专利名称：一种产l-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产L-苹果酸的基因工 程菌，以及该基因工程菌的构建方法和用途，特别涉及利用基因工程 技术对生产L-苹果酸涉及的关键酶进行改造，提高L-苹果酸发酵水平。
背景技术：
L-苹果酸主要应用于食品工业，它是一种优良的酸味剂和保鲜 剂。在各种果酒，乳酸菌发酵饮料，人造奶油中添加L-苹果酸可最 大限度保持天然果汁的风味。L-苹果酸酸味刺激较为缓慢，且保留时 间长，酸味比柠檬酸强20%，其与合成甜味剂一起使用还可消除后苦 味，因而越来越为消费者所喜爱，L-苹果酸和柠檬酸按合适比例添加 到果汁中，可以使果汁更加接近于天然风味。
L-苹果酸是三羧酸循环(TCA)的重要中间代谢物，可直接参与 人体的代谢，可用于辅助治疗贫血，肝功能不全和肝衰竭等疾病，因 此在医药工业上也有重要的应用价值。
L-苹果酸在细胞能量产生过程中发挥着重要的作用，L苹果酸能 诱导皮肤细胞的分裂，改善皮肤组织的生长，因而还可以用于化妆品 工业。
由于L-苹果酸的诸多优良特性，使其成为具有巨大应用前景的 功能性食品添加剂，医药原料药。
现有的L-苹果酸生产技术主要有固定化细胞生物转化法，生物 酶法，化学合成法，微生物发酵法等，其中微生物发酵法最具应用前 景。固定化细胞(酶)法生产工艺转化率比较低，生产流程长，转化 液中产物含量不高，后提取成本较高。且生物酶转化法使用的前体物质富马酸盐的用量大，原料来源窄。化学合成的苹果酸存在D-型和 L-型两种旋光异构体，需要拆分，成本高，工艺复杂，技术难度大， 设备昂贵，收率低，并且还存在废弃物污染问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种基因工程菌，其无富马
酸酶(FumC)活性，从而使其L-苹果酸的产量得到提高。
本发明的另一个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，通过 基因工程改造，使其代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累 目的产物L-苹果酸。
本发明的再一个目的是通过微生物大规模发酵L-苹果酸，以降 低L-苹果酸的生产成本。
为实现本发明的第一个目的，本发明提供一种产L-苹果酸的基 因工程菌，其出发菌为产琥珀酸的菌，所述菌株的富马酸酶基因 (/wmC)突变，不具备富马酸酶活性。这种突变可以是移码突变、 缺失突变、碱基替换或者插入突变等等，不论何种方法，其最终导致 的结果是使该菌丧失富马酸酶活性。优选使/"mC基因缺失。
为进一步提高L-苹果酸的产率，本发明利用苹果酸脱氢酶 (MDH)表达盒替换富马酸酶基因。所述表达盒优选由该菌内源性 启动子与苹果酸脱氢酶基因构成，更优选所述内源性启动子为磷酸烯
醇式丙酮酸羧激酶基因(pwd:)的启动子。
本发明产琥珀酸的菌可以是放线菌，也可以是产琥珀酸厌氧螺菌 (v4"flera6/os/ zW〃, swc"'"/一rac/wcem)以及大肠杆菌(5!sc/zm'c/ /" co//)，或上述的基因工程改造菌。
此外，还可以通过亚硝基胍(NTG)对出发菌进行诱变，经含单 氟乙酸钠(SMF)的平板培养基(MB)筛选，获得SMF抗性菌株， 这种抗性菌株的PEPCK酶活性得到了显著提高，以这种菌作为出发 菌可以进一步提高L-苹果酸的产率。
5为实现本发明的第二个目的，本发明提供一种构建上述菌株的方
法，包括构建/wmC打靶载体，导入出发菌，使/wmC产生灭活性突
变。如前所述，这种灭活性突变可以是移码突变、缺失突变、碱基替
换或者插入突变等致使的FumC的活性丧失。
此外，还可以利用打靶载体将富马酸酶基因/"mC替换为苹果酸 脱氢酶表达盒。这种表达盒优选采用该菌的内源性启动子，例如使用 / epcA:基因的启动子。
使用本发明构建的基因工程菌进行L-苹果酸发酵表明，与出发 菌相比其L-苹果酸的产量显著提高，这表明本发明菌株可广泛应用 于L-苹果酸的生产。
本发明充分考察L-苹果酸涉及的关键酶，对其进行改造，构建 得到基因工程菌，这些关键酶包括酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、 苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(Fumarase， FumC )。本发明将 /wmC进行灭活性突变，由于FumC的丧失，致使代谢流在苹果酸向 富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸；将在m^前加上 内源p印cA:基因的启动子使代谢流偏向苹果酸生成；此外，通过单氟 乙酸钠(Sodium Monofluroacetate, SMF)诱导，使得PEPCK活性增 强，并使产物反馈抑制大为减弱。将本发明菌株应用于L-苹果酸的 发酵生产，能显著提高L-苹果酸产量，所用技术简单，效果明显， 投入成本低，能够满足巿场需求。同时还能大量固定大气中的C02, 在一定程度上减轻全球范围内的温室气体效应。
图1显示的是细胞内琥珀酸代谢流程图； 图2显示的是重组载体FY-fmr-Kan-fmr构建过程； 图3显示的是FY-vfinr-proA-mdh-fmr载体构建过程； 图4显示的是PCR扩增的两端带fmr同源片段的卡那霉素片段 的凝胶电泳图；图5显示的是PCR法对重组子鉴定，其中1、 2和3为3个不同 的阳性克隆；
