专利名称：一种筛选降解黄曲霉毒素b1细菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物筛选与纯化，特别是，涉及筛选高效降解黄曲 霉毒素B1细菌的方法。
背景技术：
自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究 该类毒素的预防和去毒方法。从自然界各种样品中筛选微生物进行脱 毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有刘大岭筛选出一种 真菌代谢产物具有降解毒素的作用。国外的研究报道比较多的筛选出 的解毒菌株包括乳酸菌，双歧杆菌，酵母菌和白腐真菌等，还有橙色 黄杆菌，红球菌，假密环菌，根霉菌等。对于乳酸菌，双歧杆菌和酵 母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且最关键 的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一些细 菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作 用时间，溶液pH值，菌体数量，毒素浓度，金属离子浓度等影响； 到目前还没有一种微生物筛选方法，能高效筛选黄曲霉毒素降解菌 株。
从自然界中筛选具有降解毒素功能的微生物，是一项耗时，费力 且高度危险的工作。国内外的研究人员筛选微生物大多釆用含毒素的 培养基进行特异筛菌，工作量巨大，效率低，长时间接触毒素对操作 人员的健康有危害，而且毒素对实验室和周边环境产生潜在污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于筛选降解黄曲霉毒素Bl细菌的 方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供香豆素在筛选降解黄曲霉毒素B1细菌中的应用。本发明还提供一种筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，该方法使 用香豆素作为筛选培养基的唯一碳源，培养样品，最后筛选得到能够 降解黄曲霉毒素B1细菌。
所述筛选培养基是以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化钙， 琼脂，制成的贫瘠培养基，pH调整为中性。
所述贫瘠培养基配方为0.1-0.5 gKH2P04， 0.2-2 g NH4N03， 0.1-1 gCaCl2， 15-20g琼脂，0.1-2g香豆素。
优选地，所述贫瘠培养基配方为0.25gKH2PO4, 1.0gNH4NO3, 0.25gCaCl2， 17g琼月旨，l.Og香豆素。
在制备得到固体平板培养基后，进行下述步骤
1 )菌群的稀释将自然界中收集得到的各种样品用无菌水溶解， 富集培养，稀释；
2) 菌群的涂布将稀释样品涂布于上述培养基制成的固体平板；
3) 细菌的纯化分离置于25-30。C生化培养箱培养3-10天，将可 见的不同形态的单菌落挑出，并在如上培养基平板中进行连续三代培 养，最终将可生长的菌株挑出。
所述步骤l )菌群的稀释中，将自然界中收集得到的动物粪便，发 霉粮食和饲料，土样，朽木等各种样品，分别称取lg,磨碎，置于灭 菌18mmx 180mm试管中，加无菌水9mL,用棉塞封口，振荡过夜。
所述步骤2)菌群的涂布中，吸取上清液l mL,梯度稀释10"、 l(T2、 10-3、 10—4、 l(T5，分别取0.2 mL各样品溶液，涂布于种子培养基的平 板。
所述步骤3)细菌的纯化分离中，将上述平板在37 。C恒温箱培养 3-10天，将能够生长的菌落逐一挑出，在新鲜的种子培养基平板上划 线纯化，分别编号并转接至肉汤培养基斜面保存；将上述分离纯化的 菌株用灭菌竹签接于装有香豆素溶液的灭菌36孔接种器中，然后接 种于香豆素培养基平板，将其置于37。C培养箱中培养一周，观察菌株的生长情况。为避免细菌在原环境中的碳源干扰，挑取有生长现象的 菌株，在初筛培养基平板上进行连续三代培养，将能够在香豆素培养 基上生长的菌株挑出，保存于斜面。
本发明还提供利用所述的纯化分离得到的菌株降解黄曲霉毒素
Bl的方法，包括如下步骤取细菌发酵液0.8 ml,加入黄曲霉毒素 Bl甲醇溶液0.2 ml，用磷酸盐缓冲溶液将反应体系调整至pH7.2， 在25-30'C反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。
本发明具有以下有益效果采用该发明方法筛选毒素降解菌不用 接触黄曲霉毒素剧毒物质，就能筛选出能降解毒素的细菌，特异性强， 筛选效率高，价格低廉，准确性强，适用于大规模筛选降解黄曲霉毒 素B1细菌，用于在饲料工业中黄曲霉毒素的控制。
图l各菌株在香豆素培养基上培养三代的形态； 图2由香豆素培养基法筛选得到的高效降解黄曲霉毒素B1的菌 株35隱3;
图3由香豆素培养基法筛选得到的高效降解黄曲霉毒素B1的菌 株068。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 本发明方法使用的主要实验仪器和设备有
