瘤形成过程。一些分子异常也伴随肿瘤的形成而发生，如一些分子在肿瘤中表达或过表达，或发生改变。利用本发明的核酸适体，可在目前非小细胞肺癌肿瘤标志物未知的情况下，从分子响应信号而不是从细胞物理形貌上实现非小细胞肺癌不同亚型的区分。利用本发明的核酸适体，对其结合靶标的鉴定，将有利于非小细胞肺癌不同亚型的肿瘤标志物的发现，有利于非小细胞肺癌更早的诊断和更准确的分型，有利于发现肿瘤治疗新的药物作用耙点。图1为实施例1中核酸适体的随筛选轮次的富集过程；峰形代表A549细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记文库，和第1轮、第6轮、第21轮产物结合的情况图2为应用四甲基罗丹明标记的核酸适体识别非小细胞肺癌组织切片的结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。腺癌A549细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学院细胞中心，产品目录号为CCC0002。鳞癌NCI-H520细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学院细胞中心，产品目录号为CCC0197。鳞癌NCI-H157细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学院细胞中心，产品目录号为CCC0113。大细胞癌HLAMP购自中山医科大学实验动物中心。大细胞癌NCI-H460细胞系购自中国科学院典型培养物保,委员会细胞库，产品目录号为TCHu39。实施例1、用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体的筛选一、随机核酸文库的设计与合成设计合成两端包含20个核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机核酸序列文库如下5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N45)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。二、核酸适体的筛选将随机核酸文库溶于结合缓冲液中(PBS，150mMNaCl，5mMMgCl2，lmg/ml酵母转移RNA)，与肺腺癌细胞系A549细胞在冰上孵育1小时；经洗涤缓冲溶液(PBS，150mMNaCl,5mMMgCl2)洗涤后，将A549细胞刮离下来，然后通过加热将与细胞表面结合的丽A解离；解离的DNA与大细胞肺癌细胞系HLAMP细胞冰上孵育1小时，收集上清液并以其中的DNA为模板，利用引物(FITC-5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和Biotin-5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，)进行PCR扩增；扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR产物，然后利用O.2M的氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集FITC标记的DNA单链，这些DNA单链脱盐后用于下一轮筛选。为了得到高亲和性的区分不同非小细胞不同亚型的核酸适体，在筛选的过程中，通过逐步减少DNA文库与靶细胞孵育的时间，增加洗涤次数和洗涤时间以及与对照细胞孵育的时间来增强筛选压力。核酸适体随筛选轮次的富集过程见图1。25轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3')进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，得到以下核酸适体序列核酸适体l:5，-CGCGTGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAGCGCG-3';核酸适体2:5，-CMTTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3，；核酸适体3a:5，-ATGCCACAGTGGGGGGGTGGGTGGGTGGCAT-3，；核酸适体3b:5，-TCGGATGCTGGGTGGGGGGGMGAGCATCCGA-3，；核酸适体3C:5，-CCACTACGAGGGTGGGCGGGTGGAGTAGTGG-3';核酸适体3d:5，-GATCGGTGGGTGGGGGGGTTGGAGATC-3';核酸适体3e:5，-CGAACAGGTGGGTGGGTTGGGTGGATTGTTCG-3，；核酸适体3f:5，-GATTAAGTGGGTGGGGGGGTGGMGTTAATC-3，；核酸适体4:5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA7将获得的核酸适体分别在5'端标记荧光分子制成分子探针，分别取0、5、10、20、40、80、100、120、200nM的分子探针溶液，与5X105个肺腺癌细胞系A549细胞于冰上孵育50分钟后，用结合缓冲液洗涤两遍，然后用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度，如细胞能结合荧光标记的核酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y=BmaxX/(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数Kd。结果表明，核酸适体的平衡解离常数均在纳摩范围内。实施例2、应用核酸适体对进行不同亚型的小细胞肺癌进行分型用异硫氰酸荧光素(FITC)标记实施例l得到的4条核酸适体。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记实施例1的随机核酸文库。将培养的不同肿瘤细胞用PBS洗涤两次、然后0.02%EDTA处理3分钟、再用PBS洗涤两次。每种肿瘤细胞分别进行以下四组处理，每个处理设置三个重复，结果取平均值处理一通过细胞记数分别取300，OOO左右的细胞分散于结合缓冲溶液中，然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记核酸适体l(最终浓度为100nM)。处理二通过细胞记数分别取300，OOO左右的细胞分散于结合缓冲溶液中，然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记核酸适体2(最终浓度为100nM)。