图6显示的是FY-finr-Kan-fmr质粒的双酶切验证； 图7显示的是PCR扩增的proA-mdh片段的凝胶电泳图； 图8显示的是质粒FY-fmr-proA-mdh-fmr酶切验证； 图9显示的是AS-FY10菌株1L摇瓶发酵试验中，甲酸、乙酸、
富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；
图10显示的是AS-FY-Rec菌株1L摇瓶发酵试验中，乙酸、富
马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；
图11显示的是AS-FY10菌株5L发酵罐试验中，甲酸、乙酸、
丁二酸和苹果酸的含量情况；
图12显示的是AS-FY-Rec工程菌5L摇瓶发酵试验中，甲酸、 乙酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；
图13显示的是FY-SMFll在1L摇瓶中发酵实验中，甲酸、乙 酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况。
图14显示的是产丁二酸菌Mannheinia succinniciproducens摇瓶 中发酵实验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况。
图15显示的是产丁二酸菌Mannheinia succinniciproducens重组 子MSll摇瓶中发酵实验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸 的含量情况。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
本发明对产琥珀酸的放线菌Xc//woZ>ac///wswccz'"/cz;pra^cms等均作了基因工程改造，结果发现将/wmC缺失后 能够显著提高L-苹果酸的产量，特别是将在前加上内源 基因的启动子替换/"mC， L-苹果酸的产量得到了进一步提高。以下 以放线菌(Jc""oZ)ac/〃ws wcc/"ogewes)为例具体说明本发明的内容。 在以下实施例中所涉及到的PCR引物如表1所示。 表l实施例中所涉及到的PCR引物
引物名称
KanF
KanR
序列
5,77]47T7TA4GC:TGCCA4CC掘rC7TCCGa4CG^4CCC4r 7X4rca4A4rATCGATCTGACCCGCC AAAA ACCT 3 ，斜体
碱基取自富马酸编码基因5'端的前50个碱基 5，爿ra4C47TTC G7^rr04X4 A404C4CX4r GGGC04GG7T
C4v4G7T CCrGCGGHTGTGCCTTT ACAACTTATG AGTATG3'斜体碱基取自富马酸编码基因3'端的前55个碱
T7promotcr primer(Promega)
SP6 promoter primer(Promega)
proAF
proAR
5， TAATACGACTCACTATAGGG 3' 5， TATTTAGGTGACACTATAG 3'
rZ4rC04^4rAATTAAAGAAATTAGCCCTGCG 3'斜体碱基 取自取自富马酸编码基因5'端的前50个碱基
5， rU7TC47TG04^窗rCC(7CGG7UGCCGCC47^GCC4G TAAGTCATTAAGTTCTTTTAACG 3,斜体部分为重复序列
pmdhA
'ATGAAAGTAACCTTATTAGGCGCC 3,
5， ^m4C47TrC GZ47TG厕^404CHGGGC04GGTr pmdhR C4爿GrrCCrGCGG，AGCAACACCGCCGAACATGTTATC
3'斜体碱基取自富马酸编码基因3，端的前55个碱基。
8实施例l SMF抗性菌株的筛选
取新宰杀的牛瘤胃，厌氧培养法富集微生物，经进平板初筛，摇 瓶复筛，获得一株产丁二酸菌。之后经形态学、生理生化及16SrRNA 鉴定，确定该筛得的菌株属于产丁二酸放线杆菌G4"/"o6ac///^ wcc/"oge"ay),该放线菌命名为AS-FY10 。
平板挑取AS-FY10单菌落，活化富集培养1-2次，在特定液体 培养基(MA)中培养，37。C在充满CO2条件下于250ml三角瓶(带 橡皮塞)轻微摇晃培养1-4天至对数期，将处于对数生长期AS-FY10 细胞离心(8000g，20min)，用0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤两次， 然后将细胞振荡打散，将打散的细胞悬浮于0.1mol/L磷酸缓冲液 (pH7.0)中，其中含有0.2mg/mL的NTG,在37"C， 250rpm下振荡处 理20min。取10mL处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀 释10倍中止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入 含有下列成分的液体培养基中TSB20g/L，酵母膏5g/L, CSL5g/L， Na2HP04'12H20 8g/L， NaH2P04'2H20 3g/L, pH7.2,培养24h后稀释 涂布于特定含SMF的MB平板，置于100% C02环境中37。