北京医疗设备厂 合肥华泰医疗设备有限公司 北京东联哈尔仪器制造有限公司 湖北黄石医疗仪器厂 哈尔滨东联电子设备有限公司 北京医疗设备厂 Motic B Series/Panasonic
Sartorius 1702型分析天平 YX-280D型高压蒸汽灭菌器 Class 2 Type B2型生物安全柜 LRH-250A型生化培养箱
超净工作台 恒温水浴锅 显微摄像系统
6高速离心机
电热式压力蒸汽消毒器
HZQ-Q全温振荡器 752分光光度计 TGL-16C离心机
光化学衍生池
北京医用离心机厂 上海博迅设备厂
哈尔滨东联电子设备有限公司
上海精密科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂 美国AURA公司
L2130型高效液相色谱仪 日本日立公司 实施例1用于降解黄曲霉毒素B1细菌的筛选方法
1) 培养基的制备以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化钙， 琼脂，制成贫瘠培养基，调整pH为中性；培养基配方为0.25 g KH2P04， 1.0gNH4NO3, 0.25gCaCl2， 17 g琼脂，1.0 g香豆素，pH 7.0; 121。C蒸汽灭菌20min后加入香豆素；
2) 菌群的稀释将自然界中收集得到的动物粪便，发霉粮食和 饲料，土样，朽木等各种样品，各种样品分别称取l g,磨碎，置于 灭菌18 mmx 180 mm试管中，加无菌水9 mL，用棉塞封口，振荡过 夜；用无菌水溶解，富集培养，稀释；
3) 菌群的涂布吸取上清液l mL,梯度稀释10-1、 10-2、 10_3、 10-4、 10—5,分别取0.2mL各样品溶液，涂布于种子培养基的平板；
4) 细菌的纯化分离将上述平板在37'C恒温箱培养3-10天，观 察结果，将有代表性的菌落逐一挑出，在新鲜的种子培养基平板上划 线纯化，分别编号并转接至肉汤培养基斜面保存；将上述分离纯化的 菌株用灭菌竹签接于装有香豆素溶液的灭菌36孔接种器中，然后接 种于香豆素培养基平板，将其置于37'C培养箱中培养一周，观察菌株 的生长情况。为避免细菌在原环境中的碳源干扰，挑取有生长现象的 菌株，在初筛培养基平板上进行连续三代培养，将能够在香豆素培养 基上生长的菌株挑出，保存于斜面。
用本方法从自然界54个样品中初筛得到199株细菌(表l)。通过进一步复筛，得到26株有降解活力的菌株(表2)。
表l黄曲霉毒素降解菌株的初筛分离
菌种来源菌株数(株) 菌种来源菌株数(株)
黑叶猴粪4黄猴粪5
灰叶猴粪4南美貘粪4
白颊粪4豚鹿粪5
兔粪5土壤10
剑羚粪3花根土3
黑麂粪4朽木3
赤斑羚粪2发霉饲料4
尾久鹿粪5发霉大米4
驼鸟粪5发霉花生2
豚鹿粪5发霉水稻4
美洲豹粪5陈化粮2
大羚羊粪5糙米2
斑马粪5大麦米2
牛羚粪5薏米2
原驼粪5燕麦4
马来貘粪4红宝石米3
大耳羊粪3荞麦米2
东北虎粪5玉米馇1
牦牛粪4红花豇豆3
中美貘粪5红花云豆1
白颊长狼粪5黄豆2
山峭(石家庄)花生米2
粪
黄颊粪4饲料3
美洲虎粪4狗粮3
山峭(刚果)粪3猫粮2
斑誇粪5大豆粕2
鹅喉羚粪4发霉大米4
表2降解黄曲霉毒素Bi菌株的复筛菌株编号菌株来源AFBi降解率(％)± SE
35-3南美貘粪82.50 ±3.20a
51-4豚鹿粪80.93 ± 2.65ab
068南美貘粪78.61 ± 1.76 bcS2黄颊粪78.10 ±4.48be
C5灰叶猴粪77.80 ± 1.63bcd
B3兔粪77.57 ± 4.36cd
W3剑羚粪76.83 ± 0.72cd
47-1发霉饲料75.92 ±3.44cd
53-2斑誇粪74.83 ± 2,47cd
50-4鸵鸟粪73.92 ± 5.48ed
G2斑马粪73.75 ± 3.60d
32-2斑羚粪67.64 ± 1.72e
K2尾久鹿粪67.64 ± 0.75e
41-4斑马粪64.81 ±4.84e
K3尾久鹿粪64.23 ± 1.44e
11黑叶猴粪58.76 ±2.48f
Nl土壤51.50 ±0.57g
23-5斑羚粪48.69±3,18gh
G3斑马粪46.39 ± 1.25h
42-1饲料45.18 ± 1.30h
Jl赤斑羚粪30.88 士2.821
39-3白颊粪28.08 ± 1.25'
37-1美洲豹粪18.71 ±0.87J
m土壤13.94 ± 1.01k
31-3词料11.91 ±2.01k
Cl灰叶猴粪9.18± 1.54k
注肩标字母不相同表示差异显著(P0.05)
本发明分离筛选的具有降解黄曲霉毒素B1的细菌，形态各异，种
类分布广泛，经过细菌学鉴定以及生理生化试验研究，结果如下
菌株35-3在LB培养基上生长为黄色的圆形菌落，菌落边缘整齐, 表面湿润光滑，显微镜下细胞形态为细小短竿状，革兰氏染色阴性。 对其进行部分生理生化特征测定，结果表明该菌株在37 。C生长良好， 但是在10。C和55。C不能生长；能利用大部分单糖，如葡萄糖、麦芽 糖和果糖等作为唯一碳源；除硝酸铵外，大部分无机氮源都不能利用； 该菌能水解吐温80和明胶；在糖醇类发酵培养基上不产酸
菌株068在VY/2培养基上为橙红色球形菌落，菌落细小，分布紧 密，表面光滑粘稠，显微镜下细胞形态为竿状，革兰氏染色阴性。
9菌株C5在LB培养基上生长为乳白色的圆形菌落，菌落大而整齐， 表面光滑粘稠，显微镜下细胞形态为竿状，革兰氏染色阳性。