处理三通过细胞记数分别取300，OOO左右的细胞分散于结合缓冲溶液中，然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记核酸适体3e(最终浓度为100nM)。处理四通过细胞记数分别取300，OOO左右的细胞分散于结合缓冲溶液中，然后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记核酸适体4(最终浓度为100nM)。四个处理的混合液在冰上孵育50分钟，离心洗涤两次后利用流式细胞仪检测核酸适体和不同肿瘤细胞结合情况。将细胞与FITC标记的随机文库孵育后做流式细胞仪检测，设定一荧光强度值大于95%的细胞荧光强度做为流式细胞仪背景荧光值。以细胞与核酸适体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体与细胞的结合能力强弱(0:<15%;+:15-30%;++:30-65%;+++:65-85%;++++〉85%)。结果见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>对于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体l，腺癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有65-85%，大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有15-30%，鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度在阈值的细胞百分数小于15%;对于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体2，腺癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有85%以上，大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有30-65%，鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数小于15%;对于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体3e，腺癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有85%以上，大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有65-85%，鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有15-65%;对于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体4，腺癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有85%以上，大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有65-85%，鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数小于15%。结果表明利用以上核酸适体与不同亚型非小细胞肺癌的结合强弱图谱均可实现不同亚型非小细胞肺癌的区分。实施例3、检测表1所列的核酸适体与肺癌组织切片的结合来自不同肺癌患者志愿者的甲醛固定石蜡包埋的组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次20分钟，随后浸于系列乙醇中水化(100%，两次，每次l分钟；95%乙醇，l次，l分钟；70%乙醇，l次，l分钟)。随后将水化的组织切片浸于缓冲溶液中95。C加热15分钟。待组织切片恢复室温后，与含20%胎牛血清和小牛胸腺DNA的结合缓冲液室温孵育1小时，组织切片经洗涤后分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体(200nM)在结合缓冲液中室温孵育1小时。染色后用洗涤缓冲液洗涤组织切片3次，待干后封片检测。结果见图2。当三种非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体1孵育后，腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为357.59，而大细胞癌和鳞癌分别为214.99和181.06。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体2孵育后，腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为289.79，而大细胞癌和鳞癌分别为220.05和182.20。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体3e孵育后，腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为492.38，而大细胞癌和鳞癌分别为203.48和212.54。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体4孵育后，腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为482.83，而大细胞癌和鳞癌分别为219.33和218.31。实验结果表明所得到的核酸适体能与肺腺癌高亲和性结合，从而在临床上可用于肺腺癌的检测和诊断。