C厌氧培 养3 7d,挑取在SMF平板上生长的菌落并培养，然后分别测定 PCEPCK酶比活性，共得到5株PCEPCK酶比活性提高的菌株，将 其中 一株PCEPCK酶比活性最高的菌株命名为FY-SMF11 。每升特定 MA液体培养基含有以下成分葡萄糖10.0g,碳酸氢钠10.0g，酵母 粉5.0g, NaH2PO4 H2O8.0g，K2HPO416.0g, pH调6.5,灭菌，葡萄糖 单灭；每升特定MB平板培养基含有以下成分葡萄糖7.5g,碳酸氢 钠7.0g，酵母粉5.5g， NaH2P04*H20 6.5g, K2HP04 11.5g，琼脂ll.Og, 生物素0.3g, SMF4.5g, pH6.5，葡萄糖单灭。
实施例2重组质粒的转化、重组子條选
1重组质粒FY-fmr-Kan-fmr的构建
以pCR2.1 (invitrogen)为模板，用引物Kan F和Kan R (见表1 )扩增卡那霉素抗性基因，p/"作聚合酶，PCR反应总体积为50pl反应
条件94。C预变性5min， 94。C变性lmin， 55。C退火40sec, 72。C延伸 2min，共30个循环，最后72。C延伸10min，添加普通ra《酶后继续 保温10min。电泳分析条带大小l.Okb,与预期大小相符(图4)用上 海生物工程有限公司试剂盒纯化PCR产物(具体方法参见说明书)， 产物与pGEM-T vector (invitrogen)用T4 DNA连接酶(Takara公司 产品)4"C连接过夜。转化大肠杆菌DH5(x，挑选阳性克隆，通用引 物PCR验证、酶切验证(图5，图6),并测序。 2重组质粒FY-fmr-proA-mdh-fmr的构建
提取AS-FY10全基因组DNA,并以此为模板，扩增片段， 以扩增到的片段和GeneBank中已发表的m^z序列做比对，发现同源 性为99.9%。用扩增片段做全基因组BLAST,找到mW上游启动子 序列，经软件分析，具有启动子的一般特性。分别用三轮PCR，得到 -fmr-proA-mdh-fmr-片段用引物proAF和proAR扩增； e/ cA:编码序 列起始密码子ATG前300个碱基片段，再用引物pmdhA和pmdhR 引物扩增w^编码基因，大小1242bp。其中，proAR和pmdhA具有 40bp相同序列的重叠区域，分别用试剂盒纯化两个PCR产物，按合 适比例混合两纯化后的PCR产物，在50jal反应体系中进行如下反 应94。C预变性5min,进入循环，94。C 30sec, 56°C lmin， 72°C 2min， 5个循环，最后72'C保持5min。反应结東后电泳，并用胶回收试剂 盒纯化，以得到的产物为模板，再用引物proAF和pmdhR进行扩增， 得到proA-mdh片段，大小1.5Kb(图7),其中proAF和pmdhR引物5， 端分别含有富马酸酶编码基因5'端的前50碱基和3'端的后55个 碱基，见表l。将得到的片段连到pGEM-T载体中，转化DH5a感受 态细胞，通用引物T7 Promter和SP6 promoter PCR验证、酶切验证 (图8 )并测序，得到的重组载体命名为FY-fmr-proA-mdh-fmr。 3重组质粒的转化的特定MA液体培养基 中于37。C充满C02环境中静止或轻微摇晃培养16-30h， fC下4000g 离心10min收集菌体，按分子克隆(第三版)方法制备感受态细胞， 或按以下方法制备离心收集到的菌体用8ml冰冷的15%甘油溶液洗 涤两次，再次离心，沉淀用0.2mll5。/。冰冷甘油溶液重悬，置于冰上； 取50jiil菌悬液与l!il冰预冷的FY-fmr-Kan-fmr质粒混合，置于电击 转化杯中(Bio-Rad公司产品)电击转化；迅速将电击过的菌液吸取 转移到冰预冷1.5mlEP管中，加入900^1冰预冷冰预MA培养基，厌 氧培养2h,然后取适量涂布到特定平板筛选培养基(MK)中，每升 MK平板筛选培养基含有以下成分葡萄糖7.5g,碳酸氢钠7.0g，酵 母粉5.5g,富马酸钠6.0g， NaH2P04*H20 6.5g, K2HP04 11.5g,琼脂 ll.Og， SMF0.8g,卡那霉素35.0g,生物素0.3g/L。培养5天后，长 出的菌落经培养、提取基因组DNA, PCR验证。重组子命名为 AS-FY12。同样办法转化FY-fmr-proA-mdh-fmr质粒，卡那霉素负筛 (影印法)，PCR验证，保存，最终重组子命名为AS-FY-Rec。
实施例3 PEPCE及MDH酶活测定
1粗酶液制备
在37。C下，AS-FY10和AS-FY-Rec在032厌氧条件下培养24 小时，取lmL菌悬液，离心获得菌体，用pH7.5, 0.1mmol/L磷酸盐 缓冲液稀释至10mL,冰浴超声破碎10min,然后在10000rpm下冷冻 离心15min,所得上清即为粗酶液。 2 PCEPCK酶活力测定
取两只比色皿，在其中一个中加入2.3mLpH7.5, 0.1mol/L磷酸 盐缓冲液，之后依次加入50mmol/L MnCl2， 0.5mmol/L NaHC03， 0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸钠，50mmol/L ADP， 5mmol/L NADH 溶液各O.lml,对照比色皿加入3mL磷酸盐缓冲液。将两只比色皿置 于25。C保温2min,迅速加入O.lml 500u/mL苹果酸脱氢酶纯酶液与适量粗酶液，启动反应；在3min内，在340nm处，每30s以对照比 色皿调零，记录吸光度值，计算各时间段内吸光度降低值AA。并以 下式计算酶活力。