菌株53-2在LB培养基上为黄色的圆形菌落，菌落细小，显微镜下
细胞形态为球形，革兰氏染色阳性。
菌株51-4在LB培养基上为暗白色不规则菌落，菌落大而扩展，革 兰氏染色阳性。菌株47-l在LB培养基上为透明色椭圆形菌落，菌落光 滑粘稠，革兰氏染色阳性。菌株B3的细胞呈球状，革兰氏染色阴性。 菌株S2的细胞呈小球状，革兰氏染色阴性。菌株W3的细胞呈短杆状， 革兰氏染色阳性。
实施例2用于降解黄曲霉毒素B1细菌的筛选方法
l)培养基的制备以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化钙， 琼脂，制成贫瘠培养基，调整pH为中性；培养基配方为0.5 g KH2P04， lgNH4N03， 0.5gCaCl2， 15g琼脂，lg香豆素，pH7.0; 121。C蒸 汽灭菌20 min后加入香豆素；
其余步骤基本同实施例l。
用本方法从表l所列20个样品中筛选得到65株细菌。通过进一步 复筛，得到8株有降解活力的菌株。 实施例3用于降解黄曲霉毒素B1细菌的筛选方法
l)培养基的制备以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化钙， 琼脂，制成贫瘠培养基，调整pH为中性；培养基配方为0.2 g KH2P04, 0.5gNH4NO3， lgCaCl2, 15g琼脂，0.5g香豆素，pH7.0; 121°C 蒸汽灭菌20 min后加入香豆素；
其余步骤基本同实施例l。
用本方法从表1所列17个样品中筛选得到79株细菌。通过进一步 复筛，得到14株有降解活力的菌株。 实施例4用于降解黄曲霉毒素B1细菌的筛选方法
l)培养基的制备以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化钙，琼脂，制成贫瘠培养基，调整pH为中性；培养基配方为0.1 g KH2P04， 0.2gNH4NO3, 0.75gCaCl2， 15 g琼脂，0.2 g香豆素，pH 7,0; 121°C 蒸汽灭菌20 min 后加入香豆素； 其余步骤基本同实施例l。
用本方法从表1所列17个样品中筛选得到55株细菌。通过进一步 复筛，得到4株有降解活力的菌株。 实验例1
1) 利用本发明实施例l筛选得到的活性细菌35-3降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株35-3接种到发酵培养基中，37'C发酵35h,分别取800 发酵液，与200 pL黄曲霉毒素B1 (500昭/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置 于37 'C培养箱培养72h。
反应结東后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1, v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20(iL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)xl00。/。
结果表明，35-3的发酵液在37t:与AFBl培养72h，对毒素的降解 率达到82.5%。
2) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌068降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株068接种到发酵培养基中，30 'C发酵50h，分别取800 pL 发酵液，与200 pL黄曲霉毒素B1 (500吗/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置 于30 'C培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1， v/v)溶解残余物，混匀后用于高效液相色谱分析。上样量20(iL。毒素降解率按照如下公式计算 (1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100% 结果表明，068的发酵液在30 。C与AFB1培养72 h,对毒素的降
解率达到76.6%。
3) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌C5降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株C5接种到发酵培养基中，37C发酵24h,分别取800 pL发 酵液，与200 ^iL黄曲霉毒素B1 ( 500昭/kg)置于灭菌的青霉素小瓶 中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置于 37 'C培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1， v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，C5的发酵液在37'C与AFB1培养72 h,对毒素的降解 率达到77.8 %。
