专利名称：一种制备超低分子量肝素的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备超低分子量肝素的方法。
背景技术：
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重复单位的线形链状结构，其分子量在3000-37000之间，平均分子量为15000。自1916年首次发现肝素以来，其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。
低分子量肝素(简称LMWH)(Robert J.Linhardt，PH.D.And Nur SibelGuany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约为普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWHs的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。
超低分子量肝素(Ultra Low Molecular Weight Heparin，以下简称uLMWH)的概念，虽没有明确的定义，但应是指二糖以上而低于低分子量肝素平均分子量的一系列寡糖(数均分子量在2500以下)，超低分子量肝素尽管具有很高的抗Xa因子活性，但其抗IIa因子活性却很低。人们还发现，一些包括二糖在内的寡糖也有某些生理活性。
Maetzke等(Maetzke J，Hinrichs R，Schneider L A.et.al.Unexpecteddelayed-type hypersensitivity skin reaction to theultra-low-molecular-weight heparin fondarinux.Allergy.2005，60413-415)发现某些患者使用了肝素和LMWH后会出现延迟型超过敏症状。如一位59岁的老太太在使用nadroparin(用亚硝酸降解法获得的LMWH)三天后出现了局部皮肤瘙痒的反应。而使用超低分子量肝素-fondaparinux却没有引起副反应，该fondaparinux的平均分子量仅有1.7KD。
早期的研究就发现，肝素的出血作用与其抗凝作用并不相关，因为酶解得到的肝素二糖和四糖没有抗凝活性，却同样在破坏正常的止血机制方面有效，据此，人们提出这样的假说，即肝素和肝素片段可以通过平滑肌细胞表面的受体来干扰肌肉强直性痉挛。平滑肌细胞中钙离子浓度的变化在肌肉收缩中起重要作用，钙离子通过细胞膜上的钙离子通道进出细胞。Shijo(Shinjo S，Ivarne L S，Oliverira V，et.al.Heparin and heparan sulfate disaccharides bind to the exchangerinhibitor peptide region of Na+/Ca2+exchanger and reduce the cytosoliccalcium of smmoth muscle cell lines.J.Biol.Chem.2002，22748227-48233)等发现只有肝素和硫酸乙酰肝素的二糖可以与Na+/Ca2+通道相互作用，引起钙离子外泄，从而显著地降低了平滑肌细胞内钙离子浓度(约80％)。肝素二糖和相关寡糖的这一特性可能在治疗心房纤维颤动，心绞痛等方面有应用价值。
肝素二糖还能够抑制NF-(kappa)B细胞激活细胞迁移和调节细胞内信号传导。Hecht等用酶解产生的肝素二糖进行实验，发现三硫酸化二糖能够抑制T-细胞介质的免疫反应，并调节T-细胞、巨噬细胞、肠上皮细胞分泌的肿瘤骨疽因子(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、IL-1B。平行实验表明，低硫酸化肝素二糖则没有表现上述生理功能。因此该类化合物的制备也是值得研究的课题。
目前，LMWH和uLMWH的制备方法(张万忠，王云山，马润宇，苏志国，国生化药物杂志，2001，22(1)48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法，主要有亚硝酸降解法、β-消去降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是，化学裂解肝素反应剧烈，工艺复杂，反应控制难，使得肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏，因而，某些生物活性功能在不同程度被或多或少的破坏。而酶降解法由于反应条件温和、产率高及对环境无毒性，而且反应操作简便、控制容易，成为许多糖生物学研究工作者的研究热点。美国专利(Nielsen，US 5106734，1992)利用235nm处的吸光度值控制产品质量，可制备出具有理想平均分子量的低分子肝素产品。于广利等(于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J.Linhardt，青岛海洋大学学报，2002，32(2)231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解，得到了聚合度2～20的寡糖纯品。高宁国等(高宁国，程秀兰，杨敬，张树政，微生物学报，1999，39(1)64-67)筛选出了一种能产肝素酶的鞘胺醇肝菌，并利用所产生的酶降解肝素，得到了一系列具有抗平滑肌增生活性而抗凝活很低的肝素寡糖。但是，这些方法中所用到的肝素酶需要经过多步的纯化步骤，收率较低，造成酶的成本非常昂贵(加拿大IBEX公司提供的肝素黄肝菌产生的商品肝素酶I价格为$200/0.1IU)，极大地限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。此外，酶法降解肝素过程中，通过控制降解时间等条件，从理论上分析能够制备超低分子量肝素，但至今没有相关的技术研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备超低分子量肝素的方法。
本发明提供的方法，是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到超低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID №1所示；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量是0.4-4.0IU/g肝素，优选是1.6IU/g肝素。