本发明中PEPCK酶活力定义为每分钟间接消耗1 nmolNADH 量所需的酶量，计算式如下<formula>formula see original document page 12</formula>
酶比活力为每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位为u/mg,计算 如下
<formula>formula see original document page 12</formula>
式中，AA为340nm处吸光度的变化值；V为比色皿中酶促反 应的体积，3mL; s为NADH表观摩尔消光系数，6.22 x 103; b为比 色皿光程，lcm; At为时间间隔，3min; n为稀释倍数，n=3000/x， x为向反应皿内加入的粗酶液体积，单位为pL; C为比色皿中酶蛋 白质量浓度，单位为mg/mL。 3 MDH活力测定
取两只比色皿，在其中一个中加入2.6mLpH7.4， 0.2mol/L磷酸 盐缓冲液，之后依次加入0.2mol/L草酰乙酸，0.15mol/LNADH溶液 各O.lml，对照比色皿加入3mL磷酸盐缓冲液。将两只比色皿置于 25。C保温2min,迅速加入O.lml适当稀释的粗酶液，启动反应；在 3min内，在340nm处，每30s以对照比色皿调零，记录吸光度值， 计算各时间段内吸光度降低值△ A。并以下式计算酶活力。
本发明中MDH酶活力定义为每分钟直接消耗lpmol NADH 量所需的酶量，计算式如下<formula>formula see original document page 12</formula>酶比活力为每亳克酶蛋白所具有的酶活力，单位为u/mg，计算 如下
酶比活力- ~~^——xio3 f XA乂4 t乂c
式中，AA为340nm处吸光度的变化值；V为比色皿中酶促反 应的体积，3mL; s为NADH表观摩尔消光系数，6.22 x 103; b为比 色皿光程，lcm; At为时间间隔，3min; n为稀释倍数，n=3000/x, x为向反应皿内加入的粗酶液体积，单位为yL; C为比色皿中酶蛋 白质量浓度，单位为mg/mL。
将出发菌AS-FY10和重组菌AS-FY-Rec在摇瓶中培养到对数期， 按上述方法测定PEPCK和MDH的比活力，结果如表2所示。
表2 AS-FY10和AS-FY-Rec对数生长期PEPCK和MDH比活力比较
菌株PEPCKMDH
AS-FY101124u/mL794u/mL
AS-FY-Rec1524u/mL978u/mL
表2中数据说明，AS-FY-Rec比AS-FY-10其PEPCK酶比活升 高，从1124 u/mL升高到1524 u/mL;而AS-FY-Rec比AS-FY-10的 MDH酶比活也升高，从794u/mL升高到978u/mL 。从后面结果来看， 合成苹果酸两个关键酶比活力的增高是苹果酸合成增加的原因。
实施例4 1L摇瓶发酵及5L发酵罐发酵试验
1 1L摇瓶发酵验证
挑取AS-FY-Rec和AS-FY10单菌落，AS-FY10为对照菌，接种 于种子培养基中(成分葡萄糖9.5g/L，碳酸氢钠10.0g/L，富马酸 钠6.0g/L,酵母粉5.5g/L， NaH2P04*H20 8.0g/L, K2HPO415.0g/L，生物 素0.3g/L, pH调6.5，葡萄糖单灭)，接种量8%,装液量150ml。在充满C02环境下于37。C， 150rpm摇床发酵100h,从第10小时开始， 期间每隔10小时取样一次，液相测乙酸，甲酸，丁二酸和苹果酸含 量。结果如图(9)和图(10)所示，说明经过SMF诱变和基因改造 的工程菌株能够明显提高L-苹果酸的含量和降低其它杂酸的含量。 2 5L发酵罐发酵验证
挑取AS-FY-Rec和AS-FY10单菌落，AS-FY10为对照菌，接种 于种子培养基，种子培养(同上述1L摇瓶发酵中的种子培养)16-30h 后按8。/。接种量接种到5L发酵罐中，总发酵体积3.0L，发酵温度37'C， 钢瓶通C02维持厌氧环境，发酵培养基成分淀粉糖质原料75.0g/L， 玉米浆50.0g/L，无机氮源30.0g/L，酵母膏15.0g/L,富马酸钠6.0g/L， NaH2P04*H20 15.0g/L， K2HPO420.0g/L，生物素4.5g/L。发酵过程中 以Ca(OH)2乳液维持pH在6.5。发酵24小时后开始补料，补料成分 淀粉糖质原料250.0g/L,玉米浆175.0g/L，无机氮源50.0g/L，酵母膏 30.0g/L,富马酸钠6.0g/L，NaH2PO4*H2O45.0g/L,K2HPO455.0g/L,生 物素5.0g/L。发酵自第IO小时开始取样，每10小时取样一次，发酵 结果如图(11)和图(12)。重组菌株在第60小时左右产L-苹果酸的量达 到最大。由于发酵液中检测到的丁二酸含量很低，所以在图中省略。 可以看出，构建的工程菌株明显提高了 L-苹果酸的产量和降低了丁 二酸的含量，具备了工业化生产的能力。
实施例5 FY-SMF11在1L摇瓶中发酵实验