4) 利用本发明实施例l筛选得到的活性细菌53-2降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株53-2接种到发酵培养基中，37。C发酵24h，分别取800 发酵液，与MOnL黄曲霉毒素B1 (500吗/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置 于37 X:培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1, v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，53-2的发酵液在37'C与AFBl培养72h，对毒素的降解
12率达到74.83 %。
5) 利用本发明实施例l筛选得到的活性细菌51-4降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株51-4接种到发酵培养基中，37。C发酵24h,分别取800iiL 发酵液，与200 pL黄曲霉毒素B1 ( 500昭/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置 于37 'C培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1， v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算
(l-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，51-4的发酵液在37'C与AFBl培养72h,对毒素的降解 率达到80.93 %。
6) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌47-1降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株47-l接种到发酵培养基中，37'C发酵24h,分别取800 pL 发酵液，与200iliL黄曲霉毒素B1 (500|ig/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置 于37 'C培养箱培养72h。
反应结東后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1， v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，47-l的发酵液在37X:与AFBl培养72h,对毒素的降解 率达到75.92%。
7) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌B3降解黄曲霉毒素
Bl:将菌株B3接种到发酵培养基中，37X:发酵35h,分别取800 pL发 酵液，与200 pL黄曲霉毒素B1 (500昭/kg)置于灭菌的青霉素小瓶 中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置于 37 'C培养箱培养72h。
反应结東后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50%的甲醇水溶液(1:1, v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20)iL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，B3的发酵液在37'C与AFB1培养72 h,对毒素的降解 率达到77.57%。
8) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌S2降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株S2接种到发酵培养基中，37t:发酵35h,分别取800 pL发 酵液，与200 pL黄曲霉毒素B1 ( 500昭/kg)置于灭菌的青霉素小瓶 中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置于 37 'C培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温 下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1, v/v)溶解残余物，混匀后用 于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算
(1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100%
结果表明，S2的发酵液在37'C与AFB1培养72 h,对毒素的降解 率达到78.10%。
9) 利用本发明实施例1筛选得到的活性细菌W3降解黄曲霉毒素
Bl:
将菌株W3接种到发酵培养基中，37'C发酵24 h,分别取800 发酵液，与200jiL黄曲霉毒素B1 ( 500吗/kg)置于灭菌的青霉素小 瓶中，以不接菌的发酵培养基加黄曲霉毒素B1作为空白对照，将其置于37 'C培养箱培养72h。