上述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白按照以下方法制备将质粒pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白； 所述质粒pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。
上述肝素来自肝素溶液，肝素在肝素溶液中的浓度为1-100g/L，优选是50g/L。
上述肝素溶液是用如下方法配制的将0.05-5g的肝素加入到50ml含3.5mMCaCl2和200mM NaCl的水中，然后用1M HCl溶液调节pH至7.0。
上述降解的条件是温度10-45℃，时间9-24h。
上述降解的条件可是是如下1)或2)或3)或4)或5)或6) 1)温度是25-35℃，时间是9-24h； 2)温度是30℃，时间是9-24h； 3)温度是30℃，时间是9h； 4)温度是30℃，时间是14h； 5)温度是30℃，时间是19h； 6)温度是30℃，时间是24h
根据不同的要求，可选择不同的反应时间，得到不同分子量的超低分子量肝素。
上述降解在当反应液在235nm下的吸光度为200-280时终止，优选是在吸光度为210-270时终止。
上述降解终止是通过调节pH至2.0来使反应终止的。
上述降解后还包括如下的纯化步骤 1)降解终止时的反应液经过孔径为0.2微米的纤维素膜过滤，得到初滤液； 2)将步骤1)得到的初滤液用截留分子量为3000-5000Da的超滤膜进行过滤，得到次滤液； 3)将步骤2)得到的次滤液与体积是次滤液体积2-3倍的乙醇混合，离心，收沉淀； 4)将步骤3)得到的沉淀用丙酮洗涤，减压蒸干，得到纯化的超低分子量肝素。
任一上述的肝素是指肝素可溶性盐；任一上述的超低分子量肝素是指超低分子量肝素可溶性盐。
本发明所指的超低分子量肝素是指分子量为600-2500Da的超低分子量肝素，具体是指分子量为1852.9-2305.2Da的超低分子量肝素。
本发明的方法采用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备超低分子量肝素，由于麦芽糖结合蛋白具有提高其融合载体蛋白可溶性的能力，因此重组表达MBP-HepA活性很高；从而提高了降解肝素的效率；另一方面本发明的方法可以采用菌体破碎粗酶液来进行反应，在后续工艺中采用过滤及超滤的方法来获得最终产物，因此本反应极大地降低了生产的成本，最终产品重量回收率可以达到90％以上。此外，利用麦芽糖结合蛋白(MBP)的亲和吸附能力，可以很容易实现肝素酶I的定向固定化，使酶的反复使用成为可能，从而提高酶反应效率，降低酶的使用成本；从而进一步降低超低分子量肝素的生产成本。
本发明通过检测235nm处的吸光度值来监测反应的进行程度，从而控制反应时间可以很容易得到分子量分布范围窄的超低分子量肝素。由于MBP-HepA的生产、固定化和使用成本可以大幅度的降低，因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的超低分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。
图1为表达载体pMal-hepA的构建过程示意图。
图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱。
图3为反应过程中235nm处的吸光度随时间的变化曲线图。
图4为融合肝素酶生产uLMWH膜生物反应器示意图。
图5为吸光度为270时终止反应进行过滤纯化处理所得到的超低分子量肝素产品照片。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、麦芽糖结合蛋白-肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)的获取 一、表达MBP-HepA的工程菌的构建 1、含有肝素酶I编码基因的表达载体pMal-hepA的构建 表达载体pMAL-hepA的构建过程如图1所示，具体过程如下从肝素黄杆菌(Flavabacterium heparinum)(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因，所用的上下游引物分别为5′GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC3′(带下划线的碱基为BamHI的酶识别位点)，5′CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3′(带下划线的碱基为HindIII酶识别位点)，分别引入BamHI和HindIII酶识别位点。
PCR扩增的反应体系为50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200μmol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为95摄氏度变性5分钟，50-60(51、53、55、57或59℃)摄氏度引物退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。
该PCR结果如图2所示，表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。测序表明，该片段具有自序列表中序列2的自5′端第1180-2271位核苷酸序列。图2中，泳道2-6分别为引物退火温度为51、53、55、57或59℃扩增结果，泳道1为分子量marker(条带大小依次为15kb、10kb、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、750bp)，箭头所指处为1.1kb目标片段。