挑取FY-SMF11单菌落，接种于种子培养基中(成分葡萄糖 9.5g/L，碳酸氢钠10.0g/L，富马酸钠6.0g/L，酵母粉5.5g/L， NaH2P04 H20 8.0g/L， K2HPO415.0g/L，生物素0.3g/L， pH调6.5，葡 萄糖单灭)，接种量8%，装液量150ml。在充满C02环境下于37'C, 100-180rpm摇床发酵100h，从第12小时开始，期间每隔10小时取 样一次，液相测乙酸，甲酸，丁二酸和苹果酸含量。结果如图(13) 所示，说明与野生型AS-FY10相比，经过SMF诱变菌株FY-SMFll
14合成L-苹果酸增加。
实施例6
用上述实施例1 5类似的方法，对琥珀酸放线杆菌(^"/"o6ac/〃M wcc/"ogewaO CGMCC 1593进行处理。结果，SMF抗性菌株的筛选 获得4株PCEPCK酶比活性提高的菌株；转化重组质粒 FY-fmr-proA-mdh-fhir,获得重组子，PEPCE及MDH酶活测定表明 与出发菌相比，这两者的酶活均提高了约25%;摇瓶发酵表明其取得 了与实施例4和5类似的结果。
实施例7 产丁二酸菌(Aftf/mA&附/tf s"c"Vi/'"》/Y^/"cms) fumC基因
缺失对L-苹果酸产量的影响
利用常规PCR技术和基因重组技术，具体方法参照实施例2，使 用引物KanFl 5Mr04C4GCG7TrCGZ4rra4A4^404Z4C7MrGG
GTG^G7^C4GGr7TCrGC4G扁A4ATCGATCTGACCCGCCAAA AACCT3，(斜体碱基取自富马酸编码基因5'端的前60个碱基)和Kan Rl 5，度7TC4v4GCnC^4CCrCGGC4GGnC4CCC477TGTC 04v4GrC7TCGGCr0^4CTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATG 3 ，(斜 体碱基取自富马酸编码基因3，端的前60个碱基)扩增含有卡那霉素抗 性基因片段。然后使用含有卡那霉素抗性基因片段转化产丁二酸菌 Mannheimia succiniciproducens。转化方法参照实施例2中的重组质粒 的转化。最终得到fomC基因缺失的重组子MSll。在l升摇瓶中进 行发酵产丁二酸实验(发酵方法参照实施例4)，实验结果见图14和 图15。实验结果表明与野生产丁二酸菌Mannheimia succiniciproducens相比，重组子MS11产苹果酸明显增加。
SEQ IDN0.1和2分别为编码苹果酸脱氢酶和编码富马酸酶的核苦酸序列， SEQ ID N0.3和4分别为苹果酸脱氢酶和编码富马酸酶的氨基酸序列，SEQ ID N0.5-12分别是引物Kan F、 Kan R、 T7promoter 、 primer(Promega) 、 SP6 promoter primer(Promega)、 proAF、 proAR、 pmdhA、 pmdhR、 KanFl和KanRl。
序列说明:序列表
<110>安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
<120> —种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用
〈130〉 KHP09112565.9
<160> 14
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
〈211〉 1242 〈212〉醒 <213>放线菌
<400> 1
ccttattaggcgccagcggcggtatcggtcaacctctttcattgttgtta60
ttccggcagaaagcgsttta3gCtt3t3Cgatgttgcgccggtcaccccc120
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ttaaaatccgccgtttgatt朋tggg朋gctttagtattt1080
aaaatagcgtagt犯tcctccacgcgtcttctca肌tgtat犯肌agtgc1140
taatcgattttttattcatcctcgtttcttggcggtUaatcgccagt犯1200
attacattttaacttactgat肌catgttcggcggtgttgct1242
〈210> 2 <211> 1395<212> DNA <213〉放线菌 〈400〉 2
atgacatttcgtattgaaaaagacactatg ggcgaggttc aagttcctgc60
tgggccgcac犯acgg肌cgttcacgcaat aactttaaaa tcggacctgcagcgtcaiatg120
ttattgaagcattcggttat ttgaaaaaag cggccgcttatgccaacgcg180
g3tttaggcgtattgccggctgaaa肌cgc gatttgatcg cacaagcctg cgatg肌att240
ctggctcgtaaattagatgatcaattcccg ttagttatct ggcaaaccggttcgggtacet300
caatccaatatgaatctgaacgaagttatc gctaaccgcg cacatgtgatt犯cggtggt360