反应结束后，反应体系用等体积的氯仿萃取三次，取氯仿层室温
下氮气挥干，用50 %的甲醇水溶液(1:1, v/v)溶解残余物，混匀后用
于高效液相色谱分析。上样量20pL。毒素降解率按照如下公式计算: (1-处理后AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)x 100% 结果表明，W3的发酵液在37'C与AFBl培养72h,对毒素的降解
率达到76.83%。
实验例2
本发明实施例2筛选得到的活性细菌降解黄曲霉毒素B1:
利用与实验例1类似的方法对筛选得到的活性细菌进行测试，结 果表明，将其发酵液在37'C与AFB1培养72 h,对毒素的降解率大约 在68.76 -90.66 %。 实验例3
本发明实施例3筛选得到的活性细菌降解黄曲霉毒素B1:
利用与实验例l类似的方法对筛选得到的活性细菌进行测试，结 果表明，将其发酵液在37'C与AFB1培养72 h,对毒素的降解率大约 在70.49-88.53 %。 实验例4
本发明实施例4筛选得到的活性细菌降解黄曲霉毒素B1:
利用与实验例1类似的方法对筛选得到的活性细菌进行测试，结 果表明，将其发酵液在37'C与AFB1培养72 h，对毒素的降解率大约 在63.60-82.92 %。
权利要求
1、香豆素在筛选降解黄曲霉毒素B 1细菌中的应用。
2、 一种筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特征在于，该方 法使用香豆素作为筛选培养基的唯一碳源，培养样品，最后筛选得到 能降解黄曲霉毒素B1细菌。
3、 如权利要求2所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特 征在于，所述筛选培养基是以香豆素为唯一碳源，添加硝酸铵，氯化 钙，琼脂，制成的贫瘠培养基，pH调整为中性。
4、 如权利要求3所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特 征在于，所述贫瘠培养基配方为0.1-0.5 gKH2P04, 0.2-2 g NH4N03， 0.1-lgCaCl2， 15-20g琼脂，0.1-2g香豆素。
5、 如权利要求4所述的细菌降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于， 所述贫瘠培养基配方为0.25gKH2PO4， 1.0gNH4NO3， 0.25 g CaCl2, 17g琼脂，l.Og香豆素。
6、 如权利要求2 5任一项所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的 方法，其特征在于，该方法包括下述步骤1) 制备筛选培养基2) 菌群的稀释将从自然界中收集得到的样品用无菌水溶解， 富集培养，稀释；3) 菌群的涂布将稀释样品涂布于上述培养基制成的固体平板;4) 细菌的纯化分离置于25-30。C生化培养箱培养3-10天，将可 见的不同形态的单菌落挑出，并在如上培养基平板中进行连续三代培 养，最终将可生长的细菌挑出。
7、 如权利要求6所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特 征在于，所述步骤2)菌群的稀释中，将自然界中收集得到的动物粪 便、发霉粮食和饲料、土样和朽木，分别称取lg,磨碎，置于灭菌18 mmxl80mm试管中，加无菌水9mL,用棉塞封口，振荡过夜。
8、 如权利要求6所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特征在于，所述步骤3)菌群的涂布中，吸取上清液lmL,梯度稀释10"、 l(T2、 l(T3、 104、 l(T5，分别取0.2mL各样品溶液，涂布于种子培养基 的平板。
9、 如权利要求6所述的筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，其特 征在于，所述步骤4)细菌的纯化分离中，将上述平板在37 C恒温箱 培养3-10天，将能够生长的菌落逐一挑出，在新鲜的种子培养基平板 上划线纯化，分别编号并转接至肉汤培养基斜面保存；将上述分离纯 化的菌株用灭菌竹签接于装有香豆素溶液的灭菌36孔接种器中，然 后接种于香豆素培养基平板，将其置于37。C培养箱中培养一周，观察 菌株的生长情况。为避免细菌在原环境中的碳源干扰，挑取有生长现 象的菌株，在初筛培养基平板上进行连续三代培养，将能够在香豆素 培养基上生长的细菌挑出，保存于斜面。
全文摘要
本发明涉及一种筛选降解黄曲霉毒素B1细菌的方法，该方法使用香豆素作为筛选培养基的唯一碳源，培养样品，最后筛选得到能降解黄曲霉毒素B1细菌。本发明筛选方法不用接触黄曲霉毒素剧毒物质，就能筛选出能降解毒素的细菌，特异性强，筛选效率高，价格低廉，准确性强，适用于大规模筛选降解黄曲霉毒素B1细菌。
文档编号C12N1/20GK101580810SQ20091008759
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月24日 优先权日2009年6月24日
发明者舒 关, 李俊霞, 梁志宏, 牛天贵, 宁 王, 成 计, 赵丽红, 马秋刚 申请人:中国农业大学