将上述得到的PCR产物用BamHI和HindIII双酶切后，分别插入到pMal-p2x或pMal-c2x载体(购自NEB公司)的BamHI和HindIII酶识别位点之间，得到pMa1-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体，将pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体分别转化大肠杆菌JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC3’和5’CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，通过菌落PCR筛选转化子，提取可得到1.1kb PCR产物的转化子中的pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体，分别通过BamHI和HindIII双酶切验证。将通过BamHI和HindIII双酶切得到1.1kb片段的质粒进行测序，将具有序列表中序列2的自5′端第1180-2271位所示的肝素酶I基因片段的pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体命名为pMal-hepA。在pMal-hepA中，hepA基因与lacZ α基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA，表达了MBP-hepA融合蛋白后，能够有效地终止蛋白翻译不会表达lacZα蛋白。
2、表达MBP-HepA的工程菌的构建 将上述验证过的pMal-hepA转化大肠杆菌TB1(购自NEB公司)，得到重组工程菌，将重组工程菌提取质粒，进行酶切和测序鉴定，将鉴定结果表明正确的转入了pMal-hepA的重组工程菌命名为TB1/pMal-hepA。
二、麦芽糖结合蛋白-肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)的诱导表达 1、麦芽糖结合蛋白-肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)的诱导表达 从平板中挑取TB1/pMal-hepA菌落于5mL LB培养基中，37℃隔夜培养(12～14h)，然后按体积百分含量为1％的接种量接入含氨苄青霉素Amp(终浓度为100μg/mL)的100mL LB培养基中，37℃培养3小时(即菌株培养至对数生长期)，加入1mM IPTG，于15℃，200rpm进行诱导培养21小时，得到的培养液在4℃，10000rpm离心10min，收集菌体。
将上述收集得到的TB1/pMal-hepA菌体用pH为7.4、含0.2M NaCl的0.017mol/L Tris缓冲液洗涤菌体2次，按每2ml菌液离心得到的菌体加入1ml Tris缓冲液的比例，将菌体悬浮在pH为7.4、含0.2M NaCl的0.017mol/L Tris缓冲液中，在冰浴中超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)。细胞破碎液在4℃，13000rpm离心30min，取上清液得无细胞麦芽糖结合蛋白-肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)粗酶液。
2、MBP-HepA粗提酶液活力的测量 粗提酶液的酶活力的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30℃每分钟产生1μmol不饱和键的反应效力。肝素底物溶液的配置将2.5g的商品肝素(购于河北常山生化药业股份有限公司)溶于100ml pH 7.4的Tris缓冲液(17mMTris，44mM NaCl，3.5mM CaCl2)中，得到肝素浓度为25g/L的肝素底物溶液。
取肝素底物溶液0.5ml，加入步骤二的步骤1中所得的粗酶液，其它体积以Tris缓冲液补充，最终的反应液体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA232。消光系数ε＝3800M-1。测定结果表明上述提取得到的粗酶液的活力为4000IU/L粗酶液。
实施例2、生产超低分子量肝素及其检测 一、生产超低分子量肝素 1、本发明超低分子量肝素的生产的装置 麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产超低分子量肝素的反应装置如图4所示，包括带搅拌器的反应器1、超滤装置2和储液罐3；其中。超滤装置2为错流式超滤膜(回流液流向与滤液流向正交)，包括超滤膜4、回流液出口5、滤液出口7、反应液入口8。反应器1的反应液出口通过泵与超滤装置2的反应液入口8连接，超滤装置2的回流液出口5与反应器1连接，超滤装置2的滤液出口7与储液罐3连接。除上面的主要装置外，还包括一个孔径为0.2微米的纤维素膜真空初滤装置。纤维素膜真空初滤装置中所用纤维素膜购自上海兴亚净化材料厂，直径为50毫米。所用容器为250mL玻璃质锥形瓶。所用真空泵为隔膜式真空泵，购自日本爱发科(ULVAC)公司，型号为DTC-21。
本实施例中超滤装置2购自美国密理博(Millipore)公司，型号为Biomax 5，其中，超滤膜4的截留分子量为5000道尔顿。反应器1为150mL带夹层的玻璃瓶，内层直径为4.8cm，外层直径为7.8cm，高度为10.5cm，搅拌器直径为2.0cm；储液罐3为100mL玻璃质锥形瓶。
上述反应器工作时，底物和酶在反应器1中反应完毕后，用孔径为0.2微米的纤维素膜真空初滤装置进行初滤，之后将初滤液转移回反应器1，通过泵泵入超滤装置2中反应液入口8，沿着超滤膜4包围的空间向上流动至回流液出口5回流过滤，回流液通过回流液出口5流回反应器1中继续被泵入超滤装置2中反应液入口8不断循环回流过滤，此过程中，部分分子和液体通过超滤膜4滤出，通过超滤液通过滤液出口7进入储液罐3中，储液罐3得到的液体即为超滤液。
2、超低分子量肝素的生产 以商品肝素(商品肝素也即肝素钠)(购于河北常山生化药业股份有限公司)为原料，将商品肝素加入到50mL含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的超纯水溶液中，然后用1M HCl溶液调节pH至7.0，配成肝素的浓度为50g/L的溶液，即得到肝素溶液。
将分别将4份50mL的上述制备的肝素溶液分别置于本实施例中步骤一的步骤1的反应装置的反应器1中，加热至30℃恒温，分别加入1mL实施例1得到的酶活为4000IU/L的粗酶液进行反应(麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量是(1ml*4000IU/L)/(50ml*50g/L)＝1.6IU/g肝素)，随着反应的进行，肝素逐渐被降解，生成的4，5-不饱和糖苷键增多，在235nm下的吸光度不断增加，每隔一段时间监测反应液的A235(检测结果如图3所示)，图3表明，反应初期反应液的A235随时间的增加而增加，二者呈直线性关系，反应后期随着时间的增加A235渐渐趋于恒定。其中A235为210.3时，反应了9小时；其中A235为230.2时，反应了14小时；其中A235为250.1时，反应了19小时；其中A235为270.1时，反应了24小时。