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ttcagcggttatgctgcacaattaagtttc ggtttagcgg caatcaaaaataccttaccg660
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aacttaggtttagtgtccgccgaagatttc gataaatggg ttcgtccgga agatatggtt1380
ggcagctt肌1395
<210> 3 〈211> 464 <212> PRT 〈213〉放线菌 <400> 3
Met Thr Phe Arg lie Glu Lys Asp Thr Met Gly Glu Val Gin Val Pro 15 10 15
Ala Asp Lys Tyr Trp Ala Ala Gin Thr Glu Arg Ser Arg Asn Asn Phe 20 25 30
17Lys lie Gly Pro Ala Ala Ser Met Pro His Glu 35 Leu
Gly Tyr 50
Leu Pro Ala Glu 65
Leu Ala
Lys Lys Ala
Lys Lys
Met 40
Ala Tyr Ala Asn
Ala 55
Asp Leu lie Ala
Gly Ser Arg Al3
Arg Gly
Lys
Thr 100
Val
Arg 70
Asp Asp Gin Phe
lie lie Glu Ala Phe 45
Ala Asp Leu Gly Val 60
Ala Cys
Leu 85
Gin Ser Asn Met
His 115
Asn Asp Asp Val
His Pro 130
Pro Thr Ala Met His 145
lie Pro Ala lie
lie Asn Gly Gly 120 Lys
Asn 135 Ala
lie 150
Arg Leu Gin
Gin Ala Cys Asp Glu lie 75 80 Pro Leu Val lie Trp Gin Thr 90 95 Asn Leu Asn Glu Val lie Ala Asn 105 110 Lys Leu Gly Glu Lys Ser lie lie 125
Ser Gin Ser Ser Asn Asp Thr Tyr 140
Val Val
Thr Tyr Lys
Glu Phe Lys Asp 180 Thr
Glu 165
Val Val Lys lie
Tyr Lys
Thr Pro Leu 195
Gly Leu Ala Ala
Ser Phe 210
Leu Ala Leu Gly Gly 225
Gly Tyr Asp Val
力u Gly Gin Glu 200
Lys Asn Thr Leu
Lys Val Val Glu Ala Thr 155 160 Thr Leu Ala Ala Lys Ser Glu 170 175 Gly Arg Thr His Leu Met Asp Ala 185 190 Phe Ser Gly Tyr Ala Ala Gin Leu
lie 215 Ala
Thr 230
Val Ala Glu
Val Gly Thr
Lys 245
Ala Glu Asn Lys
Pro Phe lie Thr 260
Glu Thr His Gly
Ala lie Val 275
lie Ala Asn Asp
Gly
Tyr
Phe 265 Leu
lie 250 Glu
Phe Lys 290 Gly lie 305
Met Pro
Gly Glu lie Gly
lie 295 lie
Ala 280
Arg Leu Leu Ala
Tyr Ala 205
Pro His Leu Arg Gin 220
Gly Leu Asn Thr Pro Lys 235 240 Ala Lys Phe Thr Gly Leu 255
Ala Leu Ala Thr His Asp 270
Met Ser Leu
Lys
Val 325
Leu 310
Asn Pro Thr Gin
Lys Gin Val Ala 285
Ser Gly Pro Arg Ser 300
Pro Gly
Pro Glu Asn Glu 315
Cys Glu Ala Met 330
Ser Ser lie 320
Thr Met Val 335Ala Ala Gin Val Leu Gly Asn Asp Thr Thr lie Ser Phe Ala Gly Ser
340 345 350
Gin Gly His Phe Glu Leu Asn Val Phe Lys Pro Val Met Ala Ala Asn 355 360
Gin Ser Ala Gin Leu lie
Phe Leu Gin Ser Ala Gin Leu 370 375
Glu His Cys Ala Ser Gly lie Lys Pro Asn 385 390
Leu Leu Glu Ser Ser Leu Met Leu Val
Lys Pro Val Ala Asp Val
Met 365
lie Ser Phe Asp