序列表<110>中国科学院化学研究所〈120〉用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法<130>CGGNAY92234<160〉16<210>1〈211〉26<212>DNA〈213〉人工序列<220><223><400〉1tgtggggaggggggtgggttttatag26〈210〉2<211〉32<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2caattgggtgtaggggtggggattgtgggttg32〈210〉3〈211〉17〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223>〈400〉3agtgggggggtgggtgg17<210>4〈211〉16〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈223>〈400>4tgggtgggggggaaga16〈210〉5〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5gagggtgggcgggtgga〈210〉6〈211>19〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉〈400〉6ggtgggtgggggggttgga〈210〉7〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<220><223〉说明书第11/15页1719<400>7ggtgggtgggttgggtggat20<210>8<211〉19<212〉DNA<213>人工序列〈220>〈223〉<400>8gtgggtgggggggtggaag19〈210>9<211>45〈212>薩〈213〉人工序列〈220>〈223><400>9gctatcttatggaaatttcgtgtagggtttggtgtggcggggcta45〈210>10<211>34<212〉靈<213>人工序列<220><223><400>10cgcgtgtggggaggggggtgggttttatagcgcg34<210〉11〈211〉31<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉11atgccacagtgggggggtgggtgggtggcat31<210〉12<211〉32<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉〈400〉12tcggatgctgggtggggggga卿gcatccga〈210〉13<211〉31<212〉D隐〈213〉人工序列〈220〉〈223>〈400>13ccactacgagggtgggcgggtggagtagtgg3231〈210〉14<211〉27<212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉14gatcggtgggtgggggggttggagatc27〈210〉15〈211〉32〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉15cgaacaggtgggtgggttgggtggattgtteg32〈210〉16〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉16gattaagtgggtgggggggtggaagttaatc3权利要求1、核酸适体，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。2、如权利要求l所示的核酸适体，其特征在于所述核酸适体为序列表的序列1至序列16中任一所示的DNA片段。3、权利要求1或2所述核酸适体在不同亚型非小细胞肺癌细胞分型中的应用。4、如权利要求3所述的应用，其特征在于所述不同亚型的非小细胞肺癌细胞为腺癌亚型细胞、大细胞癌亚型细胞或鳞癌亚型细胞。5、如权利要求4所述的应用，其特征在于所述腺癌亚型细胞为A549细胞；所述大细胞癌亚型细胞为HLAMP细胞或NCI-H460细胞；所述鳞癌亚型细胞为NCI-H520细胞或NCI-H157细胞。6、筛选权利要求1或2所述核酸适体的方法，包括如下步骤用靶细胞对核酸文库进行筛选，得到与靶细胞特异结合的核酸适体；所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库；所述靶细胞为非小细胞肺癌细胞中的亚型细胞。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述筛选的方法包括如下步骤(1)以所述核酸文库为起始核酸文库；(2)将所述起始核酸文库的溶液与靶细胞孵育，靶细胞与起始核酸文库中部分核酸分子结合，分离，得到与靶细胞结合的核酸文库；(3)将所述与靶细胞结合的核酸文库的溶液与非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与靶细胞特异结合的核酸分子；(4)得到核酸适体。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，还包括如下歩骤在得到与靶细胞结合的核酸文库后，PCR扩增所述与靶细胞结合的核酸文库，并制备成单链；所述步骤(3)中，还包括如下步骤在得到与靶细胞特异结合的核酸分子后，PCR扩增与耙细胞特异结合的核酸分子，并制备成单链。9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述筛选的方法中，在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前，包括至少l次以下操作以所述与靶细胞特异结合的核酸分子为起始核酸文库，重复步骤(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的与靶细胞特异结合的核酸分子为起始核酸文库。10、根据权利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述耙细胞为腺癌亚型细胞；所述非靶细胞为大细胞癌亚型细胞。全文摘要本发明公开了一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法。本发明提供的核酸适体，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。所述核酸适体可应用于不同亚型非小细胞肺癌细胞分型。利用本发明的核酸适体，可在非小细胞肺癌肿瘤标志物未知的情况下，从分子响应信号上实现非小细胞肺癌不同亚型的区分。利用本发明的核酸适体，对其结合靶标的鉴定，将有利于非小细胞肺癌不同亚型的肿瘤标志物的发现，有利于非小细胞肺癌更早的诊断和更准确的分型，有利于发现肿瘤治疗新的药物作用靶点。文档编号C12N15/10GK101538570SQ20091008307公开日2009年9月23日申请日期2009年4月28日优先权日2009年4月28日发明者上官棣华,丽徐,方晓红,谭蔚泓,赵子龙申请人:中国科学院化学研究所