分别将这些组反应液在不同的A235(具体如表1所示)加盐酸调节pH值至2.0终止反应后，用孔径为0.2微米的纤维膜进行初滤后得到不同的A235时终止反应的反应液的初滤液，然后将反应液泵入上述反应装置的超滤装置2中用超滤膜(截留分子量为5000道尔顿)对初滤液过滤后得到不同的A235时终止反应的反应液的次滤液。分别往各组次滤液中加入2.5倍体积的乙醇混合均匀后，离心弃上清收集沉淀，然后将沉淀中分别加入丙酮洗涤减压蒸干即得到不同的A235时终止反应得到的超低分子量肝素产品粉末。
二、产品检测 将实施例2中步骤一得到的肝素产品粉末取20mg，溶于2ml的水中，制成浓度为10mg/mL的待测样品溶液。
产品平均分子量及其分布检测方法如下 待测样品溶液采用高效排阻色谱法来测定其平均分子量及其分布(Ahsan A，Jeske W，Mardiguian J，J.Pharm.Sci.1994，83197-201)。采用的凝胶色谱柱为TSK-Gel G3000SW，所用的缓冲液为pH 5.0，含质量百分含量2.84％的Na2SO4缓冲液。具体操作过程如下 使用岛津色谱仪(LC-10A)，色谱柱的出口接紫外检测器，紫外检测器出口接示差折光检测器。柱温35℃，流速0.5mL/min，检测波长为235nm。取低分子量肝素标准品(10mg/mL，流动相配制)25μL进样，同时记录两检测器色谱图，精确测出样品到达两检测器的时间差，将两色谱图时间对准得到色谱柱的校正曲线，校正中用的保留时间以示差折光检测器的保留时间为准。按以下公式计算 其中∑RI和∑UV234分别为示差折光检测器色谱图中有效峰的总面积和紫外检测器色谱图中有效峰的总面积。Mna为的数均分子量3700(EPCRS)；RIi和UV234i分别为i时间点两检测器色谱图的峰高，Mi为i时间点的分子量。
均匀选择5-7个Mi与对应的停留时间(Rti)作线性回归，得到分子量对数值与保留时间的线性方程，即获得色谱柱的标准曲线，要确保相关系数r＞0.99。
然后将待测样品溶液25μL进样，记录示差折光检测器色谱图，按下列式子计算样品的重均分子量Mw、数均分子量Mn及其分子量分布D 结果如表1所示，当A235处于210-270时，能够得到符合分子量要求的超低分子量肝素产品，表明融合肝素酶I能够有效的用于超低分子量肝素的清洁生产，并且在A235处于210-270时，得到超低分子量肝素的分布系数也较小，说明在此范围内可以得到分子量分布范围窄的超低分子量肝素。其中，吸光度A235为270.1时终止反应进行过滤纯化处理所得到的超低分子量肝素产品照片如图5所示。
表1不同A235时终止反应所得uLMWH产品参数比较
序列表
<110>清华大学
<120>一种制备超低分子量肝素的方法
<130>CGGNARL92531
<160>2
<210>1
<211>756
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn
385 390 395 400
Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala
405 410 415
Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala
420 425 430
Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg
435 440 445
Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly
450 455 460
Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn
465 470 475 480
Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu
485 490 495
Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser
500 505 510
Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn
515 520 525
Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu
530 535 540
Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe
545 550 555 560
Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp
565 570 575
Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly
580 585 590
Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala
595 600 605
Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg
610 615 620
Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn
625 630 635 640
Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile
645 650 655
Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr
660 665 670
Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr
675 680 685
Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn
690 695 700
Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile
705 710 715 720
Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg
725 730 735
Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser
740 745 750
Glu Thr Ala Arg
755
<210>2
<211>2271
<212>DNA
<213>肝素黄杆菌(Flavabacterium heparinum)
<400>2