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Pro Arg lie Gin
Glu Ser Ser 舰
Gly Tyr Glu Asn Ala Ala Lys lie 420
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Ala Leu Asn Thr
Thr 410
Lys Thr Ala His
Ala 425
Asn Leu Gly Leu
Asp
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Gly
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Ser Ala Glu
Val 445
Gly Ser Leu Lys
<210> 4 〈211> 312 <212> PRT 〈213〉放线菌 <400> 4 Met Lys Val
1
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Leu Leu
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lie
Glu
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Pro 50 Ala
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35
Thr
Thr Leu 5
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Leu Gly Ala Ser Gly Gly lie Gly Gin Pro Leu 10 15 Glu Ser
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Pro 110 Pro
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130 135 140
Gly lie Thr Thr Leu Asp Thr lie Arg Ser Glu Lys Phe lie Val Gin145 150 155 160
Ala Lys Asn lie Glu lie Asn Arg Asn Asp lie Ser Val lie Gly Gly
165 170 175
His Ser Gly Val Thr lie Leu Pro Leu Leu Ser Gin lie Pro His Val
180 185 190
Glu Phe Thr Glu Gin Glu Leu Lys Asp Leu Thr His Arg lie Gin Asn
195 200 205
Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Ala Gly Ser Ala Thr
210 215 220
Leu Ser Met Ala Tyr Ala Ala Met Arg Phe Val Val Ser Met Ala Arg225 230 235 240
Ala Leu Asn Gly Glu Val lie Thr Glu Cys Ala Tyr lie Glu Gly Asp
245 250 255
Gly Lys Phe Ala Arg Phe Phe Ala Gin Pro Val Arg Leu Gly Lys Asn
260 265 270
Gly Val Glu Glu lie Leu Pro Leu Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu Gin
275 280 285
Gin Ala Leu Glu Ala Met Leu Pro Thr Leu Gin Thr Asp lie Asp Asn
290 295 300
Gly Val Lys Phe Val Thr Gly Glu305 310
〈210〉 5<211> 74<212> DNA〈213〉人工序列<400> 5
ttattttaag ctgccaacca tatcttccgg acgaacccat
ttatcgaaat atcgatctga 60
cccgccaaaa sect 74
<210〉 6<211> 81<212> DNA〈213>人工序列<400> 6
atgacatttc gtattgaaaa卿cactatg ggcgaggttc卿ttcctgc ggatactgtg 60cctttacaac ttatgagtat g 81
<210> 7<211> 20<212〉 DNA<213>人工序列〈400〉 7
taatacgact cactataggg
<210> 8<211> 19〈212> DNA<213>人工序列< 8
tatttaggtg acactatag
〈210> 9<211> 72<212> DNA<213〉人工序列〈400〉 9
ttattttaag ctgccaacca tatcttccgg acgaacccat ttatcgaaat aattaaagaa 60attagccctg cg 72
<210> 10
〈211> 63