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac300
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gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1140
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tatgctgcag gagaaacaaa gggccgtaca gaattgtcgt acagctatgc aaccaccaat1440
gattttaaga aatttccccc aagcgtatac caaaatgcgc aaaagctaaa aaccgtttat1500
cattacggca aagggatttg tgaacagggg agctcccgca gctatacctt ttcagtgtac1560
ataccctcct ccttccccga caatgcgact actatttttg cccaatggca tggtgcaccc1620
agcagaacgc ttgtagctac accagaggga gaaattaaaa cactgagcat agaagagttt1680
ttggccttat acgaccgcat gatcttcaaa aaaaatatcg cccatgataa agttgaaaaa1740
aaagataagg acggaaaaat tacttatgta gccggaaagc caaatggctg gaaggtagaa1800
caaggtggtt atcccacgct ggcctttggt ttttctaaag ggtattttta catcaaggca1860
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ccctttgccc agttccctaa agattgctgg attacttttg atgtcgccat agactggacg2040
aaatatggaa aagaggccaa tacaattttg aaacccggta agctggatgt gatgatgact2100
tataccaaga ataagaaacc acaaaaagcg catatcgtaa accagcagga aatcctgatc2160
ggacgtaacg atgacgatgg ctattacttc aaatttggaa tttacagggt cggtaacagc2220
acggtcccgg ttacttataa cctgagcggg tacagcgaaa ctgccagatg a 227权利要求
1、一种制备超低分子量肝素的方法，是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到超低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID №1所示；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量是0.4-4.0IU/g肝素，优选是1.6IU/g肝素。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白按照以下方法制备将质粒pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白；
所述质粒pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述肝素来自肝素溶液，肝素在肝素溶液中的浓度为1-100g/L，优选是50g/L。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述肝素溶液是用如下方法配制的将0.05-5g的肝素加入到50ml含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的水中，然后用1M HCl溶液调节pH至7.0。
5、根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述降解的条件是温度10-45℃，时间9-24h。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述降解的条件是如下1)或2)或3)或4)或5)或6)
1)温度是25-35℃，时间是9-24h；
2)温度是30℃，时间是9-24h；
3)温度是30℃，时间是9h；
4)温度是30℃，时间是14h；
5)温度是30℃，时间是19h；
6)温度是30℃，时间是24h
7、根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述降解在当反应液在235nm下的吸光度为200-280时终止，优选是在吸光度为210-270时终止。
8、根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述降解终止是通过调节pH至2.0来实现的。
9、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述降解后还包括如下的纯化步骤
1)降解终止时的反应液经过孔径为0.2微米的纤维素膜过滤，得到初滤液；
2)将步骤1)得到的初滤液用截留分子量为3000-5000Da的超滤膜进行过滤，得到次滤液；
3)将步骤2)得到的次滤液与体积是次滤液体积2-3倍的乙醇混合，离心，收沉淀；
4)将步骤3)得到的沉淀用丙酮洗涤，减压蒸干，得到纯化的超低分子量肝素。
全文摘要
本发明公开了一种制备超低分子量肝素的方法。本发明提供的方法，是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解底物中的肝素，得到超低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中的SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量是0.4-4.0IU/g肝素，优选是1.6IU/g肝素。因此利用该融合蛋白生产的超低分子量肝素具有理想平均分子量且分子量分布范围窄，具有巨大的工业应用价值。
文档编号C12N9/96GK101671711SQ200910092339
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月10日 优先权日2009年9月10日
发明者邢新会, 叶逢春, 翀 张 申请人:清华大学