<212> DNA<213>人工序列
<400〉 10
tactUcatt ggaat犯tcc gcggtcgccg ccatagccag taagtcatta agttctttta 60acg 63<210> 11〈211> 24<212> DNA<213> 人工序列<400> 11
atgaaagtaa ccttattagg cgcc 24
<210> 12<211〉 79〈212〉 廳<213>人工序列<400> 12atgacatttccaccgccg犯
gtattgaaaa agacactatg ggcgaggttc aagttcctgc ggataagcaa 60catgttatc 79
<210> 13
<211〉 84
<212> DNA
〈213〉 aa
〈400〉 13
3tg3C3gCgt
atcgatctga
ttcgtattga aaaagatact atgggtgaag tgcaggttcc tgcagataaa 60cccgcc肪aa acct 84
<210> 14
<211> 86
<212> DNA
〈213> aa
<400> 14
t3tttC33gCCtgtgCCttt
taccaaccat atcggcaggt accacccatt tgtcgaagtc ttcggctgaa 60acaacttatg agtatg 86
2权利要求
1、一种产L-苹果酸的基因工程菌，其出发菌为产琥珀酸的菌，其特征在于，所述菌株的富马酸酶基因突变，不具备富马酸酶活性。
2、 如权利要求1所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述突变为缺失突变。
3、 如权利要求2所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述缺失突变是富马酸酶基因替换为苹果酸脱氢酶表达盒。
4、 如权利要求3所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶表达盒是由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基 因构成。
5、 如权利要求4所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述内源性启动子为磷酸燔醇式丙酮酸羧激酶的启动子。
6、 如权利要求1 5任一项所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌为产琥珀酸的放线菌。
7、 如权利要求6所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于 所述出发菌为抗单氟乙酸钠产琥珀酸的放线菌。
8、 一种构建权利要求1 7任一所述产L-苹果酸的基因工程菌的 方法，其包括构建富马酸酶基因打靶载体，导入出发菌，使富马酸酶 基因产生灭活性突变。
9、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述灭活性突变是 将富马酸酶基因缺失。
10、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述灭活性突变是 将富马酸酶基因替换为苹果酸脱氢酶表达盒。
11、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶 表达盒是由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基因构成。
12、 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述内源性启动 子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的启动子。
13、 权利要求1 7任一项所述基因工程菌在制备L-苹果酸中的 应用。
14、 一种制备L-苹果酸的方法，其以权利要求1 7任一项所述 基因工程菌进行发酵生产L-苹果酸。
全文摘要
本发明提供了一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法。本发明通过对L-苹果酸涉及的关键酶酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(FumC)进行改造，构建得到基因工程菌。本发明将fumC进行灭活性突变，致使代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸；将在mdh前加上内源pepck基因的启动子使代谢流偏向苹果酸生成；此外，通过单氟乙酸钠诱导，使得PEPCK活性增强，并使产物反馈抑制大为减弱。将本发明菌株应用于L-苹果酸的发酵生产，能显著提高L-苹果酸产量，所用技术简单，效果明显，投入成本低，能够满足市场需求。
文档编号C12N1/20GK101649300SQ20091009204
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者斌 徐, 李荣杰, 段绪果, 薛培俭 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司